HEREDITAS (Beijing) 2008年10月, 30(10): 1249―1256 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 综 述
收稿日期:
2008?03?15; 修回日期: 2008?06?02
基金项目: 国家重点基础研究发展计划（973计划）项目“中国西部牧草、乡土草遗传及选育的基础研究”（编号：2007CB108907）四川省公
益性研究计划项目(编号：2008NG0013), 四川省应用基础研究计划项目(编号：2008JY0096), 四川省教育厅资助科研项目(编号： 07ZB065), 四川农业大学青年科技创新基金, 四川农业大学博士后基金资助[Supported by National Basic Research Program (973 program) of China(No.2007CB108907), Commonweal Research Program of Sichuan Provincial Science and Technology Department (No.2008NG0013), Applied Basic Research Program of Sichuan Provincial Science and Technology Department (No. 2008JY0096), the Project Supported by Scientific Research Fund of Sichuan Provincial Education Department (No. 07ZB065), Youth Innovation Project of Sichuan Agricultural University, Postdoctoral Project of Sichuan Agricultural University]
作者简介: 张素芝(1974?), 女, 博士, 研究方向：植物基因工程与作物遗传育种。E-mail: suzhi1026@https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 通讯作者: 荣廷昭(1936?), 男, 教授, 博士生导师, 研究方向：作物遗传育种。
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.01249
农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展
张素芝, 荣廷昭
四川农业大学 教育部作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室, 雅安625014
摘要: 农杆菌介导的遗传转化由于具有独特的优点, 一直受到育种家、分子生物学家和微生物学家的重视, 因此近10年发展很快。玉米是重要的粮食作物, 农杆菌介导的玉米遗传转化也取得了重大成就。文章就近年来玉米遗传转化取得的进展、影响转化的重要因素作一小结, 并就目前转化存在的问题和前景作简单的讨论。 关键词: 玉米; 遗传转化; 农杆菌
Advance of Agrobaterium -mediated genetic transformation system of maize (Zea mays L.)
ZHANG Su-Zhi, RONG Ting-Zhao
Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Improvement of Ministry of Education , Sichuan Agricultural University , Ya’an 625014, China
Abstract: The Agrobacterium -mediated transformation system is more and more attractive to scientists of microbiology, molecular biology and crop genetics and breeding due to its unique advantages, which promote its development rapidly in the past decade. Great success has been achieved in the Agrobacterium -mediated genetic transformation system in maize (Zea mays L.), an important food-supply crop. This article highlights the advances of Agrobacterium -mediated transforma-tion system of maize and the major factors of the transformation process. Then, comments on the problems remained and the prospects of this transformation system are made.
Keywords: maize; genetic transformation; Agrobacterium tumefaciens
玉米是当今世界重要的粮食作物之一, 也是重要的工业原料。1984年, 第一例转基因植物的获 得[1], 使得利用转基因方法进行玉米性状(如产量、品质、抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、抗盐、抗冻)改良和基因功能研究成为可能。农杆菌介导的遗传转化系统在双子叶植物中发展迅速, 但是由于单子
叶植物尤其是禾本科植物不是农杆菌的天然宿主, 最初的农杆菌遗传转化进展缓慢。随着人们对农杆
菌侵染机制的进一步了解和转化技术的不断改进完善, 农杆菌介导的遗传转化首先在水稻和玉米中取得了突破性进展 [2~4], 目前已建立了水稻、玉米、小麦等重要粮食作物高效的农杆菌转化系统。对玉米
1250 HEREDITAS (Beijing) 2008 第30卷
而言, 除农杆菌转化法以外, 还有多种转化方法也已成功的用于遗传转化, 如PEG 介导原生质体转化法、电激转化法、碳化硅晶须介导法、基因枪法。农杆菌转化法由于具有费用低、能转移大片段DNA 、外源基因拷贝数低并能稳定遗传等优点而备受青睐, 目前已成为玉米、水稻、小麦、大麦等禾本科植物常用的转化方法。本文就近年来玉米农杆菌遗传转化所取得主要成就和影响转化的主要因素作一小结, 并将存在的问题作简单的讨论。
1 农杆菌介导的遗传转化机理
农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌, 根据宿主范围和致病症状可分为5种[5], 其中研究最多也最透彻的是根癌农杆菌(Agrobacterium tu-mefaciens ), 它能将自身Tumor-inducing(Ti)质粒的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞中, 从而使植物损伤部位形成冠瘿瘤[6]。
T-DNA 的转化是在Ti 质粒上Vir 区一系列Vir 基因的作用下产生的。T- DNA 是质粒上一段10~30 kb 的序列, 编码5个与致瘤有关的生长素和细胞分裂素合成酶基因。T- DNA 左右边界各有一段高度保守的25 bp 的同向重叠序列(Direct repeat)与T-DNA 的转化有关。其中右边界是
VirD2的共价结合序列及VirD1/VirD2内切的靶序列, VirD2与右边界的共价结合及邻近右边界的过度驱动(Overdrive)序列导致了单链T-DNA 由右边界剪切并转移的极性[5], 而VirD2与左边界的结合可能导致了载体骨架序列的转移[7]。
农杆菌侵染时, 在单糖转运蛋白ChvE 的配合下, 双元组分系统的VirA 作为感受信号的天线分子受到植物伤口产生的酚类物质和糖类的诱导而自动磷酸化, 并且随后使双元组分系统的另一组分VirG 磷酸化为活性状态, 进而通过vir-box 激活其他Vir 基因的表达, 最后由VirD1/VirD2剪切的单链VirD2-T-DNA 复合体由VirB 和 VirD4蛋白组装成的Type IV Secretion System(T4SS)运送到宿主细胞, 另外的几个Vir 蛋白VirE2、VirE3、VirF 、VirD5也同时通过这个通道运送到宿主细胞质中[8]。VirD2-T-DNA 复合体在进入宿主细胞质中不久, VirE2就结合上去, 通过VirD2核定位信号的引导并在几个宿主蛋白和农杆菌因子的协助下向细胞核转运, 最后结合在T-DNA 上的蛋白被降解, 而T-DNA 通过一种尚不清楚的机制整合到宿主基因组中[9,10] (图1)。由于T-DNA 转化不具有序列特异性, 因此可用任何感兴趣的基因能代替内源的T-DNA 基因进行转化[11]。
图1 T-DNA 的加工、转运和整合的途径(修改自Rossi et al.[12])
Fig. 1 The passage of T-DNA processing, transfer, and integration (Revised from Rossi et al .[12])
2 玉米遗传转化的发展过程
1987年, Grimsley 等[13]首先用胭脂碱农杆菌C58将玉米条纹病毒(Maize Streak Virus)的cDNA 转化玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位, 98%的玉米叶片表现了病毒感染性状, 说明T-DNA 已经转化
到玉米细胞中, 从而给农杆菌介导的玉米遗传转化 带来了一缕曙光。Schalappi 等[14]用同样的方法感染A188、W23等玉米幼胚, 经过扫描镜观察也得到了类似的结果。1994年, Shen 等[15]用GUS 作报告基因用农杆菌转化3个玉米自交系GB 、A188、K55的
第10期张素芝等: 农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展 1251
芽尖, 共培养3 d后发现GUS主要在胚芽鞘和幼叶部位表达。这些实验中虽然外源基因已在植物细胞中表达, 但并不能说明外源基因已整合到玉米基因组中。Gould[16]用含有普通双元载体的农杆菌侵染玉米 Funk's G90的茎尖获得了转基因玉米, 并且外源基因已整合并遗传到R1代, 但其稳定性效果欠佳。农杆菌侵染单子叶植物的第一个比较成功的例子来自于Chan和Hiei的研究, 他们首次用农杆菌转化水稻的未成熟胚获得了外源基因能稳定遗传的转基因水稻[2,3]。农杆菌介导的玉米遗传转化随后也取得了重大进展。1996年, Ishida等[4]用含有A281(对高等植物侵染力很强的菌株)VirB、VirC、VirG基因的超双元载体pSB131和pTOK233 转化A188及其杂交种的未成熟胚, 转化频率高达5%~30%。同时外源基因能稳定整合和表达, 并且70%的转基因玉米可育。这个实验有力地说明农杆菌对单子叶植物和双子叶植物具有相同的转化机制, 是玉米遗传转化过程中的一个里程碑。其后用超双元载体分别转化A188和 Hi II也得到类似的结果[17~20]。此后玉米农杆菌转化的研究主要以优化转化条件, 提高转化效率为主。其中最值得关注的是Frame等[21]用普通双元载体pTF102转化Hi II的未成熟胚, 在L-半胱氨酸存在的条件下平均转化效率高达 5.5%, Southern blot和分子鉴定R0、R1、R2代转基因玉米表明GUS 和选择标记基因bar已稳定整合到玉米基因组中并表达。虽然普通双元载体的转化效率(5.5%)[21]远远低于超双元载体的转化效率(33%~51%)[20], 但普通双元载体的普遍应用使得用这种载体进行农杆菌转化具有更大的潜力。农杆菌与外植体共培养条件的优化、提高Vir基因表达条件的优化和使用毒性更低的标记基因将会是提高玉米农杆菌普通双元载体转化效率的重点。外植体取材的季节限制也一直是玉米遗传转化的限制因素, 让人高兴的是这种局限性正在逐渐减少。最近, Sidorov等[22]用农杆菌介导法对7~10 d玉米幼苗诱导的I型愈伤进行转化, 转化频率为2%~10%。同时由于这些转基因后代拷贝数低并符合孟德尔遗传规律, 因此这种方法可以代替未成熟胚诱导愈伤组织进行转化。Wang等[23]用农杆菌转化受伤的玉米籽粒也获得了较理想的转化频率, 由于这种方法受体材料取材简单方便, 因此也是一种很有希望的方法。Vega 等尝试用低盐的N6培养基配合使用二硫苏糖醇和L-半胱氨酸转化Hi II玉米，发现能比较显著的提高普通双元表达载体的转化频率，平均转化频率最高达到18%[24]。
国内对农杆菌介导的玉米遗传转化起步较晚, 黄璐和卫志明[25]首次报道用农杆菌转化法获得了杂交种苏玉1号的转基因玉米, 张荣等[26]用此方法获得自交系P9-10的转基因玉米。权瑞党等报道将农杆菌侵染和真空渗入、部分酶解及超声波处理等方法相结合, 转化玉米愈伤组织得到了转基因植株[27]。近年来, Huang等[28]报道用菌株EHA105介导玉米优良自交系幼胚转化, 得到了比较理想的结果, 转化效率平均达到23.8%。Yan等[29]通过嘌呤、嘧啶抑制剂和表面活性剂Silwet L-77处理提高了农杆菌对掖515和齐319的转化频率。
3影响农杆菌转化的因素
3.1农杆菌菌株及载体
农杆菌菌株的侵染能力在不同玉米自交系之间的差异很大, 因而在实际的遗传转化过程中, 不同的玉米自交系都对应存在最为敏感的农杆菌菌株[27]。遗传转化中常用的农杆菌菌株有3种类型: 胭脂碱型(以C58菌株为代表)、章鱼碱型(以LBA4404菌株为代表)和琥珀碱型(以EH101、EHA105菌株为代表), 菌株选择的合适与否直接影响了最终的转化效率。玉米遗传转化常用的菌株为LB4404、EHA101和C58(表1)。另外, 菌株和载体的组合对转化至关重要, 其中超双元载体pSB131和pTOK233一般用LB4404进行转化[4,18, 20]。Hiei 等[30]的实验表明, 菌株和载体搭配不合适如超强菌株和超双元载体组合的转化效率比普通农杆菌与双元载体组合的效率还要低。
3.2 Vir基因的活化
植物受到损伤后从伤口分泌的酚类物质能诱导农杆菌Vir基因的表达, 从而使T-DNA进行转移和整合。单子叶植物由于不分泌酚类物质或酚类物质含量低而不能诱导Vir基因的活化[35], 因此可以通过添加酚类物质对单子叶植物进行转化。目前已发现多种能诱导Vir基因表达的酚类物质, 其中乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮作用较强, 被广泛应用于玉米、水稻等禾谷类作物的基因转化中, 而100 μm 乙酰丁香酮在很多玉米转化实验中都能较强的诱导Vir基因的表达。
此外, 通过遗传改造或分离突变菌株, 使其能
表1农杆菌介导的玉米遗传转化
1252 HEREDITAS
(Beijing)2008第30卷Table 1 Agrobacterium-mediated genetic transformation in maize
基因型Genotype 外植体
Explant
菌株/基因
Stain /gene
注解
Annotation
文献
References
Golden×Bantam 幼苗分生组织
Seedling meristem
C58/MSV
系统感染
Systemtic infection
[13]
Funk's G90 芽尖
Shoot meristem
C58/p35S:gus-nptⅡ转基因植株
Transgenic plants
[16]
A188 芽尖
Shoot meristem
C58、Ach5、LBA4404/GUS瞬时表达
Transient expression
[30]
Golden×Bantam 幼苗
Seedling
C58/MSV-GUS
稳定表达
Stable expression
[15]
A188及其杂交种A188 and its hybrid 幼胚
Immature embryo
LBA4404/35S:gus-p35S: bar
转基因植株
Transgenic plants
[4]
苏玉1号、掖单9号和农大60 Suyu 1,Yedan 9, and Nongda 60 愈伤组织
Callus
EHA101/35S:GUS- p35S: hpt
转基因植株
Transgenic plants
[25]
A188、综3、综31和P9-10
A188, Zong 3, Zong 31, and P9-10 幼胚
Immature embryo
LBA4404/ 35S:GUS- 35S: hpt
转基因植株
Transgenic plants
[26]
Hi II 幼胚
Immature embryo
LBA4404/35S: GUS
转基因植株
Transgenic plants
[21]
Hi II 幼胚
Immature embryo
LBA4404/UBI: GUS
转基因植株
Transgenic plants
[32]
A188, Hi II, A188×Hi II 幼胚
Immature embryo
LBA4404/ UBI: PPO
转基因植株
Transgenic plants
[33]
掖515和掖502 Ye515 andYe502 愈伤组织
Callus
LBA4404/35S:bet-35S: hpt
转基因植株
Transgenic plants
[27]
9046等9046 etc. 幼胚
Immature embryo
EHA105/35S:gus-p35S: bar
转基因植株
Transgenic plants
[28]
H99等H99 etc. 愈伤组织
Callus
C58/P-e35S:OsAct1intronGFP,
P-e35S: OsAct1intronGFP
转基因植株
Transgenic plants
[22]
注: 部分内容摘自文献[34]。
Note: Parts of the table content are cited from reference [34]。
不依赖创伤诱导物的存在就能诱导Vir基因高水平或组成型表达, 进而促进T-DNA转移也是提高农杆菌转化效率的有效途径。Gubba等[36]在C58菌株和LBA4404菌株中分别引入virGN54D突变和virGI106L突变后, Vir基因高水平表达, 能将农杆菌对玉米的瞬时感染率分别从36%~40%提高到78%~83%和从0%~15%提高到70%~77%。农杆株中质粒为高拷贝类型时能显著提高virGN54D的转化效果。多个拷贝的virG能促进Vir基因活化, 并能改变诱导Vir基因表达的pH值特性(中性或酸性), 这种多拷贝的virG菌株提高了水稻、芹菜胡萝卜的转化效率[37]。玉米农杆菌转化效率低的原因还与其嫩芽分泌的一种毒性阻遏物质2,4-dihydroxy-7- methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one (DIMBOA)有关, DIMBOA能抑制农杆菌的生长并对Vir基因活化有抑制作用。用对DIMBOA具有拮抗作用的菌株K289和Chry9转化玉米FRB73顶端分生组织, GUS 的瞬时表达率提高到21%~34% [38]。
另外, 在共转化其间还有许多因素与Vir基因的表达有关, 这些因素包括: 酸性pH值、低温培养、高渗透压等。一些小分子量的糖类如半乳糖、葡萄糖等也能诱导Vir基因的表达, 当酚类物质的水平较低时, 糖类诱导Vir基因表达的效果更明显, 这些研究结果通过Hiei等的GUS瞬时表达系统得到了进一步证实[3]。
除上述外部因素以外, 农杆菌自身某些基因的表达状况也与Vir基因的活化有关。章鱼碱型的virH(pinF)能减少农杆菌对玉米细胞壁的附着, 从而阻碍了MSV基因的转移[39]。此外, 通过正向遗传学的方法还发现了一些T-DNA 转移必需的基因: 如pscAa/exoC、chvA、chvB基因与胞外多糖的产生、修饰、分泌有关; att基因则与农杆菌与植物细胞壁的附着有关; chvD能调节Vir基因的诱导; chvE在转运糖类的同时协助诱导Vir基因的表达[4]。
第10期张素芝等: 农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展 1253
3.3受体材料、生长状况及基因型对遗传转化的
影响
不同来源、不同发育状态和不同基因型的玉米受体材料对农杆菌的敏感性虽然不尽相同, 但保持旺盛的细胞分裂和DNA复制是T-DNA整合所必需的[21]。可以用农杆菌进行玉米转化的受体材料有多种, 如幼胚、成熟胚、I型愈伤组织、II型愈伤组织、悬浮细胞系、原生质体、茎尖等。用愈伤组织和幼胚进行转化操作简单, 植株再生比较容易, 是玉米转化中最常用的受体材料(表1)。玉米幼胚的再生能力明显高于其他部位, 其发育阶段是影响再生的重要因素。对玉米幼胚而言, 授粉后10~15 d, 幼胚长度为1.0~2.0 mm时, 再生能力最强, 是理想的受体材料[40]。Schalappi等[13]通过农杆菌对玉米幼胚亲和性的研究, 证明感受态的细胞是农杆菌转化所必需的, 只有那些再生和整合能力强的感受态细胞才能得到转化植株。玉米幼胚未分化的顶端分生组织不具备适合农杆菌侵染的感受态, 只有分化出1~2个叶原基的幼胚才适合农杆菌侵染[13]。胚性愈伤组织有I和II两种类型[41], 主要由幼胚诱导获得。大多数玉米自交系能形成致密的I型愈伤组织, 这种愈伤组织胚性差, 继代后较难再生出植株; 松脆的II 型愈伤组织生长迅速, 可以长期继代并保持胚性。尽管玉米II型愈伤组织的诱导受基因型限制大, 但是由于其愈伤组织比较容易获得, 再生能力较强, 获得转化植株的周期相对较短, 仍是目前应用最广泛的受体材料之一[42]。
限制玉米农杆菌转化的很重要的另一个因素是基因型。Wang等[43]用GUS和GFP瞬时表达系统筛选了玉米的70个自交系, 发现10自交系容易被农杆菌侵染, 且这些自交系对农杆菌不同株系的敏感性不同。Ishida等[4]发现不同基因型之间转化效率差异显著, 最低为0, 最高为30%。许多实验表明大多数基因型的玉米细胞表面因缺乏感受态的细胞和可供农杆菌识别并与之附着的位点而不易转化。国外用于玉米转化的材料最常见为A188 、Hi II(来自于A188)自交系及其杂交种。国内掖478、太9101, 综31、齐319和我所选育的R18-599 及其杂交种也是很优良的玉米转化材料[24, 26]。但是很多玉米骨干自交系由于基因型的限制不能用农杆菌方法进行转化, 这极大的限制了育种上对玉米品种改造要求, 因此通过调整影响转化的主要因子, 优化培养条件, 或通过正、反向遗传学和基因组学的方法筛选植物中与农杆菌T-NDA转化有关的蛋白, 然后对骨干自交系进行遗传改造将是提高玉米转化效率的可行途径。Huang等[28]用EH105菌株通过优化共培养条件, 将5个的玉米骨干自交系的转化效率提高到2.35%~ 5.26%。Nam等[44]和Gelvin 研究小组[5]分别用根转化的办法筛选出拟南芥对农杆菌转化不敏感的一系列突变体(rat)。这些突变体的野生型蛋白产物与农杆菌附着、细胞壁的结构、T-DNA向核内运输有关。其中rat5是组蛋白H2A基因HTA1突变引起, RAT5的表达与农杆菌侵染的敏感性高度相关, 并且过量表达RAT5能有效提高农杆菌的敏感性和难以转化的拟南芥的转化效率, 因此过量表达HTA1可以作为提高难转化品种转化效率的有效手段[4]。从反向遗传学的角度出发, VirB、VirD2、VirE2、VirF及其它几个Vir蛋白都可能与植物蛋白相互作用, 因此可通过酵母双杂交的方法进行筛选。目前已在拟南芥中发现了几个与VirD2相互作用的蛋白AtKAP (Importin-α)、细胞亲环素(分子伴侣)、2C型蛋白磷酸化酶, 与VirE2 能相互作用的VIP1(Rab GTP酶)和VIP2, 与F-box 蛋白VirF相互作用的Skp1(与Vir蛋白降解有关)及几个与VirB2作用的蛋白[5], 通过生化方法和过量或抑制表达的方法都说明这些蛋白可能与T-DNA向植物细胞核的运输有关, 因此可通过过量表达或诱导表达的方式合理的利用这些基因来提高植物的农杆菌转化效率。
3.4培养基成分
农杆菌介导的玉米遗传转化大致可以分为侵染、共培养、恢复培养、筛选培养和植株再生等几个过程。在农杆菌介导的玉米遗传转化研究历程中, 因外植体不同使用的基本培养基也不同。农杆菌介导的遗传转化主要以幼胚和胚性愈伤为受体材料, 使用的基本培养基主要是N6或MS, 或者在此基础上略加改进(表2)。
除基本培养基外, 根据农杆菌转化的机制, 一般还在培养基中加一些特殊组分来提高农杆菌的附着能力、Vir基因的活性和受体材料的感受态。其中乙酰丁香酮、AgNO3[30]、L-半胱氨酸[21]、硫醇类物质[45]都能比较显著的提高玉米的转化效率。
3.5选择性标记基因
除了有效的遗传转化以外, 高效的选择标记系统也是农杆菌转化所必须的。玉米遗传转化常用的选择标记基因主要有新霉素磷酸转移酶基因
1254 HEREDITAS
(Beijing)2008第30卷
表2农杆菌介导的玉米遗传转化中基本培养基的使用
情况
Table 2 Application of the basic medium in Agrobacterium-
mediated maize transformation
基本培养基Basic medium 外植体
Explant
文献
Reference
MS 芽尖
Shoot meristem
[31]
MS 愈伤组织
Callus [25] [25]
N6幼胚
Imature embryo [26] [26]
MS 愈伤组织
Callus [27] [27]
CHU盐(在N6基础上改进) CHU salt (improved from N6)
幼胚
Imature embryo
[18]
N6盐N6 salt
幼胚
Imature embryo
[21]
LS盐(同MS盐)
LS salt ( the same as MS salt)
幼胚
Imature embryo
[4,29]
N6盐N6 salt
幼胚
Imature embryo
[46,47]
N6盐＋B5维生素N6 salt + B5 vitamin
幼胚
Imature embryo
[28]
MS盐MS salt 幼苗节段Ⅰ型
愈伤组织
Nodal sections
type I callus
[22]
MS盐MS salt
幼胚
Imature embryo
[48]
Low-salt medium Imature embryo [49] npt(
Ⅱ卡那霉素、G418及新霉素抗性)、潮霉素磷酸转移酶基因hpt(潮霉素B抗性)、修饰的草丁膦乙酸转移酶pat(草丁膦和双丙氨膦的抗性)、草丁膦乙酸转移酶bar(双丙氨膦抗性)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因epsps(草甘膦抗性)。通常用bar和pat 作为标记基因进行玉米胚性愈伤组织转化的筛选比用nptⅡ效果更明显[50]。以上通过抗生素或除草剂杀死未转化细胞进行筛选的系统都属于负向选择系统。在这种选择系统中, 虽然阳性转基因株具有抵抗筛选剂的能力, 但是标记基因的产物在一定程度上还是对阳性转基因株有一定的毒性, 因此目前人们更倾向于使用转化频率更高的正向筛选系统: 即标记基因产物通过促进特殊底物的代谢使阳性转基因株“脱颖而出”, 从而达到筛选的目的[51]。目前, 磷酸甘露糖异构酶mpi基因(甘露糖抗性)已用于玉米的正向选择系统[18]。另外, 还需要开发新的选择标记以适应多基因转化的转基因后代和高通量筛选的需要, 原卟啉原氧化酶基因ppo(英拜除草剂抗性)也许是能满足此要求的标记基因[33]。
除以上几个主要的影响因素以外, 还有一些因素也影响转化农杆菌转化的效率。如农杆菌的生长状态、菌液浓度、侵染方式、共培养时间和温度、pH值、超声波、表面活性剂Silwet L-77等。各种影响因素的综合和优化将有助于提高玉米的转化效率。
4前景和展望
植物基因工程自诞生以来, 已使人类的农业生产史发生了巨大的变化, 也使传统的农业种植格局不断受到挑战。据国际农业生物技术获取与应用协会(ISAAA)的报导, 至2005年在全球21个国家转基因植物推广应用总面积达到9 000万公顷, 累计种植面积已达4.746亿公顷(合71.19亿亩), 相当于我国耕地面积的3.75倍。转基因玉米是商品化最早、种植面积最大的转基因作物之一, 其遗传转化的研究一直备受关注。近十几年来, 农杆菌介导的玉米的遗传转化虽然取得了巨大的成就, 但是还存在很多问题亟待解决。例如具有综合农艺性状的骨干自交系的转化受到基因型的限制、优良受体材料的取材受到季节限制, 另外, 还存在基因沉默、转化的稳定性、载体框架的转移、转基因玉米的安全性等问题。通过VIP1、HTA1等与农杆菌相互作用蛋白的基因的过量或抑制表达对骨干自交系进行遗传改造、发展成熟胚作受体材料[28]、使用可去除的选择标记系统或双T转化系统[52]和正向选择系统将有助于这些问题的解决。
玉米遗传工程的发展, 使得玉米已不再局限于作为粮食作物, 利用玉米作为植物反应器生产高新生物技术产品已成为现实。随着比较基因组学的发展和玉米基因组测序的逐渐完成、新功能基因的分离、克隆和各种农作物高效表达技术平台的逐步建立, 国外发达国家, 尤其是美国已利用玉米植物生物反应器这种“分子农业”的方法成功地生产出多种高新生物技术产品, 并从这些产品生产中获得巨大的经济效益[53]。国内许多科技工作者也正从事这方面的研究。玉米生物反应器这种“分子农业”的出现及普及同样将会对我国现有的农作物种植结构产生显著影响, 对增强我国农产品的竞争能力、极大的提高农民的收入以及维护农业的可持续发展具有重要意义。而玉米植物反应器的发展和完善正是建立在高效的遗传转化基础之上, 因此玉米遗传转化的研究任重而道远。
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农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥
中国稻米 专论与综述 2007年第3期 农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用 摘要:农杆菌作为一种天然的遗传转化系统,在水稻基因工程中倍受重视。本文概述了农杆菌介导转化水稻的原理、影响因素、遗传改良上的应用及存在的问题。 关键词:农杆菌转化系统;原理;影响因素;遗传改良 (1湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙410128;2湖南农业大学水稻基因组学实验室,湖南长沙410128; 3 美国俄亥俄州立大学植物生理实验室,美国俄亥俄州43210) 潘素君 1,2 戴良英 1,2 刘雄伦 2 王国梁 2,3 收稿日期:2007-01-18 水稻是全世界最重要的粮食作物之一,其栽培面积和总产量仅次于小麦。水稻不仅作为食品支持26亿人的生命,还是禾谷类作物中开展分子生物学研究的“模式植物”。随着分子生物学和分子遗传理论的迅速发展,利用遗传工程手段,有目的地将外源基因或DNA 构建导入水稻基因组,通过外源基因的直接表达,或通过内源基因表达的调控,获得抗病、抗虫、抗逆、高产优质的优良品种已成为水稻育种的重要手段。农杆菌介导法因其简单易行、转化率高、可导入较为完整的基因、整合位点稳定、拷贝数低、外源基因表达比较稳定而在水稻的遗传转化中得到广泛应用。 1农杆菌介导的遗传转化原理 农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统,转化植物细胞的农杆菌有两类,即根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌所含质粒是T i 质粒,发根农杆菌所含质粒是Ri 质粒。在水稻转化中,常用的是T i 质粒。 T i 质粒上含有可转移DNA (T-DNA )区、结合区(C on )、 复制起始区(Ori )和毒性区(V ir )。其中与冠瘿瘤生成有关的是V ir 区和T-DNA 区。T-DNA 区左右边界各有 25b p 的重复序列,左边界缺失仍可致瘤,而右边界缺 失则不能致瘤。两个边界之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。V ir 区为30b p ,V irA 、 V irB 、V irC 、V irD 、V irE 、V irG 、V irH 等七个操纵子24个基 因起共调控作用。当植物受到伤害时,将分泌一些酚类化合物,这些酚类化合物一方面通过染色体基因的介导促使农杆菌向植物受伤的部位移动并附着于植物细胞表面。另一方面V irA 作为受体蛋白接受酚类诱导物,自身磷酸化并激活V irG 蛋白,V irG 蛋白是一种 DNA 转录活化因子,被激活后可以特异性结合到其它V ir 基因启动子区上游的V ir 盒(V ir box )的序列,启动 这些基因的转录。 V irD1和V irD2共同作用,由T-DNA 右边界开始 向左边界切割产生一条T-DNA 链(T-链),T-链5′末端与V irD2结合,其余部分与V irE2结合,组成T-复合体。T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上由V irB 蛋白组成的通道进入到植物细胞内。V irD2和V irE2上的核定位信号(N LS )被转运蛋白识别,经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内,转入细胞核的 T-DNA 以单拷贝或多拷贝的形式整合到植物染色体 上。 2农杆菌介导转化水稻的影响因素 2.1 菌株和载体 选取合适的农杆菌菌株和高效的载体系统对转化 至关重要。目前,用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AG L1。 H iei [1] 等用菌株LBA4404、EHA101与载体p IG 121Hm 、 p T OK 233做试验,发现在T sukinohikari 培养基中 LBA4404(p T OK 233)比LBA4404(p IG 121Hm )和EHA101(p IG 121Hm )介导转化效果要好,在K oshihikari 培养基 中LBA4404(p l G 121Hm )最有效,EHA101(p T OK 233)对水稻的转化频率最低。LBA4404(p T OK 233)对爪哇稻转化频率较高。比较LBA4404、EHA105、AG L1这三种农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力,EHA105的转化效果最好,LBA4404次之,AG L -1最差[2,3] 。李双成 [4] 将 EHA105和AG L1的菌液按体积2∶1混合用于共转化, 表明两者对转化具有协同作用。 2.2 转化受体 在外植体的选择上,Sm ith 和H ood [5]认为,用农杆 菌转化单子叶植物,应选择处于适宜生理状态的那些组织,其特点是:能够产生vir 基因活化分子;内源激素 ?10?
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 一、目的要求 通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。 二、基本原理 农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。 三、材料及方法 1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 2.植物幼苗。 （一）细菌培养液直接浸染法 操作︰ （1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。 （2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。 （3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。 取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS； （4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 （5）共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十 IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
农杆菌介导转化法的概述 自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1] 目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 1 关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： 1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个
农杆菌介导转基因的原理？ 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但
农杆菌介导转化法的概 述 集团公司文件内部编码：（TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-
学年第学期 2014级硕士生生物化学期末论文任课老师： 开课学院： 课程名称： 学院： 专业： 学号： 姓名： 2015年6月20日
农杆菌介导转化法的概述 摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]? 目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子 叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 关键词：农杆菌转化方法转化效率 1?关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1??根癌农杆菌
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。? 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： —DNA?region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24?kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25?bp的重复序列．其中14?bp是完全保守的，分10?bp(CAGGAATATAT)和4?bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用?，因此，尤以右边界更为重要。 位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒 pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子，分别为virA-vjrH，共包括23个基因(virA，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)．而胭脂碱型Ti质粒的vir 区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs?，也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。
农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论 羧苄青霉素的作用 羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。 潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度 本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。 各个阶段不同添加物的作用 水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。 植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。 潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。前者分化出芽所
农杆菌介导法转基因杨树 摘要： 杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。 关键词：白杨；转化；农杆菌 前言 基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。 有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对
农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020
农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一实验目的 了解植物遗传转化的方法和理论 掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术 二原理 植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三实验材料 烟草KRK26叶片，农杆菌菌株EHA105，质粒的T-DNA含目的基因GFP，卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示: LB Bt nos3 MCS nos3 nptII nos5 RB
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用 作者：宋建刘仲齐 来源：《天津农业科学》2008年第01期 摘要：主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。 关键词：农杆菌；植物；基因瞬时表达 中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0020—03 把外源基因导入受体植物内，是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法，当农杆菌感染植物受伤组织后，质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中，这种转化细胞经过诱导分化，再生成为转基因植株。通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下，费时且费用昂贵。即使对于转化程序大大简化的植物，例如拟南芥，仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法，该方法是Rossi等在1993年创建的。他们将带有重组质粒的农杆菌，经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞，通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。随后人们又采用针管注射活体植株叶片，来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。近几年该项技术不断完善、发展，已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。 1主要原理 农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体，转化根癌农杆菌，后者经酚类化合物诱导处理后，通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中，农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。诱导处理在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因，通常在数小时后即可检测到外源基因的表达，并在1～2d内达到最高值。而少量整合进植物染色体的 T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯 殯 殯 殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期：2011-08-30；接受日期：2011-10-11基金项目：国家自然科学基因项目（31070139）资助。 作者简介：姚冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。*通讯作者：张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail ：zhangzf@mail．caas．net．cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 姚 冉1，2，石美丽1，潘沈元1，沈桂芳2，张志芳 2*1．徐州师范大学生命科学学院，江苏徐州2211162．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081摘 要：农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手， 系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。 关键词：农杆菌；遗传转化；进展 DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．04．06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1，2 ，SHI Mei-li 1，PAN Shen-yuan 1，SHEN Gui-fang 2，ZHANG Zhi-fang 2* 1．School of Life Science ，Xuzhou Normal University ，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2．Biotechnology Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China Abstract ：In current ，Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants．This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors．In addition ，the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ，respectively． Key words ：Agrobacterium tumefaciens ；genetic transformation ；progress 植物遗传转化（plant genetic transformation ）技术也称植物转基因技术，是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术 ［1］ 。目前最常用的转基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、外源DNA 整合机 理不清楚、 得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农 杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes ）。根癌农杆菌中含有Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒（包括Ri 质粒）上有一段转移DNA （transfer DNA ，又称T-DNA ），受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。 目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆菌菌株、 质粒和转化技术，以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细
农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。
HEREDITAS (Beijing) 2011年12月, 33(12): 1327―1334 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 综 述 收稿日期: 2011?03?30; 修回日期: 2011?07?25 基金项目:国家科技重大专项(编号：2009CB118400)和国家自然科学基金项目(编号：30971795, 31071433)资助 作者简介:杨琳, 硕士研究生, 专业方向：生化与分子生物学。E-mail: myyanglin1986@https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 通讯作者:李晚忱, 博士, 教授, 研究方向：玉米遗传育种与生物技术。E-mail: aumdyms@https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html, 网络出版时间: 2011-10-18 8:50:47 URL: https://www.doczj.com/doc/0e16778980.html,/kcms/detail/11.1913.R.20111018.0850.002.html DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.01327 农杆菌介导转基因植物T-DNA 的整合方式 杨琳, 付凤玲, 李晚忱 四川农业大学玉米所, 成都 611130 摘要: 农杆菌介导的遗传转化已被广泛应用于植物转基因研究。作为外源基因的载体, 农杆菌T-DNA 片段在 植物基因组中的整合方式, 不仅影响外源基因的整合效率及稳定性, 还会影响外源基因的表达特性。文章就农杆菌介导的T-DNA 整合的两种主要模式、规律及相关研究手段进行综述, 为农杆菌介导的转基因及T-DNA 插入突变等相关研究提供借鉴。 关键词: 农杆菌; T-DNA; 侧翼序列; 整合; 转基因 T-DNA integration patterns in transgenic plants mediated by Agrobacterium tumefaciens YANG Lin, FU Feng-Ling, LI Wan-Chen Maize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Chengdu 611130, China Abstract: The genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens has been widely applied to research of transgenic plants. As the vector of the exotic genes, the integration patterns of T-DNA fragments affects not only transfor-mation efficiency and stability, but also expression properties of the transgenes. This review summaries the two major pat-terns and the rules of T-DNA integration in Agrobacterim -mediated transformation, rules of T-DNA mediated by Agrobac-terium tumefaciens , as well as research tools for flanking sequence amplification. It is attempted to provide references for researches on transformation and T-DNA integration mutation mediated by Agrobacterium tumefaciens . Keywords: Agrobacterium tumefaciens ; transfer DNA; flanking sequence; integration; transgene 目前有关植物转基因的方法主要分为两大类, 一类是无转化载体引导的DNA 的直接转化, 另一类是农杆菌介导的转化, 其中后者由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、转基因拷贝数低而成为转基因策略中的首选方法[1,2]。农杆菌细胞中含 有基因组DNA 和质粒DNA, 依农杆菌的不同, 质粒分别有Ti 质粒和Ri 质粒, 其上都有一段T-DNA 。农杆菌细胞侵染植物伤口后, 可将T-D N A 插入到植 物基因组中, 从而实现外源基因向植物细胞的转移与整合, 最后通过植物细胞和植物组织培养可
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素 转化机制： 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。 1 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。 原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区： （1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要． （2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。 2 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。