单核苷酸多态性（SNP）实验 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。 实验方法原理： SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。 实验材料： 组织样品 试剂、试剂盒： 液氮、PBS、GA缓冲液、GB缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、蛋白液、漂洗液等 仪器、耗材： 离心管、离心机、废液收集管、吸附柱、水浴锅、分光光度计、低温冰箱等 实验步骤：
一、DNA抽提 1. 取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5 ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。 2. 加200 μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。 3. 加220 μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。加220 μl 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 4. 将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。 5. 加入500 μl 去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。 6. 加入700 μl 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12 000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。 7. 将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100 μl 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲液50 μl 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。 8. 采用Beckman DU 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度，在OD260 处有显著吸收峰。同时检测纯度，OD260/280 的值应为为1.7-1.9。 9. 从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液置于-20℃保存。 二、PCR扩增目的片段
浙江省水稻品种DNA指纹数据库的初步构建及其应用 程本义1吴伟2*夏俊辉1刘鑫2庄杰云1杨仕华1 (1中国水稻研究所，浙江杭州310006；2浙江省种子总站，浙江杭州310020；*通讯联系人，E-mail:wuwei1610@https://www.doczj.com/doc/0d5486829.html,) 摘要：利用前期研究建立的一套水稻品种DNA指纹检测技术体系，对2002-2006年浙江省主要的水稻品种98个、2007-2008年省区试水稻品种155个（181个次，含26个续试品种）进行了DNA 指纹检测，构建了279个次水稻品种×12个微卫星标记的DNA指纹图谱数据库。系统分析了指纹库中各标记的多态性和品种的相似性。基于构建的指纹数据库，对所有品种的特异性及区试续试品种年度间的一致性进行了鉴定。 关键词：水稻品种；微卫星标记；DNA指纹库；特异性 Construction and Application of DNA Fingerprint Database of Rice Varieties in Zhejiang Province CHENG Ben-yi1,WU Wei2,*,XIA Junhui1,LIU Xin2,ZHUANG Jie-yun1,YANG Shi-hua1 (1China National Rice Research Institute,Hangzhou310006,China;2Zhejiang Provincial Seed Management Station,Hangzhou310020,China;*Corresponding author,E-mail:wuwei1610@https://www.doczj.com/doc/0d5486829.html,) Abstract:A total of98major rice varieties in Zhejiang province from2002to2006 and155rice varieties in Zhejiang provincial regional trial from2007to2008were assayed with a set DNA fingerprint testing system on rice variety.A DNA fingerprint database containing genotypic data of279rice variety times at the12marker loci was constructed.The polymorphism of different markers and genetic similarity of varieties in the DNA fingerprint database were analyzed.Based on the DNA fingerprint database,the distinctness of all rice varieties and consistency of the same varieties in different years were identified. Key words:rice variety;microsatellite marker;DNA fingerprint database; distinctness 特异性（Distinctness）是农作物新品种权申请和品种审（认）定的前提条件。“九五”中后期以来，在种子产业快速发展的推动下，浙江省包括水稻在内的农作物品种数量明显增加，在促进农业生产发展的同时，也不同程度存在品种雷同、侵权等现象。而目前，水稻品种特异性鉴定的主要方法是新品种DUS测试，该方法测试周期长、工作量大，难以及时高效地对浙江省大量水稻品种进行特异性鉴定，有必要寻求一种快速、准确、高效的新方法。 二十世纪九十年代以来，随着分子生物学的发展，以分子标记为基础的DNA指纹 基金项目：浙江省“三农五方”科技协作项目（Sn200606）；中央级公益性科研院所专项资金项目（2006RG002）。 作者简介：程本义（1977-），男，浙江淳安人，助理研究员，主要从事水稻新品种评价和品种DNA指纹鉴定研究。 E-mail：cby_951019@https://www.doczj.com/doc/0d5486829.html,。
实验六■限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP） —、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP ）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等,导致酶切片段大"俊生了变化,这种变化可以通过 PCR ,酶切及琼脂糖凝胶电泳逬行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因走位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试別 （-）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试列：Hind JU限制性内切酶,10xM Buffer,待分析的PCR产物,DL2000 DNA Marker, 6xLoading Buffer （上样缓冲液），灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溟化乙锭EB ,致癌，请带手套操作）,0.5%TBE （电泳缓冲液1 四、实验步骤 1、Hind m限制性内切酶酶切 反应体积（10pl ）f在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer i ML ddH2O 5.5 pL Hind 皿0.5 pL PCR产物 3 ML 37°C水浴消化2h ,消化产物全部用于琼脂糖检i则。 2、琼脂糖凝胶电泳 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10pl酶切产物+1川上样缓冲液280V恒压电泳。DNA带负电荷, 电泳时
DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2-2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M12 34 5678 9 10 Hind HI内切酶识别位点：AIAGCTT TTCGATA
STR/SSR/微卫星分析 背景介绍 微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列。微卫星位点通常通过PCR扩增和电泳检测，并根据片段大小分离等位基因进行分析；扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，传统方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影或银染的方法，费时费力效率低。阅微基因基于5年的经验，利用ABI遗传分析仪对荧光标记的DNA片段进行检测，结合分子量内标进行DNA片段长度计算，使STR分型变得高效快捷，结果也更加精确。 服务项目 １．SSR引物开发 通过富集微卫星序列，开发出20-30条具有一定重复特征的微卫星序列，并且对序列进行多态性和特异性验证。 ２. 引物筛选 选取部分代表性样本，利用普通引物进行PCR扩增，然后利用高分辨率芯片电泳或PAGE验证引物的特异性、扩增效率和基因座多态性等信息（图1）。
图1. 用岛津MultiNA芯片电泳仪进行引物筛选的结果 ３．样本批量扩增 用带有荧光标记（FAM／HEX／TMR／ROX等）的引物，对批量样本进行PCR扩增。我公司拥有高通量PCR仪平台，可以满足大量样本扩增需求。４．测序仪检测 带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合，用3730xl等测序仪进行毛细管电泳，并得到原始数据（fsa文件，见图2）。 图2.应用3730xl测序仪检测得到的原始图谱 ５．原始数据分析 编制panel和bin等文件，使用正版GeneMapper v4.0软件分析测序仪得到
的fsa文件，并生成PDF图谱和Excel文档（包括size、基因分型等信息），分析后的电泳图谱见图3。 图3.GeneMapper软件分析后的电泳图谱 ６．群体遗传学分析 利用生物信息学软件（POPGENE、MEGA、PHYLIP、ARLEQUIN等）对上述数据进行进一步分析，绘制遗传连锁图谱、分析连锁不平衡和分析多态性等。送样要求 细胞（≥106）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、基因组DNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）；引物信息、片段长度范围、琼脂糖电泳图等。 提供结果 引物、微卫星分析的原始数据以及GeneMapper生成的PDF图谱、包含片段长度等信息的Excel文档和进一步的分析结果等。 成功案例 到目前为止，我公司与上百家科研机构建立合作，进行过多个物种的引物开发、多态性分析、种系鉴定和连锁图谱构建等工作，包括人、小鼠、大鼠、兔、马、犬、牛、大熊猫、鱼、虾、麻雀、蜜蜂、蚊子、蚜虫、瓢虫、小麦、玉米、大豆、棉花、杨树、苹果、葡萄和真菌等。
文章编号:1007-7847(2000)S0-0018-06 微卫星荧光标记基因组扫描 X 邓 昊,何云贵,夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,中国湖南长沙 410078) 摘 要:微卫星荧光标记基因组扫描为20世纪90年代发展起来的一项分子生物学技术,在基 因定位、个体识别等方面有广泛的应用.文中对其原理、策略、分析方法及应用作了论述,并探讨 了它的发展前景. 关键词:微卫星;荧光标记基因组扫描;基因定位;分析方法 中图分类号:Q78 文献标识码:A Fluorecence -based Genescan with Microsatellite Markers DENG Hao,HE Yun -gui XIA Jia -hui (National Laboratory of Medical Genetics,Hunan Medical University ,Changsha 410078,Hunan,China) Abstract:Fluorescence -based genescan with microsatllite markers is a molecular -biology technique which developed in 1990p s.It is used widely in the field such as gene mapping,personal identifica -tion.Here we demonstrate its principle,research stra te gy,analysis methods,applications and discuss the developing prospec t. Key words:microsatellite;fluorescence based genescan;gene mapping;analysis method 人类基因组计划已开展了近10年,1999年12月1日美、日等国科学家宣布,人类22号染色体的测序工作业已完成,其余染色体的大规模测序工作在近3年也已将完成.运用大规模测序的大量数据,将cDNA 与致病基因一一对应起来,将疾病定位到染色体某一位置后进行突变检测,不失为基因克隆的一条捷径.微卫星(Microsatellite)DNA 标记是简单重复的DNA 片段,每个重复单位一般1~6个碱基(bp),重复次数10~20次左右,广泛存在于真核生物中[1].由于其种类多,高度多态,基本上呈平均分布并可用PC R 检测,具有共显性遗传特征,因而广泛用于遗传作图.近年来绝大部分基因定位和克隆都运用了微卫星荧光标记的基因组扫描分析技术. 1 原理与策略 微卫星DNA 在人基因组中平均每30kb 存在1个,人类基因组中以(CA/GT)n 重复序列 第4卷 第2期(专辑)2000年6月 生命科学研究Life Science Research Vol 14 No 12(Suppl.)Jun 12000 X 收稿日期:2000-06-12 基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39525012);国家自然科学基金重大项目(39896200) 作者简介:邓昊(1973-),男,湖南长沙人,硕士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;何云贵(1970-),男,湖南湘乡人,博士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;夏家辉(1937-),男,湖南医科大学教授,中国工程院院士,博士生导师.
收稿日期:2000-06-24,3论文联系人 基金项目:国家自然科学基金(39830240,3980089),国家 转基因植物研究专项(J 992A 2023)资助项目 作者简介:张 军(1968-),男,在职博士研究生,工作单 位为山东省农业科学院.棉花微卫星标记的PA GE 银染快速检测 张 军,武耀廷,郭旺珍,张天真3 (农业部农作物种质资源与育种重点开放实验室,南京农业大学农学系,南京210095)摘要:利用一种简便、快速的PA GE 银染方法检测了异源四倍体棉花栽培种陆地棉与海岛棉之间 的微卫星多态性,并检测到了微卫星在陆地棉品 种间的多态及微卫星标记位点在陆地棉品种间的 复等位性。 关键词:棉花;微卫星;PA GE ;银染 中图分类号:S 562.035.3 文献标识码:A 文章编号:100227807(2000)0520267203Fa st Screen i ng of M icrosa tell ite M arkers i n Cotton w ith PAGE sil -ver Sta i n i ng ZHAN G Jun ,W U Yao 2ting ,GUO W ang 2zhen ,ZHAN G T ian 2zhen (A g rono m y D ep a rt m en t ,N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity ;K ey L abora tory of C rop Ger m p las m and B reed ing ,M in istry of A g ricu ltu re ,N anj ing 210095,Ch ina )Abstract :Po lym o rph is m of m icro satellite m ark 2ers betw een cu ltivars of allo tetrap lo id co tton species (Gossyp ium h irsu tum L .)and the seais 2land co tton (G .baba rd ense L .)w as screened u s 2ing a rap id and si m p le m ethod of PA GE silver stain ing .T he po lym o rp h ic and m u ltiallelic char 2acter of m icro satellite m arkers am ong up land co tton cu ltivars w ere iden tified as w ell .Key words :co tton ;m ico satellite ;PA GE ;silver stain ing 微卫星(m icro satellite )或短串联重复(STR ) 又称简单序列重复(SSR )。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列,一般为1～6bp S )为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的,但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列,据此设计引物,即可通过PCR 技术分析核心序列重复次数的变异,在不同的遗传型间检测到多态,称为简单序列长度多态性(SSL P )。微卫星首先是在人类遗传研究中发现的[1],以后发现在 植物中也普遍存在。现在,微卫星作为一种分子标 记技术已经用于植物遗传、育种研究。Yu 等[2]利 用研究开发出的棉花微卫星的引物,进行棉花遗 传图谱构建及Q TL 分析。但是,微卫星的长度很 小,一般为100～300bp S ,有时甚至小于100bp S , 其多态性有时仅表现为几个bp S 的差异。因此一 般的琼脂糖凝胶电泳很难检测微卫星的多态性。 早期的研究是在PCR 反应体系中加入一种用放 射性同位素标记的脱氧核苷酸底物,利用变性或 非变性的PA GE 经放射自显影检测多态性[3,4], 这给研究中利用微卫星标记带来很大的麻烦。利 用高分辨率的琼脂糖凝胶电泳可以检测到大多数 微卫星的多态[4],但这种琼脂糖凝胶的制备费时、 费力。Panaud 等[5]尝试利用PA GE 银染技术检 测微卫星的多态性。银染的灵敏度非常高,但一般 的银染方法操作比较繁琐,不容易控制染色背景, 使得结果不稳定。我们利用一种快速简便的银染 方法,通过非变性的PA GE 有效地检测了陆地棉 与海岛棉种间及陆地棉种内品种间微卫星的多 态性。1 材料和方法1.1 植物材料 陆地棉遗传标准系TM —1、海岛棉高产抗病 品系海7124及其杂交F 1。陆地棉6个栽培品种。 1.2 棉花基因组DNA 的分离纯化参考郭旺珍等[6]的方法。1.3 微卫星的PCR 扩增PCR 反应体系(67mM T ris 2HC l (pH 8.8), 16mM (N H 4)2SO 4,0.002%明胶,0.2mM dN T P S , 7 62 棉花学报 A cta Go ssyp ii Sinica 2000,12(5):267～269
1微卫星DNA标记的发现 1974年，Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微 卫星DNA的重复序列。此后，在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。直到1986年，Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析，这时才得到重视。1988年，Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。1989年，Litt等[1]扩增到了人类基因组微卫星序列，从而创造了“微卫星（microsatellite）”这个名称。 2微卫星DNA的结构 微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencere-peats，SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，是指以少数几个核苷酸（一般是1~6个）为单位串联重复的DNA序列。这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中。普遍认为，在染色体上，除着丝粒及端粒区域外，其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同，将其分为完全（无间隔）、不完全（有非重复单位的碱基间隔）和复合型（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）微卫星3种类型。 3微卫星DNA标记的优缺点 3.1优点 ①分布广泛。微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。②多态性丰富。由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大，因而造成其长度具有高度的多态性，使其可以包含大量丰富的信息。③简易高效安全性。微卫星检测方法简便且效率高，单个位点检测时间很短，一般不超过24h，并可以多个位点同时进行检测。微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。④保守与通用性。微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。⑤共显性遗传。微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传，因而易区分纯合型和杂合型。 3.2缺点 ①建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都是非常繁琐、耗时的工作。②由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同，因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。③微卫星进化具有复杂性，可能出现同源异型或异源同型。④PCR 扩增受许多因素的影响，使一些等位基因无法被扩增出来，即“无效基因”。影响亲子鉴定的正确性。⑤目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性 4微卫星DNA的筛选方法 获得微卫星DNA的常规方法主要有两种:①通过构建基因组文库,核心重复序列探针标记,杂交筛选,测序及特异引物设计等一系列步骤;②可利用近缘物种间某些染色体片段的同源关系,以已知的微卫星DNA引物作跨物种使用,从中筛选出适宜于另一物种的微卫星DNA标记. 5微卫星DNA的筛选步骤: ①基因组文库的构建,提取基因组DNA,酶切后与载体连接,将连接产物转入大肠杆菌,涂板后在37℃下培养,用α-互补法筛选阳性的重组质粒;②质粒DNA的提取;
限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP) 一基本原理 各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP). 二主要材料 DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。 三方法步骤(图1) 图1
(一) 样本DNA制备 采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。 (二) 限制性内切酶降解样本DNA 根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。该步骤必须保证酶解完全。如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。酶解的时间根据实际情况而定。 (三) 电泳 电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。时间由几小时到24小时不等。 (四) 转印 所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。转印的方法一般有三种。根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。 1 盐桥法；也叫毛细管转移法。先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×
开题报告 生物科学 龙头鱼微卫星标记的开发及筛选 一、论述龙头鱼微卫星多态标记研究现状，说明选题的依据和意义 目前，国内对龙头鱼的研究主要集中在属间的远缘杂交等方面，但是尚未研究成功。对龙头鱼微卫星多态标记的开发目前尚未见报道，而本文主要是通过对龙头鱼微卫星进一步研究，希望能够利用远缘杂交所带来的杂交优势获得具有优良性状子代，那在生产上或遗传学上都将有重大意义。 微卫星标记技术是基于基因组DNA水平的差异进行检测，不受组织，器官种类、环境条件等因素影响，因此可作为水生动物种质鉴定、亲缘关系及种质分类等研究的理想标记。 龙头鱼俗称狗母鱼，属于脊索动物门,硬骨鱼纲,灯笼鱼目,狗母鱼科,龙头鱼属。其形体柔软，长形，略侧扁，头背稍圆。吻短，钝圆，口甚大。龙头鱼生活于暖温性海洋的中下层。运动能力不强。常栖息于浅海泥底的环境中。每年春季为产卵期。杂食性，以小鱼、小虾、底栖动物为食。分布于印度洋和太平洋、我国南海、东海和黄海南部均产之、尤以浙江的温、台和舟山近海以及福建沿海产量较多。属暖水性底层近岸鱼类，缓潮时常到上层。一般只在近海作短距离移动。属捕食性鱼类，生长甚快。以3～4月和9～12月渔获为大。 鉴于恢复与保护野生龙头鱼资源的需要,有必要对龙头鱼的种质遗传基础和种质资源鉴定开展深入的研究。目前,有关龙头鱼群体遗传背景方面的研究很少,仅见于部分学者对龙头鱼野生群体和养殖群体进行了RAPD 分析。然而,迄今为止,尚未见有关龙头鱼微卫星标记研究方面的报道,这严重制约了微卫星标记在龙头鱼遗传学研究中的应用。因此,筛选多态信息含量丰富的龙头鱼微卫星标记,分析龙头鱼群体遗传结构用于标记选择育种等,具有重要的理论意义和应用价值。然而,利用微卫星标记最关键的一步就是微卫星位点的分离和富集。目前,常用的富集微卫星标记的方法主要有3 种: ①构建目标生物小片段插入基因组DNA 文库,通过含有重复序列的探针筛选含有微卫星的阳性克隆; ②通过生物素探针结合链霉亲和素包被的磁珠进行微卫星DNA 片段的富集; ③从公共核酸序列数据库资源中筛选微卫星。其中,传统的构建小
高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM 摘要：本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法，微卫星标记是一种功能强大的共显性标记，扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量，但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。相对于大肠杆菌文库分离方法，新一代测序技术（NGS）可以得到更多可用的候选基因。我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述，并发现无论采用什么分离技术，由于PCR 未充分扩增，基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。因此，在分子标记技术上，筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型，发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因，对此列出了具体的流程。通过该流程，或许我们可以快速地进行新一代标记的检测，并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。 关键词：HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学 引言 微卫星也叫简单重复序列（SSRs），是群体遗传学中最强大的共显性标记，具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。最近由于新一代测序技术（NGS）的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷，不能获得足够的设计引物的数据。扩增片段多态位点的选择，依然是一件费时费力的工作，这是SSRs发展
中的另一个瓶颈。因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点，并且HRM有望加快SSR的发展速度，降低传统方法的费用。SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点，使其在群体遗传学方面得到广泛应用。传统的SSR位点的重新分离，是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002)，但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle′cz et al. 2004)。由于NGS的不断改进，尤其是罗氏454 FLX 钛化学（ Titanium XL ?试剂盒可以使其被更广泛的应用）能够识别更多的片段，NGS如今已逐渐取代克隆文库(Castoe et al. 2010; Santana et al. 2009; Vanpe′ et al. 2009)。最重要的一点是NGS建立了无可比拟的信息含量，而在大部分文献中大肠杆菌文库的克隆序列却低于1000个（参考本文文献评论），NGS可以产生成千上万的序列，其中SSR位点达好几千。这些重复区域可以用来设计引物，也可以用软件包进行分析了(Kofler et al. 2007; Megle′cz et al.2009)。借助于传统的和是基于NGS的分离技术，就可以对扩增的新位点、基因组中单拷贝位点及丰富的多态性进行检测。筛选步骤通常包括个体序列的扩增，确定扩增片段质量的凝胶电泳和评定等位基因多样性的毛细管电泳。
扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。 关键词：AFLP，分子标记技术，应用 目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术 （Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。 以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。 1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点 1.1. AFLP分子标记技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
湖南农业大学 毕业论文 应用微卫星标记分析 湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系 学生姓名：陈东 年级专业：2009级动物医学 指导教师及职称： 学院：继续教育学院 湖南·长沙 提交日期：
湖南农业大学成人高等教育本科生毕业论文 诚信声明 本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 毕业论文作者签名： 年月日
目录 摘要 (1) 关键词 (1) 一、前言 (1) 二、材料与方法 (2) （一）材料 (2) （二）方法....................................................................................2-3 三、结果 (4) （一）牛样本DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (4) （二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析 (4) （三）遗传距离分析 (4) 四、分析与讨论 (5) （一）湘西黄牛各杂交牛的特有等位基因和缺失的等位基因 (5) （二）杂合度、期望杂合度、观测杂合度和多态信息含量 (6) 参考文献 (6) 致谢词 (6)
应用微卫星标记分析 湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系 学生：陈东 指导老师： （湖南农业大学动物医学院，长沙 410128） 摘要：为了分析湘西黄牛与国内外其他品种的亲缘关系，本研究利用8个微卫星标记对湘西黄牛进行了遗传多样性分析。结果发现湘西黄牛等位基因丰富，在57-72个之间；平均多态信息含量在0.8547～0.9024之间，为高度多态性；平均杂合度在0.8867～0.9248之间；各杂交牛之间都存在一些特有等位基因和缺失等位基因；通过Nei’s聚类分析，其与引进种公牛的遗传距离较大，与国内4个优良肉牛品种相比，可以单独聚为一类。 关键词：湘西黄牛；微卫星；亲缘关系；遗传距离 一、前言 进入20世纪70年代以来，随着DNA重组技术的产生以及分子生物学、分子遗传学等学科的迅猛发展，人类已经能够从分子水平上对遗传物质 DNA的结构进行更直接、更精确的研究，并建立了一系列的分子遗传标记 ( Molecular Genetic Markers )技术。由于微卫星 DNA标记具有多态性高，呈共显性遗传，能准确判别等位基因，遍布于整个基因组且分布均匀等特点，在畜禽遗传育种工作中被广泛应用于构建基因图谱[1-4]，制作DNA指纹图谱[5-7]，定位功能基因和数量性状座位(QTL)[8]，进行血缘鉴定和血缘控制[9-10]，遗传多样性评估等研究。汤青萍等[11]利用微卫星标记对中国部分地方鸡种的遗传多样性进行了分析、Reed等利用微卫星座位对家鸡和火鸡的遗传结构进行了对比分析[12]、牛荣等利用35个微卫星座位对版纳小耳猪近交系进行了遗传分析[13]、张亚平等对大熊猫微卫星DNA的筛选及应用进行了研究[14]。湘西黄牛是湖南省地方家畜优良品种，为了能更有效地对地方品种开展合理保护、开发和利用，本研究采用微卫星 DNA标记对湘西黄牛与国内外的8个其他黄牛品种的遗传多样性进行研究，以期为相关工作提供必要的遗传学依据。 二、材料与方法 （一）材料 1.实验材料 采集湘西黄牛的杂一代牛作为实验样本，采样地点分别在永顺县（152头）和新晃
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
实验六、限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试剂 （一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。 四、实验步骤 1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切 反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer 1 μL ddH2O 5.5 μL Hind Ⅲ0.5 μL PCR产物 3 μL 37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。 2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT TTCGA ↑A AB AA BB 2000 750 500 250 1000 100
SNP/单核苷酸多态性分析 背景介绍 SNP（single nucleotide polymorphism），即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究（如生物的起源、进化及迁移等方面）和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。 服务项目 １．TaqMan探针法 针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析（见图1）。
图1.某SNP位点分析结果 A.纯合(G/G) B.杂合(G/T) ２．SNaPshot法 该技术由美国应用生物公司（ABI）开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析（见图2）。 图2.人线粒体22个SNP位点的SNaPshot实验结果 ３．HRM法 高分辨率熔解曲线分析（HRM）是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快