酯酶同工酶在食用菌菌种选育中的应用研究
杨立红,辛晓林,蔡德华,谢红艳
(烟台师范学院生命科学学院,山东 烟台,264025)
摘要:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析了不同培养时间和不同培养基种类对平菇、杏鲍菇、白灵菇酯酶同工酶的影响,结果表明在不同培养时间和不同培养基条件下,酯酶同工酶酶谱的酶带呈现不同的多态性,由此提示同工酶在食用菌菌种选育的应用上应固定最佳培养时间及最适培养基种类,并在所有操作条件一致的情况下,才能得到稳定准确的分析结果。
关键词:同工酶;酯酶;食用菌;菌种选育
中图分类号:S646 文献标识码:A
文章编号:1003-8310(2004)05-0010-03
同工酶分析作为分子遗传标记技术之一,不仅被广泛应用于动植物的遗传分析,生理生化研究,而且被作为化学分类的重要指标应用于真菌的分类鉴定中。由于同工酶是由不同等位基因或不同基因位点编码的,它所表示的信息是DNA分子水平上的信息,它弥补了以菌落形态、颜色、孢子形态、子实体形态等特征加以分类的传统方法的不足,逐渐成为真菌分类领域常用重要的工具。特别是在属内种间及品种之间的分类鉴定是非常有效的[1]。同工酶酶谱的差异主要是由编码同工酶的基因所决定的,但酶谱不能直接反映DNA水平上的差异,它同时还受试验条件和生物生长发育时期的影响,只有不受外界条件影响的等位基因编码的同工酶位点才能用于遗传分析[2]。本研究通过对三种菇类在不同培养时间和不同培养基中的酯酶同工酶多态性的影响的分析,旨在为同工酶技术在食用菌菌种选育中的应用提供理论和实践参考。
1 材料与方法
111 材料
11111 白灵菇(Pleruotus eryngii var.nebrodensis)、杏鲍菇(pleurotus eryngii)均由烟台师范学院食用菌研究所提供;平菇(Pleurotus ostreatus)由山东省食用菌工作站提供。
不同培养时间的平菇,杏鲍菇,白灵菇的营养菌丝,分别编号如表1:
在4种培养基上培养的平菇,杏鲍菇,白灵菇的营养菌丝,分别编号如表2:
表1不同培养时间营养菌丝
菌种编号
培养时间(d)
711141720
平 菇A A7A11A14A17A20杏鲍菇B B7B11B14B17B20白灵菇C C7C11C14C17C20表24种培养基上培养营养菌丝
菌种编号
培养基
ⅠⅡⅢⅣ平菇A AⅠAⅡAⅢAⅣ
杏鲍菇B BⅠBⅡBⅢ—
白灵菇C CⅠCⅡCⅢCⅣ
11112 四种培养基的配方:培养基Ⅰ(可溶性淀粉3%～6%,蔗糖1%,磷酸二氢钾013%,硫酸镁0115%,酵母膏011%,pH6);培养基Ⅱ(葡萄糖50g,硝酸钙015g,硝酸钾2g,氯化钠011g,磷酸二氢钾015g,硫酸镁015g,硫酸亚铁2mg,维生素B12mg,水1000ml,pH5;培养基Ⅲ(马铃薯20%,蛋白胨012%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0105%,硫酸镁0105%,氯化钠0101%,pH自然);培养基Ⅳ(玉米粉3%,蔗糖1%,磷酸二氢钾013%,硫酸镁0115%,pH自然)。
112 主要仪器 Z323K高速冷冻离心机;722光栅分光光度计;DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪; DYY-Ⅲ型电泳槽;C-1层析实验冷柜;超低温冰箱;Y XS型数显恒温水浴锅。
113 酶液提取 取一定量111中各编号的实验材料,在预冷的研钵中,加适量样品提取液[5],冰浴研磨,成糊状后,于高速冷冻离心机中低温离心(16000r/min,6min),取上清夜,放入-74℃的超低温冰箱保存,电泳备用。
114 蛋白质含量测定 用双缩脲法测定样品提取液中的蛋白质含量[3],确定上样量,所有试验酶液上样量均为150μg。
收稿日期:2004-03-23
01中国食用菌 E DI BLE FUNGI OF CHI NA V ol123,N o15
115 电泳 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(P AG E )[4]:分离胶浓度7%,pH 819;浓缩胶浓度215%,pH 617;电极缓冲液为T ris -甘氨酸系统(pH 813),以溴酚蓝为指示剂,首先调节电流为10m A ,当溴酚蓝达到分离胶时,加大电流到48m A ,在0℃层析实验冷柜中电泳约5h 。116 染色 剥下胶板移至大培养皿中,倒入酯酶染色液,37℃保温015h [5]。
117 固定、脱色 倒出染液加入φ=7%乙酸固定、脱色。
2 结果与分析
211 不同培养时间酯酶同工酶酶谱分析21111 平菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱分析:结果见图1
。
图1 平菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱
图1表明,培养7d 的平菇菌丝体酯酶同工酶
的酶谱中有10条酶带;当培养时间延长至11d 时,10条酶带的染色加深,并且增加了R f 为01641、01669、01718、01785、01931的5条酶带;培养14d 时,R f 为01718和01785的酶带消失,R f 为01641、01669和01931的酶带显色加深;培养17d 时,增加R f 01589的酶带;培养20d 时,R f 01589和R f 01931的酶带消失。相比较下,培养11d 的酯酶同工酶酶谱酶带最多,显色最深,表明多肽性好及活性高。21112 杏鲍菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱分析:结果见图2
。
图2 杏鲍菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱
图2表明培养7d 的杏鲍菇的酯酶同工酶酶谱
中只有R f 为01620和01644的2条酶带,且在其他四个培养时间再也没表达过,是培养7d 时的酶谱中特有的;培养至11d 时,酶谱中有8条酶带;培养14d 与培养11d 的酶谱之间无明显变化;培养至17d 时,增加R f 为01200和01778的2条酶带;培养至20d 时,R f 为01200和01778的酶带加深且增加R f 01233的酶带。相比较下,培养20d 的酶谱中酶带最多,显色最深。21113 白灵菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱分析:结果见图3
。
图3 白灵菇不同培养时间酯酶同工酶酶谱
图3表明,白灵菇菌丝体在培养7d 的酯酶同工酶酶谱中有3条酶带;当培养至11d 时,增加R f 为01141、01516、01542的3条酶带;培养至14d 时,R f 为01516、01542和01714的酶带消失;培养至17d 时,R f 为01516、01542、01714的酶带又出现,但染色极浅;培养20d 时,R f 为01542的酶带消失。相比较下,培养11d 时,酶谱中酶带最多,显色最深。212 不同培养基培养的菌丝体酯酶同工酶酶谱分析
21211 平菇不同培养基酯酶同工酶酶谱分析:结果见图4
。
图4 平菇不同培养基酯酶同工酶酶谱
培养基Ⅱ的酯酶同工酶酶谱比培养基Ⅰ增加
R f 01495和R f 01709的酶带,且R f 01026的透明带消失;培养基Ⅲ的酶谱比培养基Ⅱ增加R f 为01179、01201、01235、01503、01860、01883的6条酶带;培养基Ⅳ只有3条酶带。相比较下,培养基
1
1第23卷 第5期 中国食用菌 E DI BLE FUNGI OF CHI NA
Ⅲ的酶谱酶带最多,显色最深。
21212 杏鲍菇不同培养基酯酶同工酶酶谱分析:
结果见图5。
图5表明,杏鲍菇在培养基Ⅰ上的酯酶同工酶
酶谱中有7条酶带;培养基Ⅱ上R f01595的酶带消
失;培养基Ⅲ比培养基Ⅰ增加R f为01205、01295、
01458、01505的4条酶带且R f01595的酶带又出现。
杏鲍菇在培养基Ⅲ上的酯酶同工酶酶谱中酶带最
多,染色最深。
21213 白灵菇不同培养基酯酶同工酶酶谱分析:
结果见图6
。
图5
杏鲍菇不同培养基酯酶同工酶酶谱
图6 白灵菇不同培养基酯酶同工酶酶
图6表明,培养基Ⅰ的酯酶同工酶酶谱只有2
条酶带,培养基Ⅱ比培养基Ⅰ增加4条酶带,培养
基Ⅲ上R f01562的酶带消失;培养基Ⅳ上R f01590
的酶带消失。相比较下,培养基Ⅱ的酶谱中酶带最
多,染色最深。
3 讨论
已有研究表明,真菌同工酶分析结果易受取样
部位(营养菌丝体、子实体、分生孢子、菌核等)、
核相(双核、单核)、培养条件(时间、培养基)
的影响,导致结果不稳定、不准确,因此条件一致
是极为重要的[6]。本研究结果表明,培养时间和培
养基种类对平菇、杏鲍菇、白灵菇的酯酶同工酶酶
谱有显著影响。随培养时间的延长和培养基种类的
不同,其酯酶同工酶的酶谱呈现不同的多态性,谱
带数目有所增减,染色深浅也有所不同,既酶活力
不同。从DNA水平上解释,就是同工酶基因的开
放、关闭及表达量有所变化。本实验中,平菇、杏
鲍菇、白灵菇在所选的5个培养时间中都各自有一
个使酶谱酶带数目最多,酶活性最强的培养时间:
平菇为11d,杏鲍菇为20d,白灵菇为11d。在所
选的4种不同培养基中,也有一种使酶谱酶带数目
最多,活性最高的培养基:平菇为培养基Ⅲ,杏鲍
菇为培养基Ⅲ,白灵菇为培养基Ⅱ。因此,在运用
同工酶技术进行菌种鉴定时,应固定最适培养时
间,固定最适培养基种类,使被鉴定的菌种材料在
影响因素一致的条件下取样,以保证同工酶酶谱稳
定、准确,从而快速有效地对真菌进行分类鉴定。
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Study on Breeding of Edible Fungi with Esterase Isoenzyme
YANG Li-hong,XIN Xiao-lin,CAI De-hu a,XIE H ong-yan
(C ollege of Life Science,Y antai N ormal University,Y antai 264025,China)
Abstract:This article adopted polyacrylamide gelelectrophoresis to analyse the effects of different culture time and medium on the esterase is oenzyme of Pleurotus ostreatus,Pleurotus eryngii,Pleruotus eryngii Var.nebrodensis.The re2 sults showed that the number and the degree of stain of enzyme bands in zym ogram are different with different culture time and medium,which prom pted that we should apply fixed culture time and medium to ass ortative breeding,and on condi2 tion that we can obtain the steady and accurate result.
K ey w ords:Esterase;Edible Fungi;Breeding of strains
21中国食用菌 E DI BLE FUNGI OF CHI NA V ol123,N o15
LDH同工酶 定义1：具有相同底物，但电泳迁移率不同的酶。可来简介 用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同同工酶 的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体。 编辑本段分类 基因性同工酶或原级同工酶 由不同基因产生的肽链而衍生的同工酶。这里所指的不同基因可以在不同染色体或在同一染色体的不同位点上，例如LDH中A、B两条肽链的基因分别在第11及第12对染色体上，唾液淀粉酶和胰淀粉酶的基因在第1对染色体的不同位点上。这类同工酶因分子结构差异较大，彼此间无交叉免疫。但同工酶的不同基因也可以是同源染色体的等位基因，这种成对的等位基因上两个基因结构不同的情况，在遗传学上称为杂合子。杂合子在同一个体中可合成同一种酶的两种不同
肽链，或亚基，这两种亚基尚可杂交，形成同工酶。在生物群体的不同个体中，有时同一基因位点上的一个（对杂合子来说）或一对（对纯合子来说）基因也可发生遗传变异，从而产生变异的酶，出现群体中的遗传多态。不同个体中这些遗传变异的酶也属于基因性同工酶。其在免疫学上常有交叉反应。由同一基因转录出前体核糖核酸（前体RNA），经过不同的加工剪接过程而生成多种不同的mRNA，再转译出多种肽链，从而组成同工酶。这类同工酶因发现较晚，在国际上尚无统一命名，彼此间也有交叉免疫。 次生同工酶或转译后同工酶 由同一基因、同一mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同的化学修同工酶试剂 饰，如酰胺基水解、磷酸化、肽链断裂、糖链上的糖基增减等形成不同结构的酶蛋白，它们的免疫性往往相同。国际生化协会命名委员会（CBN）建议只将原级同工酶列为同工酶，而将次生同工酶称为共合酶，但不少生化学家还是把上述各类酶的不同结构形式都包括在广义的同工酶概念中。 编辑本段功能 在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷
酯酶同工酶的醋酸萘酯-铁氰化钾染色法的研究 摘要：酯酶可将＠-醋酸萘酯和?-醋酸萘酯水解生成醋酸和萘酚，利用萘酚能与铁氰化钾反应生成有色物质萘醌的性质可对电泳凝胶上的酯酶同工酶进行染色。 关键词：酯酶同工酶；醋酸萘酯；铁氰化钾；染色法 经典的酯酶同工酶的染色方法的原理是，酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可与坚牢蓝反应生成蓝紫色物质，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出蓝紫色的酶带。 经过摸索，本文介绍一种新的酯酶同工酶的染色方法———醋酸萘酯N 铁氰化钾染色法，其原理是酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可被铁氰化钾氧化成萘醌，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出酶带。 一 材料与方法 1.1实验材料 以新鲜的肉鸡肝脏为材料。 1.2试剂 Acr 为广东省汕头化学试剂厂产品，Bis 、坚牢蓝RR 盐为上海化学试剂公司产品，TEMED 为上海前进试剂厂产品，溴酚蓝为上海试剂三厂产品，＠-醋酸萘酯为上海青浦合成试剂厂产品，?-醋酸萘酯为上海试剂一厂产品， Tris,HCL,NaCL,2Na HP 4o ,磷酸二氢钠，三氯醋酸，乙醇，甘油，丙酮，丙酮、铁氰化钾、过硫酸铵等均为国产分析纯。 1.3仪器设备 研钵、电泳仪与电泳槽、冰箱、离心机、微量加样器、恒温水浴锅、染色盒、67$紫外光栅分光光度计等。 1.4实验方法 （1）样品制备：取一定量的新鲜鸡肝，按一定比例加入8*9:1的磷酸缓冲液后进行研磨，经4000r/min,15min 离心后取上清液，置于1?冰箱中保存备用。 （2）酯酶活力的测定：参照禹邦超等人的方法进行。 （3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照赵永芳的方法进行。 （4）酯酶同工酶的染色方法有： 经典法：（即醋酸萘酯-固蓝RR 盐染色法）染色液：称取?-醋酸萘酯与＠-醋酸萘酯、坚牢蓝RR 各200mg ，分别用10mL 丙酮溶解后，混合，再用磷酸缓冲液定容至200mL 。 电泳后，将凝胶条浸入染色液中，于37摄氏度保温直至酶带出现。 染色新法（即醋酸萘酯B 铁氰化钾染色法）染色液G ：仅将经典法染色液中的坚牢蓝RR 除去；染色液B ：4%的铁氰化钾溶液。电泳后将凝胶条浸入染色液A 中，于37摄氏度保温2min 后弃去染色液A ，用蒸馏水稍加漂洗，再用染色液B 染色，直至显出酶带。 二 结果与讨论 电泳前，将完整的一块凝胶按计划等分为$部份，每部份都按相同的酶活力梯度进行点样。电泳结束后，将该凝胶按计划等分切为2块凝胶。1块用经典法进行染色，1块用染色新法进行染色 通过观察实验现象，我们发现这2种染色方法所得的酶谱是相同的。前文已再次证实鸡
三、过氧化物酶活性的测定 过氧化物酶通过催化酚类物质与H2O2反应生成醌类来清除植物体内的H2O2.过氧化物酶还与生长素、NADH、NADPH的氧化有关，在植物代谢中起着重要作用。 实验前思考 1、POD和CAT清除H2O2的反应有何不同 2、植物体内有哪些主要的过氧化物酶？ 原理 愈创木酚（邻甲基苯酚）可作为过氧化物酶的底物，与H2O2反应生成茶褐色产物。该物质在470nm处有最大吸收峰，故可以分光光度计测定过氧化物酶的活性。 材料、仪器与试剂 1、材料 马铃薯块茎或其他植物组织材料 2、仪器及用具 紫外分光光度计；离心机；研钵；5ml量筒；25ml容量瓶；微量进样器；秒表。 3、试剂 （1）50mmol·l-1ph值为5.5的磷酸缓冲液。 （2）50mmol·l-1愈创木酚溶液；称取6.207g愈创木酚，用少许酒精溶解，然后定容至1000ml。 （3）2% H2O2；取30% H2O267ml，加水至100ml。 方法与步骤 1、酶液的提取
取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎至于研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，以3000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶，定容至25min，低温下保存备用。 2、过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括：2.9ml50 mmol·l-1磷酸缓冲溶液，1ml2%HO，1ml50mmol·l-1愈创木酚溶液和0.1ml酶液。取2支试管分别加入上述各溶液，1支于沸水中5min作为对照，另1支于37℃水浴中保温15min。反应结束后立即利用分光光度计检测其在470nm 波长下的吸光度，测定3～5min的吸光度变化。 结果与计算 以每分钟内的△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位。 过氧化物酶活性（u·g-1·min-1）=△A470V÷0.01W t Vt 式中：△A470：反应时间内吸光度的变化； W为材料鲜重（g） V为酶提取液总量（ml）； V t为反应系统中加入的酶液量（ml）； t为反应时间（min）。 试验后思考题 1、在此实验中△A470反应时间如何掌握？ 2、使用愈创木酚溶液时要注意什么？为什么？
同工酶在临床上的意义 生物工程 1092820112 万晓佳 同工酶（isozyme，isoenzyme）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。 在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。 在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外。因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。 目前，同工酶对疾病的诊断和鉴别诊断都有重要意义。 同工酶的分布有明显的组织差异或细胞内的定位不同，使其具有较大的临床应用意义。 1）同工酶在不同组织中差异的临床意义： 因为存在组织差异，所以可根据其变化来推测受损的组织或器官。例如CK-MB活性增高对判断心肌梗死有意义。心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1>LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5>LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰竭引起肝淤血状态。
实验四同工酶分析 同工酶概述 酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。 同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。 从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因： （一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个 学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基， 按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、 LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。 （二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于 同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族 中。 （三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体 （26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。 （四）多肽链的续发变化多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产 生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、 磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。 （五）酶空间构象的差异组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。 从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。 同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种： （一）呈色法直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。 （二）化学反应显色法采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显
过氧化物酶peroxidase 简介 peroxidase 氧化还原酶的一种。 过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应. 过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。 过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡, 直径约为0.5～1.0μm, 通常比线粒体小。普遍存在于真核生物的各类细胞中,在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。 植物体中含有大量过氧化物酶，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视. 催化从底物移去电子，并转给过氧化氢反应。 即：供体+H2O2→氧化的供体+2H2O，是一种血红素蛋白(hemoprotein)。 如过氧化氢酶便是过氧化物酶的一种。过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶配合使用，脱除蛋清中的葡萄糖，代替了传统的自然发酵的方法，从而提高产品质量，缩短生产周期。 在医学上，也可作为工具酶，用于检验尿糖和血糖。 现代医学上认为机体衰老与氧化有关，例如染色体、酶等的氧化。所以，一些有还原性功能的物质可以在某种程度上抗衰老，如过氧化物酶体，维生素C、E也有抗衰老作用。
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 令狐文艳 一、目的 1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程 二、实验原理： 1、电泳原理及影响电泳的主要因素 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2） V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)
由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触
的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。 最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。最常见的为0.05。 在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝ 1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。 2、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
酯酶同工酶电泳 酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，目前已发现的酯酶至少有20种。植物酯酶同工酶的分离技术多采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要操作步骤介绍如下。 一、试剂 按表1配制贮液和工作溶液---表1 贮液和工作溶液配制用量 注：贮液放在冰箱中一般可保存1～2月，3号贮液只能保存1周。 Acr=丙烯酰胺，Bis=甲叉双丙烯酰胺，TEMED=四甲基乙二胺，Tris=三羟甲基氨基乙烷。
二、制胶 1、由于电泳槽的构造因厂家不同而有所差异，可按电泳槽所附说明书组装好胶板。 2、按上表配制好分离胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间，至板顶3cm即可；然后沿着玻璃板壁缓慢加入3～5mm蒸馏水层。刚加水时看出有界面，后逐渐消失；等到再看到界面时表明凝胶已经聚合（一般约30分钟）；再静置30分钟使聚合完全。 3、用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液。按上表配制好浓缩胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间以冲洗分离胶的顶部。迅速吸出，立即灌注浓缩胶，当灌至凹型玻璃口3mm处停灌，立即插入样品梳，使凝胶液面高出玻璃1～2mm。然后在距日光灯管10cm处照射进行光聚合。当看到浓缩胶显乳白色（一般6～7分钟），表明聚合开始。继续半小时，使聚合完全。 三、电泳 1、样品提取 取烟苗0.2克，加0.5毫升提取缓冲液（含0.075M Tris-HCl，pH7.5，0.01M KCl，0.01M MgCl ，0.001EDTA，5%蔗糖，0.1%巯基乙醇，5%PVP- 2 聚乙烯基吡咯烷酮），冰块上研磨成匀浆，低温下12000rpm离心15分钟，取上清液置于冰箱中备用。提取缓冲液种类较多，这里介绍的提取缓冲液本实验室曾采用过，可据需要参看其他提取方法。
同工酶 同工酶的概念：具有相同底物，但电泳迁移率不同的酶。可来源于多个基因座或等位基因的表达，也可能是基因翻译后形成的。同工酶（isozyme，isoenzyme）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶 同工酶的结构与基因的关系：近三十年来，由于蛋白质分离技术的发展，人们从一种属或同一个体的不同组织或同一组织、细胞中发现有的酶具有不同的分子形式却催化相同的化学反应，这种差异是由于酶蛋白编码基因同，或者虽然基因相同，但基因转录产物 mR NA或者翻译产物经过不同的加工过程产生的。由酶蛋白编码基因不同而产生的同工酶称原级同工酶 I由基因转录产物mR NA或者其翻译产物经过不同的加工过程产 生的同工酶称次级同工酶。原级同工酶又称基因型同工酶原级同工酶可分为多基因位点同工酶和复等位基因同工酶。
1 ．多基因位点同工酶有的同工酶是由多基因位点编码，即同工酶的结构可能由两个或两个以上不同基因位点所决定。一个基因位点编码一个多肽链中氮基酸顺序，不同的基因位点编码不同的多肽链，它们就形成了各自的同工酶。这些不同的基因互相独立，受不同的因素控制，可以不同时表达。各组织的表达也有不同，导致组织同工酶谱的特异性。多基因位点编码的同工酶可以形成纯聚体或杂交体。如L D H 同工酶，由 B亚基和 A亚基可以形成纯B型或纯 A型四聚体，而 B型和 A型棍台可产生另外三种类型杂交体多基因位点的同工酶电泳行为不同，并且常有不同的免疫特性。 2 ．复等位基因同工酶( 或称等位基因同工酶) 有些同工酶由等位基因编码，即在许多个体组成的群体中，在某一个基因位点上常存在许多不同的等位基因，这往往是通过突变产生。突变使构成基因的 DNA上碱基对发生改变，因此，编码的酶蛋白在一级结构上可表现某些个体差异、即不同的基因型造成不同的表现型。 乳酸脱氢酶（LDH）是最早发现的一种同工酶，从其电泳图谱分析，DLH有5种同工酶分别为DLH1 DLH2 DLH3 DLH4 DLH5。DLH含有α和β两种亚基他们分别有两个基因生产在人体的DLH中，α亚基由第12号染色体的基因位点B产生，β由第11号染色体的基因位点A 产生，DLH为一四聚体蛋白，有5种同工酶，分别由不同亚基组成。
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离 苟亚峰 摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。 关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离 引言 同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。 电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
一、实验课题: 蝗虫酯酶同工酶 二、文献综述： 对锥头蝗科、斑腿蝗科、剑角蝗科和斑翅蝗科９种蝗虫进行了酯酶同工酶分析．通过生化特征，探讨较高级分类阶元之间的差异，研究结果表明，９种蝗虫共显现２６条酶带，种间没有出现共同酶带，不同科样品之间酶谱差异很大，显而易见，同属不同种间的相似性大于同科不同属种间的相似程度，后者又明显大于不同科种间的相似性。【1】以酶酯同工酶法进行同工酶的电泳实验可以得到同工酶酶谱，进而可以得到各种昆虫之间的亲属关系，为蝗虫的分类提供了快速有效的方法。【2】 【1】《9种蝗虫酯酶同工酶研究》（韩雅莉; 谭竹钧; 郑哲民内蒙古大学学报(自然科学版)） 【2】《酯酶同工酶多态性及其在昆虫分类学中的应用价值》（郭晓霞; 郑哲民; 于广志;昆虫知识2000年06期） 三、实验目的和要求： 1.了解酯酶同工酶的实验方法，掌握PAGE的基本原理。 2.了解蝗虫属种之间的相关性大小。 3.学会看并记录酶谱的相关现象和数据。 四、实验条件： 实验材料： 锥头蝗科：长额负蝗（大别山），短额负蝗（黄州） 斑翅蝗科：花胫绿纹蝗，疣蝗 剑角蝗科：中华蚱蜢 斑腿蝗科： 稻蝗亚科：中华稻蝗（黄州），山稻蝗（大别山） 蔗蝗亚科：斑角蔗蝗 黑蝗亚科：绿腿腹露蝗 秃蝗亚科：霍山蹦蝗 刺胸蝗亚科：棉蝗 仪器与试剂： 0.2mol/L Na2HPO4500ml：Na2HPO4?2H2O 17.81g（或Na2HPO4?12H2O 35.82g）， 加水至500ml； 0.2mol/L NaH 2PO 4 500ml：NaH 2 PO 4 ?H 2 O 13.80g（或NaH 2 PO 4 ?2H 2 O 15.60g），加水至500ml； 分离胶贮备液100 ml：1mol/L HCL 48ml，Tris 36.3g，加水至100ml，PH 8.9； 浓缩胶贮备液100 ml：1mol/L HCL 48ml，Tris 5.98g，加水至100ml，PH 6.7；
过氧化物酶同工酶电泳分析 实验原理 （1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 （3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。 下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用： （1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 （2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 （3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下： ①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。 ②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有
一、目的 由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。 最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快
电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.01～ 0.1mol/L之间。最常见的为0.05。 在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算： Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。 2、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。 聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T％表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、目的 1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程 二、实验原理： 1、电泳原理及影响电泳的主要因素 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2） V= E·q·a/6πrη(1) u= q·a/6πrη(2)
由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如p H的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。 最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0. 01～0.1mol/L之间。最常见的为0.05。 在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2(3) （3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过 氧化物酶同工酶 研究背景及目的 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP )。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业分析中必不可少的手段。 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。 实验原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面： （1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。 （3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。 下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用： （1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶 一、目的 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。 二、原理 1．电泳 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 2．影响电泳的主要因素 若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下： F引＝ E·q（1） 式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。 如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。故上述现象不会发生。根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度： F阻＝ 6πrηv (2) 式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此， E·q＝ 6πrηv (3) 将（3）式整理得：
过氧化氢酶和过氧化物酶的作用 一、实验目的 1.了解过氧化氢酶的作用，掌握常用的测定过氧化氢酶的方法。 2.了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法。 二、实验原理 氧化物酶是植物体内普通存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性(愈创木酚法)。 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系。过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 因此，可根据H2O2的消耗量或02的生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的H2O2的量。 三、仪器、原料和试剂 (一)测定过氧化氢酶 仪器722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，试管，吸管 原料 马铃薯块茎。 试剂 1.0.05mol/LpH5.5的磷酸缓冲液； 2.0.05mol/L愈创木酚溶液； 3.2％H2O2； 4.20％三氯乙酸。 （二）过氧化物酶活性的测定 仪器 研钵，三角瓶，酸式滴定管，恒温水浴锅，容量瓶； 原料 小麦叶片 试剂 1.10％H2SO4 2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液 3.0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO43.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定。 4.0.1mol/LH2O2：市售30％H202大约等于17.6mol/L，取30％H2O2溶掖 5.68mL，稀释至l000mL，用标准0.1mol/LKMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定。 5.0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4·2K2O12.607g用蒸馏水溶解后，定容至1000mL。