第29卷 第3期2010年 6月北京生物医学工程
Beijing Biomedical Engineering
Vol.29 No.3June 2010
基金项目：国家自然科学基金（30700152）资助
作者单位：空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，西北工业大
学生命院，特殊环境生物物理学研究所（西安710072）
作者简介：续惠云（1975—），女，副教授，主要从事失重骨丢失细胞
学机制研究
通信作者：商澎。E?mail ：shangpeng@https://www.doczj.com/doc/0f16004481.html,
流体剪切力对骨组织细胞作用的研究进展
续惠云 瓮媛媛 安龙 张健 商澎
摘 要 骨组织细胞包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和骨衬细胞。在体内生理条件下，流体剪切力可能是这些细胞受到的最主要的力学刺激。近年来对流体剪切力影响骨组织细胞的研究取得了较大的进展，相关研究主要集中在流体剪切力引起骨组织细胞的细胞内信号分子、细胞内钙信号、细胞间隙连接和细胞骨架系统改变这几个方面，同时，流体剪切力会引起骨组织细胞间的相互作用的改变。本文就这些方面的重要研究内容做简要综述。
关键词 流体剪切力；骨组织细胞；信号分子；间隙连接；细胞骨架DOI ：10.3969/j.issn.1002-3208.2010.03.22.
中图分类号 R318.01 文献标志码 A 文章编号 1002-3208（2010）03-0318-05
Progress in Effects of Fluid Flow Shear Stress on Bone Cells
XU Huiyun ，WENG Yuanyuan ，AN long ，ZHANG Jian ，SHANG Peng
Key Laboratory for Space Bioscience and Biotechnology ，Institute of Special Environmental Biophysics ，
Faculty of Life Sciences ，Northwestern Polytechnical University ，Xi ’an 710072
【Abstract 】 Bone cells include osteoblasts ，osteoclasts ，osteocytes and bone lining cells.In vivo
physiological conditions ，the most important mechanical stimulation that bone cells underwent is fluid shear stress.In recent years ，research on effects of fluid shear stress on bone cells has made great progress.Current experiments are focusing on the changes in signal molecules ，intracellular calcium ，gap junction and cell cytoskeleton.Also fluid shear stress could cause some changes in the interaction of bone cells.This paper
reviews the progress of the studies in this field.
【Key words 】 fluid shear stress ；bone cell ；signal molecule ；gap junction ；cell cytoskeleton
0 引言
骨组织是体内主要起力学支撑作用的器官，需要不断调节自身结构来适应环境变化。但是骨组织对外界力学刺激怎样产生和产生了什么样的反应，目前仍然不是太明确。现有的研究认为，在体内正常的生理状态下，力学刺激会对骨组织内组织液施加压力，造成骨陷窝-骨小管系统间隙液的流动，从而对骨组织细胞的细胞膜产生流体剪切力。理论模
型计算得出生理状态下骨陷窝-骨小管系统内的流
体剪切力约为0.8耀3Pa ［1］
。
这种流体剪切力可能是骨组织细胞生理条件下受到的最主要的机械刺激。在整个骨组织中，成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和骨衬细胞都有感受机械刺激并将其转化为生物化学信号的能力。并且，信号可以在骨组织细胞间传递，引起细胞功能的改变，从而维持骨形成和骨吸收之间的平衡。失重后骨丢失及地面人群的废用性骨质疏松等问题都与骨组织细胞对流体剪切力感受性的降低有关，这种感受的下降引起了一系列信号传递的改变，从而造成了骨吸收与骨形成之间稳态的丧失。
由于体内研究比较困难，目前很多研究都是建立在体外模型的基础上在细胞水平上进行的，采用的流体剪切力的方式主要有单向流（unidirectional
fluid flow，UFF）和振荡流（oscillatory fluid flow，OFF），单向流又包括稳定流（steady fluid flow）和脉动流（pulsating fluid flow，PFF）两种。本文主要综述近年来流体剪切力对骨组织细胞作用的研究进展，其中又以对成骨细胞和骨细胞的研究比较多见。
1 流体剪切力与细胞内信号分子
流体剪切力处理会引起骨组织细胞内一系列的生物化学信号分子的改变。其中对流体剪切力处理后骨组织细胞一氧化氮（NO）和前列腺素（PG）分泌的研究比较多，多数研究认为流体刺激会增加骨组织细胞分泌NO和PG，并且由于这两种分子可能在流体刺激后几分钟就能出现，且与流体刺激有一定剂量依赖关系。所以，目前也有研究者将这两种分子作为骨组织细胞对流体剪切力处理后相关反应的一种评价指标［2-6］。如果先用透明质酸酶预处理骨细胞MLO?Y4，则流体诱导的前列腺素E（PGE）产生会被抑制。因此骨细胞中PGE对流体的反应可能与细胞外基质成分引起的信号传递有关［7］。
环氧化酶2（cox-2）作为体内一种诱导型的催化生成PG的合成酶，在流体诱导PG的产生过程中起了重要的作用。Klein?Nulend等的研究显示流体刺激能快速诱导成骨细胞中cox-2mRNA的表达和PG的产生［8］。单向流和振荡流都可以诱导成骨细胞cox-2和骨桥蛋白合成的增加，诱导骨细胞骨桥蛋白表达水平的改变。振荡流处理24h能引起骨细胞cox-2表达的上调［9］。另外，Runx2（即core binding factor alpha1，或Cbfa1）是成骨细胞分化的关键调节因子，参与调节多种成骨细胞分化的基因，比如可以结合到cox-2基因的5′端，介导骨形成蛋白BMP-2对cox-2的诱导［10］。突变Runx2基因的位点能够降低成骨细胞中流体对cox-2基因表达的诱导。除了对cox-2表达的调节，Runx2还可能参与了流体刺激引起的骨组织细胞代谢中多个基因的调节［11］。Arnsdorf等对骨髓间充质干细胞C3H10T1/2进行振荡流体刺激，也发现诱导了Runx2等的上调［12］。
此外，流体剪切力能诱导成骨细胞中核因子κB （nuclear factor?kappa B，NF?κB）分子的转位，从而引起一系列下游信号的改变，NF?κB对于流体诱导的cox-2增加是必要的［13］。2 流体剪切力与细胞钙信号
有学者认为，成骨细胞对力学刺激的最初反应是细胞内钙的快速增加，包括细胞外钙内流和内钙释放。对细胞内钙信号的研究常与对其他细胞内信号分子的研究联系在一起，研究也比较多，但相关研究结果并不一致，可能与所选用的细胞及流体处理的种类和条件等有关。
Jacobs等用钙离子反应作为指征，研究了几种不同流体模式下成骨细胞的反应。结果显示，振荡型流体比起稳定流和脉动流是一种更温和的力学刺激。另外，钙反应随着流体处理频率的增加而降低［14］。Donahue等的研究认为振荡流体处理成骨细胞，会引起内钙含量和PGE产生的增加，这种对流体的反应与化学物质的运输（包括营养供应和废物去除）有关，在流体处理过程中去除营养物质会引起钙离子和PGE产生的抑制，而流动速率的增加会引起钙反应细胞比例和PEG产生的增加［15］。Batra等研究了在流体处理中间插入停顿时间对成骨细胞反应，结果表明与连续振荡流体处理相比，成骨细胞每10个振荡流体刺激后，加5耀15s不等的停顿时间，可以大幅提高细胞的内钙释放，同时，PGE的分泌和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达水平也会增加［16］。
目前，对膜上钙相关通道在流体处理中的作用进行了一些研究，结果大多认为某些种类的钙通道与流体处理引起的信号分子反应有关，也就说明外钙内流在其中起了一定的作用。Liu等的研究结果发现，流体剪切力能引起成骨细胞MC3T3-E1中细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal?regulated kinase，ERK）的磷酸化，L-型电压敏感的钙通道（L?voltage sensitivity calcium channel，L?VSCC）和应力敏感的阳离子通道（mechanosensitive cation channels，MSCC）抑制剂能阻断这个过程，同时，添加外源的ATP能模拟流体剪切力引起的ERK1/2的活化效应，因此，他们认为流体剪切力引起的ERK1/2的磷酸化需要钙离子依赖的ATP的释放［17］。Li等的研究也表明阻断MSCC和L?VSCC 两种钙通道能明显降低流体刺激后ERK1/2的磷酸化，抑制L?VSCC还能明显减弱大鼠和小鼠体内流体刺激后的骨形成［18］。Genetos研究也表明流体处理能在1min内诱导ATP的增加，且这种增加能被
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L?VSCC抑制剂所抑制［19］。而Hung等的研究则显示L?VSCC的阻断剂对流体反应没有影响，但氯化钆，一种MSCC阻断剂，能部分抑制流体反应［20］。
同时，内钙释放在骨组织细胞受到流体刺激后的作用也有相关研究。Hung等的研究认为三磷酸肌醇（inositol1，4，5-triphosphate，IP3）诱导的内钙释放参与了流体诱导的钙离子反应［20］。Reich等的研究显示IP3的增加与流体剪切力诱导成骨细胞中两种重要信号分子PGE和NO的分泌有关，同时，流体诱导PGE的合成受到钙离子通路上另一重要分子蛋白激酶C（PKC）的调控，加入PKC的抑制剂能强烈抑制PGE的产生［21］。但Wadhwa等的研究显示抑制蛋白激酶A（PKA）而不是PKC通路会影响流体诱导的成骨细胞中cox-2的表达［5］。Saunders等研究则认为PGE的释放不依赖于细胞内钙信号［22］。此外，Chen等的研究显示阻断外钙内流对流体诱导成骨细胞中NF?κB分子的转位没有影响，加入细胞内钙离子的螯合剂或抑制磷脂酶C（PLC）诱导的内钙释放会完全抑制这种转位。因此，内钙释放而非外钙内流在其中起了一定的作用［13］。
3 流体剪切力与细胞间隙连接
间隙连接在骨组织细胞感受流体刺激并在细胞间传递这种信号过程中起了重要的作用，对此也有一些研究结果。Thi等的结果显示流体刺激能破坏间隙连接蛋白Cx-43、Cx-45、ZO-1等在膜上的分布，不同的剪切力水平会引起间隙连接蛋白表达和细胞间偶联的改变［23］。Saunders等研究也认为连接蛋白形成的半通道能作为流体诱导的胞内PGE2的出入口，而与胞内钙信号关系不大［22］。Cheng等的研究则显示流体诱导的间隙连接增强的过程可能部分地与PGE释放到条件培养基中的自分泌过程及cox-2的表达有关［24］。
流体诱导的剪切力还能引起间隙连接蛋白Cx?43从核周向胞质和树突中分布的改变，流体刺激后的初始30min Cx-43表达增加，但在24h后表达会降低。而对于成骨细胞2T3则没有观察到这种现象。间隙连接还可能作为骨细胞在流体刺激后信号传递的通道，流体处理后引起细胞间联系的迅速增加，且与流体强度成一定比例［25］。4 流体剪切力与细胞骨架系统
细胞骨架系统被认为是能对骨组织细胞应对流体剪切力产生反应的细胞元件之一，且细胞骨架对流体的反应与细胞内信号分子相互影响。
Han等建立了骨细胞突触的3D模型，他们认为相对细胞体而言，骨细胞突触更可能是对流体刺激产生反应的部位，且这种反应与细胞外基质及细胞骨架的改变有关［26］。成骨细胞中NO对流体的反应伴随着微丝应力纤维丝的调节，而PGE的反应则与黏着斑形成相关。骨架破坏对流体处理后成骨细胞的PGE生成是增强，对骨细胞则是抑制，这可能与两种细胞中骨架分布和表达的不同有关，也可能与骨架调节离子通路有关，骨细胞比成骨细胞更依赖于微丝及其介导的离子通路对信号的转导［27］。Ponik等比较了骨细胞和成骨细胞对单向流和振荡流两种流体模式的不同反应。对成骨细胞来讲，单向流1h就能引起微丝应力纤维形成，而对振荡流的反应要5h以上，骨细胞则在24h的单向流刺激后应力纤维增加［9］。Myers等的结果则表明流体处理后，I型胶原和MMP1和MMP3的mRNA表达上调，破坏微管骨架可以完全抑制这种上调，而破坏微丝骨架对此没有影响。因此，作者认为流体诱导的与细胞外基质相关的信号传递主要与微管有关［28］。对骨髓间充质干细胞C3H10T1/2的研究表明，微丝骨架系统对于流体诱导的基因表达是必要的［12］。吴昌敬等人的研究也显示微丝骨架的完整性对于流体剪切力诱导成骨细胞COX-2mRNA和蛋白的表达是必要的［29］。
流体处理后，与原代培养的单个骨细胞（没有细胞间连接）进行比较，原代的单个成骨细胞产生了更多的钙反应。用GRGD短肽预处理能明显降低成骨细胞的钙反应，而对骨细胞的钙反应没有影响。两种细胞对流体反应的不同可能与成骨细胞有更多的黏着斑分布表达有关［30］。
但也有一些研究结果认为骨组织细胞对流体的反应与细胞骨架系统无关。Chen等的研究显示破坏微丝和微管对NF?κB分子的转位都没有影响［13］。Malone等的研究也显示振荡流体没有对MC3T3-E1的F-肌动蛋白应力纤维产生影响，细胞松弛素D处理不能抑制流体诱导的细胞内钙的释放，PGE的释放则在细胞松弛素D处理后反而增
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加了三倍［31］。Norvell的研究也显示破坏成骨细胞MC3T3-E1中的微丝、微管和中间纤维，对剪切力诱导的PGE和前列腺素I（PGI）的释放都没有什么影响。破坏成骨细胞中的中间纤维，而不是破坏微丝和微管能够影响cox-2的表达，但中间纤维在流体剪切力诱导的细胞反应中起了什么作用，相关的研究还十分少见［32］。
另外，作为一种特化的骨架结构，初级纤毛在成骨细胞和骨细胞感受流体刺激中起了一定的作用。减少纤毛数量能够降低流体诱导的骨细胞中PGE2、cox-2的表达和骨保护素/核因子活化因子受体配体（OPG/RANKL）的比率，以及成骨细胞中OPN和PGE的表达。但是流体引起的钙离子变化并不依赖于初级纤毛［33］。
5 流体剪切力对骨组织细胞间的相互作用在体内，骨组织细胞间能够通过细胞间隙连接和旁分泌因子等相互作用，流体剪切力作用后应该对此产生一定的影响，但相关的研究还不太多见。Vezeridis等的研究显示流体处理以后的骨细胞条件培养基能通过可溶性因子抑制成骨细胞的增殖同时刺激其分化，且这些可溶性因子的释放至少部分地依赖于NO的生成［34］。
另外，流体处理骨髓基质细胞ST2和单核细胞RAW264.7共培养系统2h，降低了破骨细胞的形成，引起RANKL表达的下降和OPG的明显增加，RANKL/OPG迅速降低，表明流体也可能通过抑制破骨细胞的形成来调节骨重建过程［35］。
6 总结和展望
综上所述，在正常生理条件下，骨组织细胞能够感受流体剪切力并引起一系列下游的信号传递过程。目前的问题在于，首先，由于研究者们选用的流体模型和骨组织细胞各不相同，实验的条件不一致，因此得到的结果也不相同，甚至有相互矛盾的结论。其次，相关研究大多局限于几种常见的信号分子，没有在完整的信号传递通路方面形成系统研究。另外，多数研究集中在成骨细胞和骨细胞，对破骨和骨衬细胞的研究比较少见。在今后的研究中，对于流体剪切力处理后骨组织细胞确切的细胞学反应还需要进行进一步的深入探讨。同时，流体剪切力对骨组织细胞间相互作用的研究有待加强。
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·北京生物医学工程 第29卷
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安 全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞 接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻 拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消
化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁， 呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例 传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml 全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合 时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及 生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。 取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
32学时流体力学课复习题 一、填空题 1、流体是一种受任何微小的剪切力作用时都会产生连续变形的物质。 2、牛顿内摩擦定律=μ其中的比例系数称为 3、作用于流体上的力按其性质可以分为力和质量力 4、水力学中，单位质量力是指作用在单位_质量_ 液体上的质量力。 5、单位质量力的量纲是L/T2。 6、对于不同的流体，体积弹性系数的值不同，弹性模量越大，流体越不易被压缩。 7、某点处的绝对压强等于该处的大气压强减去该处的真空度。 8、某点处的真空等于该处的大气压强减去该处的绝对压强。 9、某点处的相对压强等于该处的绝对压强减去该处的一个大气压。 10、根据粘性的大小，粘性流体的流动状态可分为层流和紊流。 11、根据流体是否有粘性，流体可分为粘性流体和理想流体。 12、根据流动参数随时间的变化，流体流动可分为定常流动和非定常流动。 13 14 15、计算局部阻力的公式为：；计算沿程阻力的公式为：。 16、相似条件包括几何相似、运动相似和动力相似。 17、而局部阻力则主要是由于流动边界局部形状急剧变化引起的。 18、连续性方程表示控制体的__质量_____守恒。 19、液体随容器作等角速度旋转时，重力和惯性力的合力总是与液体自由面_垂直。 20、圆管层流中断面平均流速等于管中最大流速的1/2 二、简答题 1、简述液体与气体的粘性随温度的变化规律，并说明为什么？ : 温度升高时液体的黏性降低，因为液体的粘性主要是分子间的内聚力引起的，温度升高时，内聚力减弱，故粘性降低，而造成气体粘性的主要原因在于气体分子的热运动，温度越高，热运动越强烈，所以粘性就越大 2、请详细说明作用在流体上的力。 作用在流体上的力按其性质可分为表面力和质量力，表面力是指作用在所研究流体表面上的力，它是由流体的表面与接触的物体的相互作用差生的，质量力是流体质点受某种力场的作用力，它的大小与流体的质量成正比 3、简述连续介质假说。 连续介质假设将流体区域看成由流体质点连续组成，占满空间而没有间隙，其物理特性和运动要素在空间是连续分布的。从而使微观运动的不均匀性、离散性、无规律性与宏观运动的均匀性、连续性、规律性达到了和谐的统一。（宏观无限小微观无限大） 4、何谓不可压缩流体？在什么情况下可以忽略流体的压缩性？ 除某些特殊流动问题，工程实际中将液体看作是密度等于常数的不可压缩流体，当气体的速度小于70m/s 且压力和温度变化不大时也可近似地将气体当做不可压缩流体处理
细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
（流体力学）流体的受力分析 第一部分? 流体的受力分析 (一) 静力学的研究内容 研究流体在外力作用下处于静止状态时的力学规律。通过受力分析可知：静力学主要是获得静止状态下的压强，即静压强。进一步把面积考虑进去，获得与流体相互作用的固体壁面所受到时的流体作用力。 (二) 控制体的选择 1. 控制体的定义 流场中，用几何边界所围成的固定空间区域称为控制体，它是流体力学的研究对象． 流体静力学中，把控制体又称为隔离体． (三) 流体的受力 控制体中流体质点的受力总体上可分为表面力和质量力两类． 1. 表面力（Surface Force） (1) 定义 通过接触界面作用于控制体中流体质点上的力称为表面力，又称之为接触力．如一容器内盛有水，其中壁面对所盛流体的约束力及作用于液体自由表面的大气压力等都均属于表面力 (3) 实质 ?? 虽然质量力属于“力”的概念，而加速度属于“运动”的概念，但单位质量的质量力就是加速度，在这里＂动＂与＂力＂合二为一． (四) 静止状态及静止状态时的受力分析 1. 静止状态 (1) 含义
相对于所选定的坐标系，流体不移动、不转动及不变形，称为静止状态或平衡状态。 (2) 分类 A. 绝对静止：相对于惯性坐标系，如地面，流体处于静止状态； B. 相对静止：相对非惯性坐标系，流体处于静止状态。 2. 静止状态时的受力分析 (1) 表面力：流体处于静止状态时，内部无相对运动，则流体内部各处切应力为零，流体不呈现出黏性，即表面力中只存在压强。 (2) 质量力：若处于重力场下，单位质量力为重力加速度；若还处于惯性力场下，则单位质量力还应包括惯性加速度等。一般不考虑电磁场作用。 (五) 静压强 1. 含义 流体处于静止状态下所受到的压强，称为静压强，区别于流体运动状态下的所谓动压强。 2. 实质 静压强实际上是流体所受的表面力中的法向应力。 (六) 静压强特性 1. 存在性与方向性。静止流体所受表面力中只存在静压强，其方向总是垂直于作用面，并指向流体内法线方向。 [注意]? 液体自由表面上的表面张力是例外。 2. 各向等值性。静止流体中任一点的压强值在空间各方位上，其大小均相等，它只与该点空间位置有关。
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
第一章流体及其物理性质 1．试述流体的定义，以及它与固体的区别。 2．与气体有哪些共同的特性？它们各有什么不同的特性？试分别举例说明，在空气和水中相同与不同的一些流体力学现象。 3．何谓连续介质？引入连续介质模型的目的意义何在？ 4．流体的密度、比容以及相对密度之间有何关系？这三者的单位如何？ 5．流体的压缩性与膨胀性可以用哪些参量来描述？ 6．完全气体的状态方程是什么？请说明方程中每一个参量的意义。 7．何谓不可压缩流体？在什么情况下可以忽略流体的压缩性？ 8．何谓流体的粘性？流体的粘度与流体的压强和温度的关系如何？ 9．流体的粘性力与固体的摩擦力有何本质区别？ 10．试述牛顿内摩擦定律，根据此定律说明，当实际流体处于静止或相对静止状态时，是否存在切向应力？11．何谓理想流体？引入理想流体模型的意义何在？ 12．试述表面张力的定义，及其产生表面张力的机理。 13．何谓附着力，何谓内聚力？试分析水和水银在毛细管中上升或下降的现象。 14．作用在流体上的力可以分为哪两种？ 第二章流体静力学 1．试述流体静压强的两个重要特性。 2．静力学的全部内容适用于理想流体还是实际粘性流体？或者两者都可？为什么？ 3．何谓流体的平衡状态与相对平衡状态？它们对应的平衡微分方程有何相同之处与不同之处？ 4．试写出欧拉平衡微分方程式，叙述该方程的适用范围以及方程中每一项的物理意义。 5．何谓质量力有势？试写出重力的势函数。 6．不可压缩流体处于平衡状态时，对作用在它上面的质量力有什么要求？ 7．试写出静止流体的压强差公式，并叙述其物理意义，此公式对于相对静止流体是否适用？ 8．试写出静止流体的等压面的微分方程式，此方程式对于相对静止流体是否适用？ 9．试述等压面的重要性质。 10．流体静力学的基本方程式的物理意义和几何意义各是什么？ 11．何谓绝对压强、计示压强与真空？它们之间有何关系？ 12．静压强的计量单位有哪几种？它们的换算关系如何？ 13．在一U型管中，盛有两种不相溶的、不同密度的液体，试问，在同一水平面上的液体压强是否相同？为什么？ 14．叙述帕斯卡原理，试举例说明它在工程中的应用。 15．相对平衡液体的静压强分布规律，是否满足静力学基本方程？为什么？ 16．液体随所在圆柱形容器，绕轴作等角速度旋转后，液面将发生怎样的变化？它与旋转角速度有什么关系？变化后液面各点的静压强是否相同？为什么？ 17．相对平衡的液体的等压面形状与什么因素有关？ 18．试写出静止液体作用在平面上和曲面上的总压力计算公式。 19．一般情况下，平面图形的压力中心D为什么总在其形心C的下方？在什么情况下，这两者重合。20．何谓压力体？压力体由哪些面围成的？
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
表面力：又称面积力，是毗邻流体或其它物体，作用在隔离体表面上的直接施加的接触力。它的大小与作用面积成比例。剪力、拉力、压力 质量力：是指作用于隔离体内每一流体质点上的力，它的大小与质量成正比。重力、惯性力 流体的平衡或机械运动取决于： 1.流体本身的物理性质（内因） 2.作用在流体上的力（外因） 流体的主要物理性质： 密度：是指单位体积流体的质量。单位：kg/m3 。 重度：指单位体积流体的重量。单位： N/m3 。 流体的密度、重度均随压力和温度而变化。 流体的流动性：流体具有易流动性，不能维持自身的形状，即流体的形状就是容器的形状。静止流体几乎不能抵抗任何微小的拉力和剪切力，仅能抵抗压力。流体的粘滞性：即在运动的状态下，流体所产生的阻抗剪切变形的能力。流体的流动性是受粘滞性制约的，流体的粘滞性越强，易流动性就越差。任何一种流体都具有粘滞性。 牛顿通过著名的平板实验，说明了流体的粘滞性，提出了牛顿内摩擦定律。 τ=μ(du/dy) τ只与流体的性质有关，与接触面上的压力无关。 动力粘度μ：反映流体粘滞性大小的系数，单位：N?s/m2 运动粘度ν：ν=μ/ρ 流体静压强具有特性 1.流体静压强既然是一个压应力，它的方向必然总是沿着作用面的内法线方向，即垂直于作用面，并指向作用面。 2.静止流体中任一点上流体静压强的大小与其作用面的方位无关，即同一点上各方向的静压强大小均相等。 静力学基本方程: P=Po+pgh 等压面：压强相等的空间点构成的面 绝对压强：以无气体分子存在的完全真空为基准起算的压强 Pabs 相对压强：以当地大气压为基准起算的压强 P P=Pabs—Pa（当地大气压） 真空度：绝对压强不足当地大气压的差值，即相对压强的负值 Pv Pv=Pa-Pabs= -P 测压管水头：是单位重量液体具有的总势能 基本问题： 1、求流体内某点的压强值：p = p0 +γh； 2、求压强差：p – p0 = γh ； 3、求液位高：h = （p - p0）/γ 平面上的净水总压力：潜没于液体中的任意形状平面的总静水压力P，大小
名词解释： 1.群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。是由于表示群体细胞指数生长期内细胞分裂活动的程度，是判断细胞生长是否旺盛的重要指标。 2.接触抑制（contact inhibition）：细胞相互接触后失去运动的现象。 3.密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多和生存空间消失所引起的细胞增殖的抑制现象。 4.肿瘤干细胞(tu mor stem cells，TSC)表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能。TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。 5.细胞汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 6.饱和密度(Saturation density)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细 胞悬液内可达到的最大细胞数。 7.二倍体细胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。 8.二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。 9.组织工程：是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 10.细胞融合(Cell fusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。 11.细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 12.三维培养：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。 13.平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）：简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。兼具缓冲和调节溶液的酸碱度、维持渗透压、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。 14.生长基质（growth substratum）：培养器皿表面包被的一层能改善生长表面的特性，促进细胞粘附和贴壁的物质。 15.去分化（dedifferentiation）：指已成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。 16.消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。 17.消毒 disinfection 杀死物体上病原微生物的方法。 灭菌 s terilization 杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 18.转化细胞系：指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定的表型改变的细胞系。 19.杂交瘤技术：又称单克隆抗体制备技术，是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴 细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。 20.指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 21.干细胞：是指具有无限或较长期的自我更新能力、多种分化潜能和高度增殖能力的细胞。 22.全能干细胞，如ES细胞。全能干细胞可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的 各种组织和器官。
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。