遗传学公司的β淀粉样蛋白（Aβ）的强大功能，灵敏度HS（）ELISA检测试剂盒是专门为科研目的而设计的。这些产品的特点是由一种改进的25皮克的肽/毫升使高度敏感的Aβ的检测和Abeta 肽水平的精确定量的样品，如细胞培养上清，细胞裂解物或初级神经元在各种最低检出限。我们测试的可靠性和精确度这两个关键功能，同时还解释了为什么它是目前使用的范围从大型制药公司和生物技术公司，以及世界各地的学术研究团体的研究人员。
我们的科兴酶联免疫吸附试验的主要特征总结我们的产品数据表，而进一步的信息有关检测程序和工作时间，测试内容，故障排除和相关的问题是在我们的产品手册。
描述：TK40HSAβ40肽的样品中类似细胞裂解物或细胞培养上清，使用具有高度选择性和特异性的单克隆抗体，在一个灵活的96孔格式的定量
TK42HSAβ42的类似细胞裂解物或细胞培养上清样品中的肽，使用具有高度选择性和特异性的单克隆抗体，在一个灵活的96孔格式的定量
TKHS - 设置为了定量样品中类似细胞裂解物或细胞培养上清中的Aβ40和
Aβ42肽使用高度的选择性和特异性的单克隆抗体，在一个灵活的96孔格式
β－淀粉蛋白的研究进展 阿尔茨海默病（AD）是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理变化是老年斑、神经原纤维缠结和神经元缺失等。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Ａβ)是老年斑的主要成分，本文就Ａβ的来源、分子结构特点、毒性作用机理及其靶位治疗AD等方面研究进展综述如下。 1 淀粉样前体蛋白及Aβ的分子结构特点 淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)为一个选择性的夹板样半单螺旋形的跨膜蛋白，长的等位体包含有770个氨基酸，由２个外显子构成，可在大多数组织中表达。短的等位体含有695个氨基酸，主要在大脑组织中表达。除此之外，还有几个少见的等位体。这些未成熟的APP到达细胞表面前，在高尔基体经过一个复杂的代谢过程即Ｏ－及Ｎ－端糖基化及磷酸化，Aβ是从APP的第672到711位残基间裂解产生的片段。包含了Aβ的细胞外区的最后28个残基及跨膜区的14个残基（分别由16、17外显子编码）。正常情况下APP主要是由α－分泌酶与γ－分泌酶共同切割，产生非致病性的片段P3，不会形成Ａβ。而当编码APP的基因发生突变或其他原因导致β－分泌酶活性异常增高时，APP 则容易被β－分泌酶与γ－分泌酶共同切割产生Ａβ。Ａβ主要包括Ａβ40和Ａβ42两种分子，由39~43个氨基酸组成。Aβ42较Aβ40疏水性强，更易聚集[1]。 2 Aβ毒性作用机理 Ａβ在脑中的沉积是AD患者主要的病理变化，它在AD发生发展中起着非常重要的作用，现已证实了它的神经毒性。关于Ａβ的作用神经生物学家曾经有两种观点，一种观点认为Ａβ沉淀可引起患者神经组织退化；另一种观点则认为Ａβ沉淀形成老年斑仅仅为神经细胞损伤导致的结果，而不是发病的先决条件[2，3]。近年来，大多数研究[4]认为，Ａβ毒性机理与氧自由基引起的氧化应激、细胞内钙稳态失调以及由此引起的细胞凋亡有关。 2.1 Ａβ与氧自由基代谢：Ａβ可通过诱导脑神经细胞产生氧自由基，自由基形成后即可引起神经细胞脂质过氧化，自由基及脂质过氧化的某些降解产物可以氧化修饰亚细胞结构并对生物大分子造成氧化损伤，从而影响神经细胞膜的结构与功能，引起神经组织的一系列病理生理变化。
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
淀粉类食物 所谓淀粉类食物，主要指富含碳水化合物的食物，以及根茎类蔬菜。富含碳水化合物的食物有大米、玉米、小麦等，根茎类蔬菜则包括土豆、山药、薯类等。此外，各种豆类和香蕉等含淀粉比较多的水果也包括在淀粉类食物中。 编辑本段常见的淀粉类食物 谷类、面类(米饭、米粉、凉粉、汤圆、年糕、麦片、面包、馒头、包子、水饺皮、馄饨皮、面条、烙饼、蒸饺、玉米、蛋糕、饼干、马拉糕、凤片糕、萝卜糕、芋头糕....) 根茎类食物(马铃薯、芋头、地瓜，南瓜、莲藕.....) 豆类(豌豆、绿豆、红豆....) 淀粉含量高的水果(香蕉、大蕉、苹果、枣、桃子.....) 高热量水果: 瓜类水果、榴莲、荔枝、龙眼...... 编辑本段对人体的益处 淀粉类食物: 吃淀粉类食物可抑制肠癌研究人员指出，淀粉类食物主要通过两种方式抑制肠癌：一是当淀粉进入肠道后，经一系列反应有助于增加粪便，促使结肠排泄，加速致癌代谢物排出体外：二是淀粉在肠内经发酵酶作用，会产生大量的丁酸盐。实验证明，丁酸盐是有效的癌细胞生长抑制剂，它能够直接抑制六肠细菌繁殖，防止大肠内壁可能致癌的细胞产生。 编辑本段如何选择含淀粉的食物 在生活中应如何选择淀粉类食物呢?除了烙饼、米饭等主食以外，用荞麦做成的面条、凉粉、蒸饺等也是不错的选择。此外，对于忙碌的上班族来说。超市中粗加工未经去除谷皮的全谷食物，如谷类面包应是首选。购买谷类面包时要注意识别：如果成分表的第一位就是谷类，说明它的谷类含量的确丰富；如果谷类成分排在其他成分或者糖的后面，说明这种食物里谷类成分不多。还有一个方法是：用手拿着面包。如果感觉面包密实紧凑，有明显的麦粒，就是谷类含量丰富的面包。富含B族维生素、维生素E的五谷杂粮粥，比如腊八粥、八宝莲子粥、荷叶粥等则更适合中老年人食用。 吃主食会加速衰老吗 什么叫主食？主食就是主要提供淀粉的这样一些食物。因此，我们可以说，米是主食，面是主食，土豆、红薯也是主食，红豆、绿豆都是主食，只要含淀粉的统统都可以算。但是吃豆子和吃米一样吗？吃土豆跟吃馒头一样吗？这就不一定了，我们说淀粉和淀粉是不一样的。 为什么讲这件事？这还要从很多人的烦恼说起。现在天气越来越暖和，大家穿得越来越轻薄了，很多女士开始减肥大战了，减肥信息现在简直是泛滥成灾，但是万变不离其宗，里
测定蛋白质含量的三种方法原理 院系：xxx 专业：xxx 姓名：xxx 学号：xxx
测量蛋白质三种方法测定原理 【摘要】了解测量蛋白质三种测定方法的基本原理和优缺点。三种方法为考马斯亮蓝法（Bradford法），Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 【关键词】蛋白质含量测定考马斯亮蓝法 Folin－酚试剂法紫外吸收法 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法，即Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。简单列表为： 考马斯亮蓝法 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。它是一种蛋白定量法 （一）实验原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。 （二）Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这
蛋白质定量的五种方法 令狐采学 方法一双缩脲法测定蛋白质浓度 [目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理] 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 [操作] 取中试管7支，按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算] (一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。 (三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。 [器材] 中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。 [试剂] (—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 (二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加
水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。 (三)0.9％NaCl。 (四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。 (五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。 方案二Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 [目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作] 取试管7支、编号、按下表操作：
血清淀粉样蛋白A/C-反应蛋白测定试剂盒（荧光免疫层析法） 适用范围：用于体外定量测定人血清、血浆、全血（静脉血和指尖血）中血清淀粉样蛋白A和C-反应蛋白的含量。1.1包装规 格 卡型：1人份/袋、10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒； 卡盒型：20人份/卡盒、24人份/卡盒、48人份/卡盒。 1.2主要组成成分 卡型产品包含1/10/20/50人份血清淀粉样蛋白A/C-反应蛋白检测卡、 1/10/20/50支样品缓冲液（300μL/支）、1份二维码（内含校准信息），每人份试剂独立铝箔袋包装，内含1支检测卡和1包干燥剂。 卡盒型产品包含1卡盒（内含20/24/48人份检测卡及干燥剂、附有标曲信息）、1瓶样品缓冲液（50mL/瓶）。 检测卡由荧光垫（喷涂有荧光微球标记的鼠抗人血清淀粉样蛋白A和鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体混合物）、样品垫、硝酸纤维素膜（T1线包被鼠抗人血清淀粉样蛋白A；T2线包被鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体；C线包被羊抗鼠多抗体）、吸水纸、塑料载板组成。 样品缓冲液由0.1%的表面活性剂和0.1mol/L的Tris溶液（pH7.0）组成。 2.1物理性状 2.1.1外观 检测卡应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染；材料附着牢固；标签字迹清晰，无破损。样品缓冲液应清澈透明、无杂质、无絮状物。 2.1.2液体移行速度 液体移行速度应不低于10 mm/min。 2.1.3膜条宽度 检测卡的膜条宽度≥2.5mm。 2.1.4样品缓冲液装量 卡型：样品缓冲液体积应在标识体积的±5%以内。
卡盒型：样品缓冲液体积不少于标示值。 2.2空白限 血清淀粉样蛋白A的空白限应不高于5μg/mL，C-反应蛋白的空白限应不高于0.5μg/mL。 2.3重复性 分别检测高、中、低3个浓度的样本，CV(%)应不高于15.0%。 2.4批间差 用3个批号的试剂卡，分别检测2个浓度的样本，相对极差R应不高于15.0%。 2.5线性 血清淀粉样蛋白A在[5,150]μg/mL的范围内，线性相关系数应不低于0.990。C-反应蛋白在[0.5,100]μg/mL的范围内，线性相关系数应不低于0.990。 2.6准确度 检测血清淀粉样蛋白A国际标准品（92/680）、C-反应蛋白国际标准品（ERM DA-474/IFCC），相对偏差在±15%以内。 2.7 校准信息溯源性 应根据GB/T21415-2008提供校准信息的来源、赋值过程，血清淀粉样蛋白A溯源至国际校准品（92/680），C-反应蛋白溯源至国际校准品（ERM DA-474/IFCC）2.8稳定性 将试剂盒在4℃～30℃环境中放置至有效期18个月后，过有效期后3个月内，分别检测，结果应符合2.1、2.2、2.3、2.5、2.6的要求。
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐
食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法） 【按】最近，毒奶粉事件成为各方关注的焦点。为何不法奶农会往牛奶或奶制品中添加三聚氰胺呢？原因在于目前检验奶制品测定蛋白质方法上的缺陷——目前主要使用凯氏定氮法来检测。检测时，通过测量奶制品中氮元素的含量，然后将含氮量经过折算转化为蛋白质的含量，而不是直接测定奶制品中蛋白质的含量。这一方法给不法奶农制造了机会——通过往牛奶中加入含氮量高的三聚氰胺（含氮量达66%），从而提升牛奶及其制品的含氮量，从而冒充含高蛋白的奶制品。下面介绍如何利用凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量。 实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。仪器与试剂： 试剂——硫酸铜（CuSO4·5H20）、硫酸钾、硫酸（密度为1.8419g/L）、硼酸溶液（20g/L）、氢氧化钠溶液（400g/L）、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液、混合指示试剂（0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合）、食品样品。 仪器——微量定氮蒸馏装置 实验步骤： 1、样品消化：称取食品样品粉末约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL 凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL 浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL 水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤：检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数
A comparative study on the three quantitative methods frequently used in proteomics, 2D DIGE (difference gel electrophoresis), cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags) and iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification), was carried out. DIGE and cICAT are familiar techniques used in gel- and LC-based quantitative proteomics, respectively. iTRAQ is a new LC-based technique which is gradually gaining in popularity. A systematic comparison among these quantitative methods has not been reported. In this study, we conducted well-designed comparisons using a six-protein mixture, a reconstituted protein mixture (BSA spiked into human plasma devoid of（缺乏）six abundant proteins), and complex HCT-116 cell lysates as the samples. All three techniques yielded quantitative results with reasonable accuracy when the six-protein or the reconstituted protein mixture was used. In DIGE, accurate quantification was sometimes compromised due to comigration or partial comigration of proteins. The iTRAQ method is more susceptible to errors in precursor ion isolation, which could be manifested with increasing sample complexity. The quantification sensitivity of each method was estimated by the number of peptides detected for each protein. In this regard, the global-tagging iTRAQ technique was more sensitive than the cysteine-specific cICAT method, which in turn was as sensitive as, if not more sensitive than, the DIGE technique. Protein profiling on HCT-116 and HCT-116 p53 ?/? cell lysates displayed limited overlapping among proteins identified by the three methods, suggesting the complementary nature of these methods. Keywords: protein quantification ? DIGE ? cICAT ? iTRAQ ? 2D gel ? LC-MALDI TOF/TOF DIGE：荧光差异凝胶电泳 CICAT:同位素亲和标记 iTRAQ：同位素标记相对和绝对定量
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
血清淀粉样蛋白A(SAA) 血清淀粉样蛋白A(SAA)属急性时相蛋白，与临床最广泛使用的急性时相蛋白C-反应蛋白（CRP）相比较，有一个最重要的不同之处：病毒感染时SAA显着升高，而CRP在无细菌感染的病毒感染中不升高或仅在一个狭窄围范内也许有小幅升高。SAA对细菌感染和其它疾病急性期的敏感性也类似于CRP，但对不同种类疾病稍有不同。SAA 和 CRP 取长补短、互补应用为好。 一、SAA与病毒感染 十年前SARS（严重急性呼吸系统综合症Severe Acute Respiratory Syndro）流行，遇到疑似呼吸系统感染患者时，接诊医生期望立刻知道患者是否受病毒感染？是不是SARS冠状病毒？因此欧美临床实验室研究人员对疑似患者血液SAA测试项目做了大量研究，得出了以下结论：SAA在各种病毒和细菌感染时均增高，增高幅度反映疾病严重程度，而不反映病因，不能区分SARS还是非SARS患者(Clinical Chemistry 52, No. 6, 2006)。 国际上众多研究报告普遍认同SAA 和CRP现在已经是判断炎症活动性的最敏感指证，而在病毒感染和肾移植排斥上，已证实SAA比CRP更为有用，但10年前无快速、可靠测定SAA的POCT方法，当时文献呼吁开发方便的SAA检测方法，以促进SAA 在临床实验室的广泛应用(Clin Chem Lab Med 1999; 37(4):381-388)。 呼吸系统病毒感染发病率很高，在老年人和幼婴儿中死亡率也不低，尤其是幼婴儿如处理不当，疾病变化快速而凶猛，但目前门急诊检验缺少诊断病毒感染的可靠指标。病毒的相应抗体测定仅能指示该患者曾经感染过相关病毒，人体感染后产生抗体需较长时日，最快的IgM抗体也要感染后约5天才能检测到，而康复后抗体的消失又需很长时日，有的患者一辈子相应IgG抗体都呈阳性，个体差异极大，对医生处理决断的参考价值非常有限。 病毒感染患者发病后门急诊就诊时SAA就应升高，如同时测定的CRP在正常范围，则提示当时尚无细菌感染并发。近20年来全世界的临床研究均表明SAA也是一项疾病动态监测的优秀指标，所以对同一患者的同一疾病，相隔数天，SAA随疾病的变化波动会很大，SAA回复正常提示疾病已在康复中。临床医生往往非常关注一个他未曾用过的检验指标的临床有用性，在关注SAA与病例关系时，务必注意采血当天的患者情况，例如当日的体温、体症、X影象等。SAA是各急性时相蛋白中反映最敏锐的一个，疾病好转、康复，SAA首先下降并回归正常。 泸州医学院学报(2008年第4期 441-442页)专题探讨了儿童急性上呼吸道感染诊治及康复过程中急性时相蛋白CRP、SAA和α1-酸性糖蛋白(AAG)的变化规律及临床应用。结果显示细菌感染患儿，三种急性时相蛋白浓度均显着高于正常对照，而病毒感染患儿仅SAA较正常对照明显升高，CRP和AAG无显着增高，两组患儿疗效较好者急性时相蛋白（病毒组指SAA）第3天已有下降，7天明显下降，14至21天恢复至对照组水平。而预后不良患儿急性时相蛋白浓度仍维持较高水平。
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]
定量蛋白质组学的方法有哪些？ 1背景和意义 从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病 理研究）已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。 2方法学介绍 目前较主流的定量蛋白质组学方法有 5 种，分别是Label-free 、 iTRAQ 、 SILAC 、 MRM(MRM HR) 、和 SWATH 。简述如下： 2.1Label-free Label-free 定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只 需要比较特定肽段 /蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变 化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。 Label-free 操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、 重复性要求较高，准确性也较标记定量差。因此，Label-free 技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。 2.2 iTRAQ iTRAQ 定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记 和定量，将多肽的含量转化为 114、115、116 和 117 同位素的含量 (或 113、114、115、116、117、118、119 和121 的 8 标记 )，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋 白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。 iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外 蛋白等，且定量准确，可同时对8 个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别 适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。金开瑞质谱平台应用 iTRAQ 定量技术，可鉴定多达 6000 种蛋白（以人 HepG2 为例），重复样品间的蛋白表达量 相关性可达到0.95 以上。 2.3SILAC SILAC 定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型 )或稳定同位素(中性或重型 )标记的必 需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基 酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋 白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积 比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。 SILAC 属于体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高达100% ，且标记效果稳 1
蛋白质含量测定法 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH |+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 170
2NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 171
淀粉样蛋白高说明什么 现如今科技是非常发达的，尤其是在医学方面，当人们身体出现问题的时候，自主的去医院检查就是很常见的一种方法，有时人们在检查身体的时候就会发现有血清淀粉样高的情况，出现了这种情况是人们身体出现问题的一种表现是需要人们注重起来的，下面就来介绍一下血清淀粉样蛋白高说明什么。 通常来说，血清淀粉样蛋白偏高会证明身体内有某种炎症的出现，患者需要针对病症接受消炎治疗，其高发病症如下。 血清淀粉酶升高最多见于急性胰腺炎，是急性胰腺炎的重要诊断指标之一，在发病后2～12h活性开始升高，12～72h达峰值，3～4天后恢复正常。淀粉酶活性升高的程度虽然并不一定和胰腺损伤程度相关，但其升高的程度越大，患急性胰腺炎的可能性也越大，因此虽然目前还都用淀粉酶作为急性胰腺炎诊断的首选指标，但其特异性和灵敏度都还不够高。当怀疑急性胰腺炎时，应对患者血清和尿淀粉酶活性连续作动态观察，还可结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定共同分析，作出诊断。 淀粉酶测定对监测急性胰腺炎的并发症如胰腺假性囊肿，胰腺脓肿亦有价值，此种时候血淀粉酶活性多持续升高。重症急性胰腺炎时可以引起胸腔积液或／和腹腔积液，积液中的淀粉酶活性甚至可高于血清淀粉酶活性100倍以上。
急性胰腺炎的诊断有一定的困难，因为其他急腹症也可以引起淀粉酶活性升高。所以当怀疑急胰腺炎时，除应连续监测淀粉酶外，还应结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定结果共同分析，作出诊断。 慢性胰腺炎淀粉酶活性可轻度升高或降低，但没有很大的诊断意义。胰腺癌早期淀粉酶活性可见升高。 淀粉酶活性中度或轻度升高还可见于一些医|学教育网搜集整理非胰腺疾病，如腮腺炎、急性腹部疾病（消化性溃疡穿孔、上腹部手术后、机械性肠梗阻、肠系膜血管病变、胆道梗阻及急性胆囊炎等）、服用镇痛剂、酒精中毒、肾功能不良及巨淀粉酶血症等情况，应加以注意。
粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以 6.25就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂