遮光后叶绿素含量升高和叶绿素a/b降低的原因 试题：如图，叶绿素的含量随着遮光比例的升高而升高，遮光后叶绿素a/b 降低，捕光能力上升。原因。 因为学生知道，光是叶绿素形成的必需条件，所以大部分学生都错误认为叶绿素含量随光照增强而增加。 从资料中可以看出，这些变化都是为了适应植物在遮光条件下的生长。 一、遮光后叶绿素含量为什么会升高 叶绿素含量受到光照、温度、矿质元素、逆境等外界因素及核基因、质基因等内在因素的共同影响，在外部因素中光对叶绿素的合成与分解起主导作用。植物体中叶绿素的合成和分解处于一个动态平衡中，叶片光照后，才能顺利地合成叶绿素，但形成叶绿素所要求光照强度相对较低，当然过弱也不利于叶绿素的生物合成，除680nm以上波长以外，可见光中各种波长的光照都能促使叶绿素形成，光过强反而会发生光氧化而受破坏。 植物中叶绿素和蛋白质结合为结合态叶绿素才能发挥作用，而自由态的叶绿素则会对细胞造成光氧化损伤。为了避免自由态叶绿素对细胞造成的光氧化损伤，植物必须快速降解这些物质。 在遮光条件下，集光色素蛋白在光合单位中的相对含量会增加，从而导致结合态叶绿素增加。与此同时，降低了叶绿素的降解和光氧化，所以遮光后叶绿素的含量会增加。 遮荫环境下，植物通过增加单位叶面积色素密度和叶绿素含量，有利于提高植株的捕光能力，吸收更多的光，提高光能利用率，是对弱光环境的一种适应。 二、遮光后叶绿素a/b降低 在不同生理条件下，叶绿素a和叶绿素b的合成、分解速度影响了叶绿素a/b的比值，但调节叶绿素a/b的比值主要通过“叶绿素循环”实现。叶绿素a 和叶绿素b的相互转化称为“叶绿素循环”。 在遮光条件下，叶绿素a向叶绿素b的转化加快，叶绿素a水解形成脱植基叶绿素a，脱植基叶绿素a再转化为脱植基叶绿素b，最后合成叶绿素b，从而降低了叶绿素a/b的比值。弱光下叶绿素b的相对含量增高是有其生理适应，有利于对弱光的利用。
! 课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型： + ■■ + I- i实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 ■■ jl + : 姓名： * 专业：学号： ■■ jl 1 同组学生姓名：指导老师： + 装 实验地点：实验日期: 订 一、实验目的和要求线 r 二、实验内容和原理 i三、主要仪器设备 卜 四、操作方法与实验步骤 + 1 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下: 实验报告
1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙醇或80%勺丙酮提取。 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 COOGH COO MoONMg \ + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH COOCHk COO 3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg+可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ ) 褐色绿色 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值 之间有如下的关系：OD=Ca*k a1+G*k b1 OD=Ca*k a2+G*k b2 查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。 比吸收系数k 波长/nm
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645
一、实验课题名称：不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较 二、选题背景或文献综述： 《植物生理学实验指导》（第四版）、《植物生理学》（第六版）、上网查阅相关资料 阴生植物也称“阴性植物”，是在较弱的光照条件下生长良好的植物，但并不是阴生植物对光照强度的要求越弱越好，而是必须达到阴生植物的补偿点，植物才能正常生长，阳生植物也称“阳性植物”，光照强度对植物的生长发育及形态结构的形成有重要作用，在强光环境中生长发育健壮，在阴蔽和弱光条件下生长发育不良的植物称阳性植物，这类植物要求全日照，并且在水分、温度等条件适合的情况下，不存在光照过强的问题。 阳生植物和阴生植物的区别:关于光的饱和点和补偿点光是光合作用的能量来源，光照强度直接影响光合速率，在其它条件都适宜的情况下，在一定范围内，光合速率随光照强度提高而加快，当光照强度高到一定数值后，光照强度再提高而光合速率不再加快，这种现象叫光饱和现象。开始达到光饱和现象的光照强度称为光饱和点，在光饱和点以下，随着光照强度减弱，光合速率减慢，当减弱到一定光照强度时，光合作用吸收二氧化碳量与呼吸释放二氧化碳的量处于动态平衡，这时的光照强度称为光补偿点。此时植物制造有机物量和消耗有机物量相等，不同类型植物的光饱和点和
补偿点是不同的，阳性植物的光饱和点和补偿点一般都高于阴性植物。 结构和特性的区别:阴生植物的叶片的疏导组织比阳生植物稀疏，以叶绿体来说，阳生植物有较大的基粒，基粒片层数目多的多，叶绿素含量也高，阴生植物在较低的光照条件下充分的吸收光线，叶绿素a/叶绿素b的比值小，能够强烈的利用蓝紫光，阳性植物叶片小而厚，表面具蜡质或绒毛，叶脉密，单位面积内气孔多，叶绿素含量高，体内含盐分多，渗透压高，可以抗高温干旱，阳生植物的气孔一般在叶片下表皮分布的数量多于上表皮，这样可以避免阳光直晒而减少水分散失，阳生植物的呼吸速率高于阴生植物。 区分阳生植物与阴生植物，主要是根据植物对光照强度需要的不同，阳生植物要求充分直射日光才能生长或生长良好，阴生植物适宜于生长在荫蔽环境中，它们在完全日照下反而生长不良或不能生长，阳生植物和阴生植物之所以能适应不同光照，是与它们的生理特征和形态特征不同有关，以光饱和点来说，阳生植物的光饱合点是全光照（即全部太阳光照）的100％，而阴生植物是全光照的10％～50％。因为阴生植物叶片的输导组织比阳生植物的稀疏，当光照强度增大时，水分对叶片的供给不足，阴生植物便不再增加光合速率，以叶绿体来说，阴生植物与阳生植物相比，前者有较大的基粒，基粒片层数目多，叶绿素含量较高，能在较低光照强度下充分
实验报告 课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法； 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量 分析。原理如下： 1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取； 2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素 分开； 3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素； 4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光； 5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光 学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心 装 订 线
三、主要仪器设备 1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法、实验步骤以及实验现象 定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。 皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。 取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） 反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理
上肠ｋｓｄ．（湖泊科学），２０１０，２２（６）：９６５－９６８ ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｊｌａｋｅｓ．ｏｒｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｈｋ∞＠ＩｌｉｇＩａｓ．ａｃ．ｃｎ ＠２０ｌＯｂｙ如￡册耐矿ｋｋｓｃ泐鲫 ＹＳＩ（多参数水质检测仪）测定叶绿素ａ浓度的准确性及误差探讨‘刘苑１”，陈宇炜Ｈ。，邓建明１’２ （１：中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京２１０００８） （２：中国科学院研究生院，北京ｌｏ００４９） 摘要：Ｙｓｌ（多参数水质检测仪）由于其快速、轻便的特点，已广泛应用于野外水体中时绿素ａ的测定．通过将Ｙ跚溯得的叶绿素ａ值与分光光度法测定值进行比较，对Ｙｓｌ６６００水质测定的准确性和数据采集进行评估．结果显示，Ｙｓｌ测定值多数偏低。且与分光光度法测定值之间存在显著性差异；时间上，冬季比夏季具有更大的线性相关性．分段同归结果显示，随着叶绿素ａ浓度不断增大．两组数据的差值也不断增大．ＹｓＩ测定误差产生于３个方面：（１）测定前ＹｓＩ校准方法的不同；（２）其它种类具有荧光特性色素的存在；（３）ＹｓＩ自身结构． 关键词：叶绿素ａ浓度；ＹＳＩ；分光光度法；误差 ＤｉｓＣｕｓｓｉＯｎ０ｎａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｅｒｒＯｒＳｆｏｒｐｈｙｔｏｐＩａｎＩ∞ｎｃｈｌｏｒｏｐｈｙ¨－ａｃｏｎｃｅｎｔｒａ埘０ｎａｎａＩｙＳｉＳｕｓｉｎｇＹＳｌ（ＭｕＩｔＩ－ｐａｒａｍｅｔｅｒｗａｔｅｒａｎａｌｙｚｅｒ） Ｕ［ＵＹｕ觚１ｒ，Ｃ胍ＮＹｈｗｅｉｌ＆ＤＥＮＧＪｉ柚ｍｉｎ９１．２ 巧ｓｃｉｅ，ｌｃｅｓ．Ｎｎ嘲ｉ他２、０００ｓ．Ｐ．Ｒｃｈｔ舱）（１：胁把研ｋ幻加ｆｏ秽巧上４妇＆妇懈４耐勖佃研珊跏ｆ，觑ｌ咖ｇ肺咄姚可＆珊，印砂研ｄ肠彻咖，劭加甜ＰＡｃ扭娜（２：Ｇ，眦妇纪＆幻Ｄｚ盯ｃＪ咖ｅ卵Ａ棚ｄ唧矿＆￡伽，＆驴ｆ，增ｌ（－Ｄ０４９，Ｐ．尼西ｆ，埘） Ａｂｓｔ陀ｃｔ：ＹｓＩ（Ｍｌｌｌｔｉ?ｐａ强ｌｎ曲盱ｗａｌｅｒ锄ａｌｙ蹭ｒ）ｉｓ诵ｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏ山把皿ｉ肿ｐｈｙｔｌＤｍ锄ｋｔｏｎ ６ｅＩｄｓｃｈｌ啪ｐｈｙｌｌ－ａｃｏｎｃｅｎｔｒ撕加ｉｎｍ蛐ｙｂｅｃ舢卵０ｆｉｔｓｒａｐｉｄｎｅ睇锄ｄｐｏｒｔａｂｌｅｎｅ鹄．Ｔｂｅｐｕ叩∞ｅ０ｆｔｌｌｉｓ咖由ｉ８ｔ０ｅｖａｌｕ砒ｅｔＩｌｅｅ伍ｃ卵ｙ０ｆｔ王ｌｅＹＳＩＥｎ“姒蛐ｅｎｔａｌＭｏ＿Ｉｌｉ试ｎｇｓｙｅ锄ｈｗ栅ｑＩｌａｌｉｔｙⅡ地ａ棚他眦“ｔｓａｎｄｄａｌａｃｏｕｅｃｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐｆａｒｉＩｔｇｔｗ０ｇｒｏｕｐ邑０ｆｄａｌａ憾ｉｌｌｇ蚰啪ｌｔｏｒｙ耐｝
实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75
一、实验课题名称 不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定） 二、文献综述 1.叶绿素a的生物合成过程 起始物是谷氨酸，之后为5-氨基酮戊酸，两分子的ALA缩合形成胆色素原(PBG),4分子PBG相互连结形成原中卟啉IX.原卟啉IX与Mg结合形成Mg-原卟啉原IX，光下E环的环化形成，D环的还原作用和叶绿醇尾部的连接完成了整个合成过程，合成过程中的许多步骤在图中已省略 2.影响叶绿素形成的条件 （1）光光是影响叶绿素形成的主要条件。从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。黑暗中生长的幼苗呈黄白色，遮光或埋在土中的茎叶也呈黄白色。这种因缺乏某些条件而影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称为黄化现象(etiolation)。 也有例外情况，例如藻类、苔藓、蕨类和松柏科植物在黑暗中可合成叶绿素，其数量当然不如在光下形成的多；柑橘种子的子叶及莲子的胚芽在无光照的条件下也能形成叶绿素，推测这些植物中存在可代替可见光促进叶绿素合成的生物物质。 (2)温度叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响。叶绿素形成的最低温度约2℃，最适温度约30℃,最高温度约40℃。秋天叶子变黄和早春寒潮过后秧苗变白，都与低温抑制叶绿素形成有关。高温下叶绿素分解大于合成，因而夏天绿叶蔬菜存放不到一天就变黄；相反，温度较低时，叶绿素解体慢，这也是低温保鲜的原因之一。 (3)营养元素叶绿素的形成必须有一定的营养元素。氮和镁是叶绿素的组成成分，铁、锰、铜、锌等则在叶绿素的生物合成过程中有催化功能或其它间接作用。因此，缺少这些元素时都会引起缺绿症(chlorosis)，其中尤以氮的影响最大，因而叶色的深浅可作为衡量植株体内氮素水平高低的标志。 (4)氧缺氧能引起Mg-原卟啉IX或Mg-原卟啉甲酯的积累，影响叶绿素的合成。 (5)水缺水不但影响叶绿素生物合成，而且还促使原有叶绿素加速分解，所以干旱时叶片呈黄褐色。 通过对室外旱池处理条件下的甘薯叶片叶绿素含量变化的研究，结果表明，水分胁迫下甘薯品种叶片中叶绿素a、b及总叶
植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名
摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。 3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C 55H 72 O 5 N 4 Mg，MW=893.4891 叶绿素b：C 55H 70 O 6 N 4 Mg，MW=907.4727 胡萝卜素：C 40H 56 ， MW= 536.8726 叶黄素：C 40H 56 O 2 ， MW=568.8714 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试 管等 3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、 醋酸铜 三、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵; （2）加入少许石英砂和CaCO 3 ,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml; （3）用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处). 2、纸层析分离叶绿体色素 （1）层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的
叶绿素a测定实验报告 （一）实验目的及意义 水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。 （二）水样的采集与保存 1.确定具体采样点的位置 2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍 3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L 4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL 5.将采样瓶拧上并编号 6.用GPS同步定位采样点的位置 （三）仪器及试剂 仪器： 1.分光光度计 2.比色池：10mm 3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm） 4.研钵 5.常用实验设备 试剂： 1.碳酸镁悬浮液：1%。称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。每次使用时要充分摇匀 2.乙醇溶液 （四）实验原理 将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。 将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。 （五）实验步骤 1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。 2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。 3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。 4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。
叶绿素含量的测定 一.实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 ● 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 ●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： ●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 ●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： ●A663=82.04C a+9.27C b （1） ●A645=16.76C a+45.60C b（2） ●C a=12.7 A663—2.59 A645(3) ●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4) ●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) ●
植物组织中叶绿素含量测定 （无机及分析化学实验II-设计性实验） 一、实验目的 1．设计用分光光度计测定植物组织中的叶绿素 2. 学习利用文献资料设计研究方案 3. 掌握分光光度计测定植物组织中的叶绿素的原理与方法 二、原理： 叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合 成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对 光、热较敏感；在酸性条件下，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中 可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种，均 易溶于乙醇、乙醚、酒精和氯仿。 叶绿素a 叶绿素b 叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm，且两吸 收曲线相交于652nm处。叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，可在663nm和 645nm测定试样吸光度（两组份混合试样测定，双波长法），根据Lambert－
Beer定律，列出浓度c与吸光度A之间的关系式： A 663 ＝82.04c a＋9.27c b (1) A 645 ＝16.75c a＋45.6c b (2) （1）、（2）式中的A 663、A 645 为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度 度。 c a 、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为g/L。 82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。解方程式（1）（2），则得经验公式： c a =12.7 A 663 -2.69 A 645 (3) c b =22.9 A 645 -4.68 A 663 (4) c T =（c a + c b）=20.2 A645+8.02 A663...... (5) 此时，c T为总叶绿素浓度，c a、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为mg/L ，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a、b总叶绿素的浓度。 仪器：分光光度计、电子天平、棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光）、小漏斗、滤纸 试剂：95%乙醇 三、实验步骤 1、试材的采集 采集新鲜植株叶片（或含叶绿素的其他组织），夹于双层报纸中，风干（不能置于太阳光下晒）。将风干材料处理成细小颗粒，装入封口塑料袋，避光保存。 2、待测液的制备 （1）叶绿素的浸提 精密称定风干后的样品（约0.1g）于20mL 95%乙醇中，在室温浸提36-48h。 （2）叶绿素浸提液定容
一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸； 2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1.光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2.荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。
植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法 1、原理 叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式： D663= + D645= + (浓度单位：g/mL） 叶绿素a的浓度：Ca= – 叶绿素b的浓度：Cb= –D663 总叶绿素的浓度：Ct = + (浓度单位：mg/L） 2、试剂与材料 试剂： 丙酮、石英砂、碳酸钙 材料： 新鲜叶片。 仪器与器皿： 分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管 3、实验步骤 称叶用丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用80%丙酮定容至25mL ↓ 适当稀释后测A645、A663 取样：称取剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。 研磨提取：向研钵中加入80%丙酮，以及少许（约）CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。 读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色
叶绿素a,b含量测定 ［实验目的］熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 ［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。吸收曲线彼此又有重叠。 根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1 (1) OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2 (2) Ca为组分a的浓度（g/L） Cb为组分b的浓度（g/L） OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD值。 ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。 叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表： 将表中数值代入上式（1），（2）并整理的： Ca=0.0127OD663-0.00269OD645 Cb=0.0229OD645-0.00468OD663 若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca=12.7OD663-2.69OD645 (3) Cb=22.9OD645-4.68OD663 (4) Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645 (5) Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。 利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度（g/L）。 ［器材与试剂］ 1.实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管 2.实验试剂：丙酮，碳酸钙 3.实验材料：植物叶片 ［实验步骤］ 1.色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5G放入研钵中加纯丙酮5ML，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ML。 2.测定光密度：取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释和转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。 3.按公式分别计算色素提取液中叶绿素A，B及叶绿素总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 ［注意事项］ 1.由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。 2.由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。 ［实验作业］ 1.试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素A和叶绿素B的比值有无不同。 2.分光光度法和比色法有何不同？ 3.叶绿素A和叶绿素B在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素A和叶绿素B 的定量分析，为什么？
测定叶绿素a和b的方 法及其计算 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算 一目的要求： 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线 横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数 根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2） 式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下： 将表中数值代入上式（1）、（2），则得： OD663=×Ca+×Cb OD645=×Ca+×Cb 经过整理之后，即得到下式： Ca= OD645 Cb= OD663 如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca= OD645 （3） Cb= OD663 （4） CT= Ca+ Cb= OD663+ OD645 （5） （5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。 利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度 （mg/L）。 [附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，
叶绿素a的测定方法——乙醇+分光光度法 1、水样的保存 水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h），则应置于0℃~4℃低温下保存。水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L。 2、抽滤 在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。抽滤时负压应不大于50kPa。抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20℃低温冰箱中可保存30天。 3、提取 研磨可用玻璃研钵。将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7~8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml。盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h。 4、离心 将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500~4000rpm，离心10~15min。将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。最后将提取液定容到10ml。如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h，取其清液即可。 5、测定 用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度计零点）。测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A1；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A2.则提取液中叶绿素a的浓度为： Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V 脱镁叶绿素浓度为： Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V 其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L；V提取液为提取液的最终定容体积,单位为mL；V为抽滤水样的体积，单位为L。
叶绿素理化性质的测定 一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；
2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1. 光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2. 荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3. 皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。 （2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及