硫酸软骨素肝素胰酶酶的简介
超氧化歧化酶又称过氧化物歧化酶。SOD 属于金属酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（CUZNSOD ）、含锰超氧化物歧化酶（MN ——SOD ）和含铁超氧化物歧化酶（Fe ——SOD ）。三种SOD 都催化超氧化物阴离子自由基歧化生成过氧化氢与氧气。螺旋藻蛋白质同时含有多种重要的酶，其中最为重要的是超氧化物歧化酶，即SOD。SOD是自然界动植物和好气微生物中普遍存在的一种重要极微量的生命物质------一种活性的含金属离子的蛋白质基团。在螺旋藻中，科学家却大量的发现它的存在。这种活性酶能专门促使体内的超氧化阴离子自由基发生歧化反应，变成对生物体无害的分子氧与过氧化氢。1988年，CONFIDENCE医药研究所从藻蓝蛋白中成功提取超氧化歧化酶，在白鼠体内成功的完成了超氧化阴离子自由基发生歧化反应的试验。CONFIDENCE藻类营养食品公司生产的confident SOD经临床试验取得了突破性的成果。
当代医学对于人的老龄研究发现，人的生命阶段在过了青少年以后，一些过氧化物等人体“垃圾”，会因来不及清除而积聚在体内。其中的过氧化阴离子自由基能直接攻杀损害人体的蛋白质、核酸、细胞膜和内脏器官，从而使人体的实质性组织器官等发生衰老破坏。因此，对于人类和一切生物来说，没有SOD的存在，生命就不存在。大量现代医学研究证明，SOD 是人体内的一种最重要的细胞保护酶，既能防辐射损伤，又能有效地抵抗过氧化阴离子自由基，从而延缓衰老，调节机体代谢能力，提高人体自身的免疫功能。
SOD的用途
SOD 在食品工业中，作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，该保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。目前已有添加SOD 的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的保健食品面市。制成多种剂型的SOD 或复合型食品。已有SOD胶囊剂、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD 保健食品。
SOD 可作为罐头食品，果汁、啤酒等的抗氧剂，防止过氧化物酶引起的食品变质及腐败现象。此外，还可作为水果、蔬菜的保鲜剂。
研究证实，SOD 添加于化妆品中可起到四方面的作用：一是有明显的防晒效果；二是SOD 作为抗氧化酶能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱；三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；四是SOD 具有一定的防治瘢痕形成的作用
临床试用 SOD 治疗和预防下列疾病
（ 1 ）可抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD 可清除人体内过多的有害自由基，是对健康有益的功效成分。具有调节血脂的保健作用，可预防动脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病。降低脂质过氧化物的含量。
（2 ）抗衰老作用：年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。由于SOD 能够清除自由基，因而可以延缓衰老。
（3 ）自身免疫性疾病：SOD 对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效。如红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎等。对于类风湿关节炎患者应在急性期病变未形成前使用，疗效较好。
（ 4 ）肺气肿：肺气肿患者亦可使用SOD ，但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害时使用，疗效较好。
（5 ）辐射病及辐射防护：本品可用来治疗因放疗引起的膀胱炎、皮肌炎、红斑狼疮及白细胞减少等疾病，对有可能受到电离辐射的人员，也可注射SOD 作为预防措施。
（6 ）老年性白内障：对这类疾病应在进入老年期前即开始经常服用抗氧化剂，或者说经常注射SOD 。如果一旦形成白内障，则除摘除外，用SOD 治疗无效。
材料与方法
菌种：酿酒酵母
培养基
保藏培养基的组成
牛肉膏 1.0% 蛋白胨 1.0% 氯化钠0.5% 琼脂 2.0~2.5% pH 7.0~7.2
斜面培养基的组成
葡萄糖0.1% 蛋白胨 1.0% 牛肉膏 1.0% 氯化钠0.5% 琼脂2.0~2.5% pH 7.0~7.2
种子培养基的组成
7Be麦芽汁10% 葡萄糖1% 蛋白胨0.5% 酵母膏0.3% pH 5.5
发酵培养基的组成
蛋白胨1% 酵母膏1% 葡萄糖2% pH 5.5
试剂：0.3M海藻糖：本来是0.5M的蔗糖的，但经过查找文献，发现不同浓度的海藻糖对SOD 均有较强的保护作用，其中浓度在0.3mol/L 时效果最佳，而蔗糖对SOD既无激活作用也没抑制作用，所以改成了海藻糖。
DNase I：即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
10M氯化镁溶液：是DNase I激活剂。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点。
蜗牛酶：是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶。它可以用于酵母细胞壁的破碎
SOD生产工艺流程
生产过程
1、实验室扩大培养
2、车间扩大培养
种子扩大培养的程序
经斜面培养、液体培养（一级）、扩大培养（二级）后，按10%的量接入发酵罐（2L）中通气培养。每隔2h 取样一次，于650mm 处测定发酵液的OD 值，当OD 值恒定而有下降趋势时，放出发酵液，离心收集菌体供提取SOD。
酵母菌中SOD 的提取及纯化：将离心分离得到的酵母菌体，悬浮于缓冲液（50mM 磷酸钾缓冲液，0.3M海藻糖，10M 氯化镁，pH7.0~7.5）中，用蜗牛酶酶解后，超声波破碎细胞壁，菌体碎片再用DNaseⅠ酶酶解，离心除去残渣，得粗酶提取液；在搅拌下加入乙醇-氯仿（5∶3）溶液，离心除去杂蛋白；再加入磷酸氢二钾盐析；上清液加入0.75 倍冷丙酮，冷冻离心得粗酶沉淀；将沉淀溶于pH7.8磷酸钾（2.5mM）缓冲液中透析1~2d，即得Cu，Zn-SOD 酶液。
SOD活力测定
在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min 的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性
邻苯三酚───────O2 - + 红桔酚
（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）
O2 - + O2 - +2H+────H202+O2
（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）
1．测定邻苯三酚溶液自氧化速率：
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.070（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
试剂空白管（mL）自氧化管（mL）
pH8.2、
50mmol/L
2.98 2.98
Tris-HCl
10mmol/L
0.01 ——
HCl
50
mmol/L邻
——0.01
苯三酚
2.SOD样液活力测定：
样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，在25℃水浴锅中保温10min，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
试剂空白管（mL）样品管（mL）
pH8.2 50mmol/LTris-HCl 2.98 2.98
10mmol/L HCl0.02——
SOD样酶——0.01
50 mmol/L邻苯三酚——0.01
SOD酶活力计算：
(酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量定义为一个活力单位。)
参考文献：
【1】冯清平，张晓君.酵母菌中超氧化物歧化酶的研究［J］.微生物学报，1995，35（4）：280~286.
【2】谭天伟，杨元忠，马润宇等.从酵母菌中提取纯化超氧化物歧化酶［J］.微生物学报，1997，37（1）：68~71
【3】张龙翔，张庭芳，李令媛编著.生化实验方法和技术［M］.北京：高等教育出版社，1983，165~166
酵母菌发酵生产超氧化歧化酶
班级：11 生工1
学号：20110801105
姓名：刘海燕