作者单位:第一军医大学热带军队卫生学系微生物学教研室,广东广州510515?综述?
副溶血性弧菌快速检测研究进展谭翰清,万成松
中图分类号:Q939.1
文献标识码:A
文章编号:1671-5039(2004)01-0021-03
副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐性细菌,属弧菌科(Vibrio)弧菌属,主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒,在细菌性食物中毒中,比例高、危害大。目前,我国常规检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。这些实验操作繁琐,需耗时5～6d,检出率低,给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难,影响经济发展。我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道,近年来世界发病率呈上升趋势[1]。因此,建立Vp快速、准确、特异、灵敏的检测诊断方法是十分必要的。下面对副溶血性弧菌快速检测方法的研究进展进行综述。
1 KP溶血试验
副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐热直接溶血毒素(therm ostable direct hem olysin,T DH),并能在我萋血平板上产生一种特殊的溶血现象,叫做神奈川现象(kanawaga phenomenen,K P)[2]。该试验需经过前增菌、选择性增菌、选择性培养后,挑取可疑菌落接种到我萋血平板上,置于37℃孵箱中过夜,如菌苔周围出现透明溶血环,即为K P阳性,据此诊断样本中含有Vp。该试验是检测副溶血性弧菌最基本的方法,能把绝大部分副溶血性弧菌检测出来,但操作繁琐、所需时间长(约4d),而且存在部分T DH-株,易漏检,给人们健康带来危害。
2 免疫学方法
免疫学方法特异性强、灵敏度高、易于观察、应用广泛。血清学反应是最基本的免疫学反应,主要用于细菌分型。目前,通过血清学反应,Vp可分为13种O血清型、71种K血清型[3]。正确的分型为流行病学调查和临床用药提供依据。但此反应只能大概区分不同地区和来源的菌株,而且由于抗原位点受环境等因素的影响易发生突变,出现新的血清型时[4],以现有的血清检测就会漏检。
目前,应用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸附法(enzyme linked immunos orbent assay,E LIS A)。该方法从抗体的包被到酶联显色,都已经具备了成熟的技术,易于制备试剂盒,操作简单,特异性好,灵敏度高。
由于Vp临床分离株大多为T DH+株,TRH(ther2 m ostable related hem olysin)阳性株只占10%～15%,少数为T DH和TRH双阳性,环境分离株几乎无T DH+[5,6],所以大多研究者主要选择T DH、TRH为抗原,制备相应的抗体进行检测。
E LIS A抗体的包被与固定是关键,影响检测的灵敏度和特异性。H onda等[7]设计了一种新的固定方法,用HCl、聚乙烯(polythylence imine,PEI)、甲基乙烯基马来酸酐聚合醚(malwic anhydride methylvinyl ether copolymer,MAMEC)等化学试剂处理尼龙膜,接着固定包被T DH和TRH的单克隆抗体,然后与Vp 培养肉汤中T DH或TRH反应15min,洗涤后,与抗T DH、TRH的兔血清多克隆抗体37℃反应15min,再与碱性磷酸酶标记的抗兔抗体IgG反应,最后底物显色。结果显示,经过紧密相连的三次抗原抗体反应,特异性100%,灵敏度9515%,并且通过肉眼观察就能区分T DH和TRH株。同时,该尼龙膜也可以直接用于检测粪便标本,特异性达8819%,灵敏度达92%,并能在1h内完成检测。此固定方法减少非特异性吸附,增强抗体结合度,从而增强了特异性,提高了灵敏度。但是,这种方法涉及到抗体包被、固定、抗体的标记、显色等步骤,操作繁琐,技术要求高,而且尼龙膜不能长期保存,不能进行大规模临床检测。同时,直接检测时,抗原量可能不足,抗原位点也容易改变,导致出现新的血清型,如近年来出现新的O3∶K6血清型[8],最终造成漏检。
3 核酸杂交
免疫学方法是在蛋白水平检测Vp,而核酸杂交则是在基因水平进行检测,结果更为特异、准确、可靠。用于检测Vp的核酸杂交方法主要有斑点杂交、S outhern杂交、夹心法杂交。
311 斑点杂交
1992年,Y amam oto等[9]针对tdh和trh101～125bp的基因设计探针,对Vp进行斑点杂交检测,其中tdh探针基因序列为5′2ccccggttctgaX gagatattgtt2 3′,trh探针基因序列为:5′2tccaggttcggaX gagctactatt2 3′,X为dUTP,用于标记碱性磷酸酶。他们将Vp临床分离株的克隆基因片段点到尼龙膜,与探针在50℃杂交10min,洗涤,最后底物显色。结果显示, tdh探针特异性为100%、灵敏度为93%;trh探针特异性为93%、灵敏度为86%。但是,tdh探针把部分弧菌科的其他细菌也检测出来,造成一定的假阳性,而且膜上核酸片段易脱落,不能长期保存。
312 Southern杂交
1998年,Suthienkul等[6]对137株Vp临床分离株进行S outhern杂交。tdh探针选自p KY199的EcoRI片段,长359bp,trh探针选自p KY298的EcoRI 片段,长334bp,两探针的dUTP都标记上地高辛。他们将菌株的DNA片段HindⅢ酶切、电泳、尼龙膜转移后,与tdh、trh探针杂交,然后与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应,最后底物显色。结果显示, tdh和trh探针特异性好,把tdh+株(共127株)和trh+株(共37株)全部检测出来。然而,这种方法操作繁琐、时间长,不适合临床实验室的快速检测。313 夹心法杂交
2003年,Lee等[10]采用夹心杂交法检测海产品中Vp的tl基因。他们对微孔板进行NH修饰,然后与tl基因捕获探针的磷酸基团共价结合,接着把PCR变性产物、标记生物素的信号探针加到微孔板中进行杂交反应,洗涤后,与酶标链亲和素结合,最后底物显色并在405nm紫外灯下检测。结果显示,该方法检测信噪比在1411～4312之间,特异性好,灵敏度高,能把每克牡蛎组织里10个Vp检测出来。该方法易于制成试剂盒,目前,美国市场上已有销售。由于试剂盒已经把捕获探针固定在微孔板上,检测时只需把PCR产物加到微孔板中杂交就行了,操作简单,重复性好,灵敏度高,特异性好,能进行临床大规模的快速检测,并且易于在普通实验室推广。
4 PCR
近年来,随着微生物基因组学的发展,微生物基因检测迎来了新的机遇。2000年,Makino等[11]已经完成Vp的基因组测序,Vp毒力基因及特异的基因序列得到进一步确定。根据Vp特异基因序列,设计引物,进行PCR检测,是现阶段检测Vp的最快速准确的方法。目前应用于检测Vp的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarily primed PCR,Ap2PCR)、针对任意引物PCR、多重PCR(multiplex2PCR)、实时PCR(real2time PCR)。
411 任意引物PCR
Matsum oto等[12]采用任意引物PCR对Vp进行检测。他们针对Vp的tdh和trh基因一段特异的序列,设计两条引物,引物1:5′2ggtgcgggaa23′和引物2: 5′2gtttcgctcc23′,对1977～1998年所收集的227株Vp 进行PCR。通过电泳分析发现,1996～1998年收集的22株血清型为03∶K6菌株与1996年以前收集的O3∶K6血清型菌株基因序列有所不同,为O3∶K6血清型新出现的变异株,并最初出现在孟加拉国。这是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法。412 针对任意引物PCR
由于临床分离株绝大多数含有tdh基因,因此绝大部分研究者都根据tdh设计引物进行特异扩增。1993年,Lee等[13]根据tdh基因设计引物,对36株T DH+株、89株T DH-株以及46株其他弧菌和肠道菌进行PCR检测。结果显示,36株T DH+株全部特异扩增出来,其余菌株都没有扩增;而检测灵敏度高,最低检测量可至40pg DNA,并可直接检测粪便标本,无需分离培养,方便快速。
1999年,K im等[14]选择toxR基因序列设计两对引物,5′2gtcttctgacgcaatcgttg23′和5′2atacgagtggttgctgtcatg2 3′,对14株Vp、14株其他弧菌进行PCR。结果显示, 14株Vp都得到一条368bp的特异扩增亮带,而其他菌株没有特异扩增。此外,Venkateswaran等[15]选择gyrB基因设计引物对Vp进行PCR、C ordova等[16]选择pR72H基因设计引物进行PCR,特异性、灵敏度都很好。
413 多重PCR
由于不是全部副溶血性弧菌都含tdh或trh基因,所以只针对tdh或trh的单一PCR,有时会漏检。多重PCR(multiplex2PCR)能全方面高效率地检测Vp。1994年,Bej等[5]针对tl、tdh、trh设计不同的引物对,在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。结果显示,所有的Vp都扩增出tl基因,tl基因是Vp 特异的;54%的Vp扩增出tdh基因;只有38173%的Vp扩增出trh基因;该法灵敏度高,能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个Vp检测出来。与其他常规生化方法相比,多重PCR更快速、仅8h就能完成检
测,结果更为准确、可靠,而且还可改进成定量竞争PCR,对标本中靶序列进行定量。
414 实时PCR
常规PCR检测,需要从反应体系中吸取产物做电泳或S outhern杂交等实验进行鉴定,转移过程中易污染,造成假阳性,而且耗费时间。1996年,T yagi 开创了一种实时PCR(real2time PCR)。实时PCR是在PCR反应体系中加入标记有报告基团和猝灭基团的线性T aqman探针或茎环型荧光分子信标探针,在基因扩增过程中,与产物杂交,此时,报告基团和猝灭基团距离分开,根据能量共振转移现象,报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单,闭管检测,减少污染,灵敏度高,并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测,而且可以进行临床大规模快速检测。
2003年,Blackstone等[17]针对tdh设计荧光分子信标探针,对从牡蛎中富集的13个不同种类的菌株进行实时PCR检测。结果显示,只有含tdh的Vp才被检测出来,特异性好,灵敏度高,能把每个纯培养体系的1个CFU检测出来。实时PCR检测快速准确,但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子标记探针,一般的实验室不能广泛开展。分子信标实时PCR自1996年开创以来短短几年就得到蓬勃的发展,相信随着经济的发展、技术的进步、实时荧光检测仪的普及,将会得到更为广泛的应用。
5 展望
随着微生物基因组学、现代分子生物学理论与技术的发展以及新仪器研发,副溶血性弧菌的检测方法必将向快速、准确、灵敏、特异的方向发展,特别是PCR、核酸杂交、E LIS A这三大现代分子生物学技术的联用以及实时PCR的进一步完善,将会实现副溶血弧菌快速、准确、灵敏、特异、大规模的检测诊断,大大提高食品检验检疫和临床诊断的检测质量和效率。
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(收稿日期:2003-11-05)
(本文编辑:刘惠玲)
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。 第一节副溶血性弧菌标准的检验方法 一、检验方法 （一）操作步骤 1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。 2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。 3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。 4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。 5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。 （二）检验程序 图6-1副溶血性弧菌检验程序 二、结果分析判定及注意事项 （一）样品处理 采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。 样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。 （二）形态与染色
食源性副溶血性弧菌感染防治知识 ●病原学 副溶血性弧菌属弧菌科弧菌属，嗜盐畏酸，在无盐培养基上不能生长，1％～2％醋酸或50％食醋中1分钟即死亡；对热敏感，56℃5分钟或90℃1分钟灭活。对低温及高浓度氯化钠抵抗力甚强。在自来水、井水、河水和塘水中可存活1天，在海水中可存活47天以上。对常用化学消毒剂抵抗力很弱，如酒精、0.05％苯酚、0.1％甲酚皂等，1分钟可杀灭。 ●流行病学 副溶血性弧菌分布极为广泛，其自然生存环境为近海岸和海湾的水域，海水中含有丰富的动物性有机物，有利于该菌生长繁殖。广州珠江河口地区水体中副溶血性弧菌检出率为27.27％，海水、河涌水、养殖水的检出率分别为30.00％、28.61％、13.69％，6～8月水体中副溶血性弧菌检出率较高(52.16％)。 每年5～11月是副溶血性弧菌感染的多发季节，高峰集中在7～9月。发病呈世界性分布，沿海地区发病率较高，日本和我国病例分布最广、发病率最高。随着交通运输条件的改善和生活水平的提高，近几年内陆地区副溶血性弧菌发病率逐年升高。副溶血性弧菌已成为引起夏秋季感染性腹泻的常见、重要病原菌。 传染源：患者在发病初期排菌量多，可成为传染源，但其后排菌量迅速减少，故一般不在人群内传播。人群中亚临床型感染和一过性带菌是存在的，但健康人群带菌率很低。副溶血性弧菌感染与进食或接触海产品有关，带菌率较高的海产品有蛏、杂鱼、寻蟹、梭子蟹、贻贝、虾、带鱼、墨鱼等。除了海产品外，肉、禽、咸菜和凉拌菜亦可引起副溶血性弧菌感染，这主要是因为交叉污染所致。我国不少地区还发现淡水鱼携带副溶血性弧菌。 传播途径：主要通过食物传播 ①生食海产品是最主要的传播途径，副溶血性弧菌在海产鱼、贝类运输或贮存条件适宜时即可大量繁殖，迅速达到致病载量； ②烹调加热不充分； ③交叉污染，烹调过的食物盛于被污染的容器内或使用被污染的厨具再加工其他食品时，可引起污染。 易感人群：男女老幼均可患病。感染副溶血性弧菌后可产生低滴度的血清抗体，但很快消失，故可多次感染。经常暴露于少量细菌者，感染后临床症状一般较轻，如渔民大多有生食或半生食某些海产品的习惯，暴露机会甚多，但发生食物中毒者并不多，即使发病，症状也较轻。但内陆人员到沿海地区时，饮食稍有不慎，屡见发生病情较重的食物中毒。 ●临床表现 1 / 3
副溶血性弧菌是临床检验技师考试辅导复习需要了解的知识，整理了相关内容与考生分享，希望给予大家帮助！ 副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌。常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中。它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。 1.生物学特性 （1）形态染色：革兰阴性菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞、无荚膜。 （2）培养特性：需氧，营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。NaCl 最适浓度为35g／L，在无盐培养基中不生长。本菌不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。生长所需pH为7.0～9.5，最适pH为7.7医^学教育.网搜集整理. 在液体培养基表面形成菌膜。 在35g／L NaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明； 在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成1～2.5mm，稍隆起、混浊、无粘性、绿色菌落； 在SS平板上不生长或长出1～2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。 在羊血琼脂平板上，形成2～3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血。 在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。（与霍乱弧菌相区别） （3）生化反应：本菌在30g／L NaCl和70g／L NaCl培养基中生长，在无盐或100g ／L NaCl培养基中不生长。神奈川试验是致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。 2.微生物学检验 1）标本采集：主要是患者的粪便、可疑食物、炊事用具的洗涤液等。 2）检验方法及鉴定：①增菌培养：取标本0.5～1ml接种40g／L NaCl蛋白胨水中，37℃培养，若有本菌存在，一般数小时即出现明显混浊，即可分离培养；②分离培养：将标本或增菌培养物接种副溶血弧菌选择培养基35℃培养18～24h观察结果。菌落湿润、混浊无粘性，呈绿色；③鉴定：根据其形态、染色、多形性、活泼动力等特点，以及在选择培养基上的菌落特征，结合氧化酶试验阳性，在KIA上K/A，H2S（-）。在MIU上“++-”。以及嗜盐试验和血清学分型可作初步鉴定。 最后鉴定，必要时作进一步生化试验及毒力试验。 3.临床意义：
副溶血性弧菌所致食物中毒事件调查 [摘要] 目的查明1起食物中毒暴发的原因，为今后预防类似事件发生提供科学依据。方法开展现场流行病学调查，观察病例临床表现，实验室检测食物和生物样本。结果流行病学调查结果,2011-09-25中午在某酒店一楼就餐人群440人，至27日中午有恶心、呕吐、腹痛、腹泻（3次及粪便性状改变/24h）者，共有21例病例，罹患率4.77%；在1例患者肛拭样中查见副溶血性弧菌。结论该事件为一起副溶血性弧菌引起的食物中毒事件。 [关键词] 副溶血性弧菌；食物中毒；调查 2011-09-26，德阳市区某医院报告收治多名急性胃肠道疾病患者，且患者自述均参加了某婚宴。德阳市疾病预防控制中心接到调查通知后，派出调查员对此次事件进行了流行病学调查[1]。 1 基本情况 2011-09-25T12:30，某酒店同时承办2起婚宴，其中A婚宴在酒店一楼大厅举办，由一楼厨房制作食物，就餐人数440余人，当晚19时许，陆续有宾客出现胃肠道症状到医院求治。B婚宴在酒店二楼举办，由二楼厨房制作食物，就餐人数770余人，就餐者中无人发病。 2 流行病学调查 2.1 现场调查根据临床表现和实验室检验结果，病例定义为9月25日中午在某酒店一楼就餐人群，至27日中午有恶心、呕吐、腹痛、腹泻（3次及粪便性状改变/24h）者。通过查阅报告医院和区域内其他医院门诊日志，共搜索到21例病例，罹患率4.77%。该酒店一楼厨房较宽敞，设施设备齐全，持有效餐饮服务许可证，厨房人员均有健康证。厨师回忆浓汁兰花蟹和大展鸿兔制作过程是，24日下午将兰花蟹宰杀、清洗、改刀后放入冰柜保存，25日晨取出置于盆内常温解冻，11时左右将其沥水后过油2次，每次3~5min，后加调料再次翻炒3~5min，起锅后倒入一洗净的盆中，在室温下放置约1h，上菜前分盘浇汁；焖烧的大展鸿兔起锅时，厨师发觉盆子不够用，便让小工赶紧清洗刚盛装过未加工兰花蟹的盆子来盛放大展鸿兔，之后放置于室温下直至装盘。 2.2 患者调查21例中男性5人，女性16人，平均年龄37岁（19~80岁），临床症状包括腹泻（100%）、腹痛（85.71%）、恶心（85.71%）、呕吐（42.86%）、发热（3 3.33%）。首例病例于餐后6.5h出现，有恶心、呕吐、腹痛（脐周绞痛）、腹泻症状，呕吐、腹泻均在5次/日以上，大便呈洗肉水样便。末例出现在餐后29h，首末例发病时间间隔22.5h，平均潜伏期1 4.5h（中位数），最长潜伏期29h（图1）。 图1 2011-09某酒店腹泻病例发病时间分布 2.3 可疑食物调查婚宴有富贵水晶虾、浓汁兰花蟹、青椒干姜兔、韭香一品碗、回味百度鱼、糯米甜烧白、北京烤鸭、白灼芥菜、生椒牛仔骨、酸萝卜烩猪拐、粗粮烩咸鸡、带丝老鸭汤、香芋瓜子脆、极品贡粑、美味熊猫笋、麻辣土鸡、大展鸿兔、绝味海参、特色干果、缤纷时蔬、山椒泡木耳、水果拼盘等22道菜品，另有自带的品牌白酒、啤酒、饮料等。观察21例病例和29例对照的婚宴进食菜品和食用量，单因素分析结果显示，浓汁兰花蟹(OR ＝4.09)、大展鸿兔(OR＝ 3.80)与发病有关（表1）。 3 实验室检验 酒店对所有菜品和酒水饮料均有留样，但大多留样量不足，调查人员将留样按凉菜、汤菜、炒菜、海产品等混合成4个样品检验，检验4名患者及25名厨房人员肛拭子，在1名患者肛拭样品中检出副溶血性弧菌。 4 讨论 该事件共发病21人，潜伏期6.5~29h，发病前29h内有共同就餐史，发病时间集中，病例发病时间分布显示发病急剧，病例数量迅速到达高峰后缓慢下降，流行病曲线呈单峰，有点
副溶血性弧菌食物中毒 副溶血性弧菌食物中毒（又称食物中毒）是由于食用了被该菌污染的食品或者食用了含有该菌的食品后出现的急性、亚急性疾病。副溶血性弧菌是常见的食物中毒病原菌，在细菌性食物中毒中占有相当大的比率，临床上以胃肠道症状，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻及水样便等为主要症状。该菌引起的食物中毒具有暴发起病（同一时间、同一区域、相同或相似症状、同一污染食物）、潜伏期短（数小时至数天）、有一定季节性（多夏秋季）等细菌性食物中毒的常见特点。 一、病原学特征 肠炎弧菌和霍乱弧菌、创伤弧菌等细菌，都是弧菌科弧菌属的成员。但是，肠炎弧菌和其他弧菌在一些特征上，有着相当的不同。肠炎弧菌的长度约是0.3×2μm，其细菌本体不像典型弧菌的弯曲状，反而是笔直的棒状（类似杆菌）。此外，肠炎弧菌不能使乳糖及蔗糖发酵，与可以发酵葡萄糖及蔗糖的其他弧菌科细菌不同，这也是区别肠炎弧菌与其他弧菌的方法之一。由于这个特性，肠炎弧菌在tcbs培养基上呈现亮绿色，与一般弧菌的黄色不同○1。 肠炎弧菌对酸碱改变敏感，适合生长的pH值约在7.5-8之间，可耐受的酸碱值为pH5-11。肠炎弧菌与霍乱弧菌相同，都喜欢偏碱性的环境，但是与霍乱弧菌不同的是，肠炎弧菌必须要在环境有氯化钠存在的条件下才能增殖（但是如果使用血液洋菜胶培养基时则不需要添加氯化钠）。适合肠炎弧菌生长的盐度约在2-3%，超过10%或低于0.5%均不能增殖。 适合肠炎弧菌生长的温度约在20℃以上，温度在15℃以下时，生长会受到抑制。肠炎弧菌对热的耐受力相当低，使用一般的高温灭菌法即可完成杀菌。因此，因肠炎弧菌而造成食物中毒的患者，通常是肇因于食用未经煮熟的海产。此外，肠炎弧菌菌株在低温时也容易死亡。肠炎弧菌不耐干燥(aw=0.948时无法生长)，在干燥环境中会迅速死亡○2。 肠炎弧菌的增殖速度很快，在含3%氯化钠的脑心浸出物培养液中，只要8分钟左右就会分裂一次。而该菌在海产中的繁殖也相当迅速，例如：30℃时，肠炎弧菌在章鱼中从102CFU/g繁殖到107CFU/g仅需六小时。肠炎弧菌的增殖迅速是造成食物中毒的一大原因。 肠炎弧菌拥有一大一小的两个染色体(分别有3.2×106和1.9×106个碱基对)，是人类首次发现拥有复数染色体的细菌品种。 （1）形态染色：革兰阴性菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞、无荚膜。 （2）培养特性：需氧，营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。NaCl最适浓度为35g/L，在无盐培养基中不生长。本菌不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。生长所需pH为7.0～9.5，最适pH为7.7，在液体培养基表面形成菌膜。在35g/L NaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成1～2.5mm，稍隆起、混浊、无粘性、绿色菌落；在SS平板上不生长或长出1～2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。在羊血琼脂平板上，形成2～3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血。在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。（与霍乱弧菌相区别）
副溶血性弧菌 副溶血性弧菌是什么？ 副溶血性弧菌是我国沿海地区最为常见的食源性病原菌，广泛存在于近岸海水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中，主要引起食物中毒。 危害是什么？ 副溶血性弧菌感染最常见的症状是急性胃肠炎，一般恢复较快，少数病人可发展至脱水、休克。 在我国的流行状况 副溶血性弧菌感染常见于沿海地区，随着国民经济的发展，交通运输便利，目前我国内陆省份各大城市也较常见，发病高峰期是夏秋季，主要集中在7－9月。 最常见的污染食品是什么？ 副溶血性弧菌感染引起的食物中毒主要的污染食品是海产品，包括鱼类、软体动物(如生蚝、墨鱼、八爪鱼)和贝壳类动物(如龙虾、虾、蟹)；除了海产品外，其他食物(如烧肉、卤肉和凉拌菜)也可引起副溶血性弧菌感染，这主要是因为交叉污染所致。我国不少地区还发现淡水鱼携带副溶血性弧菌。 最常见发生的地点是哪里？ 副溶血性弧菌引起的食物中毒常发生在沿海地区，特别是旅游景点，高发于接待旅行团团餐的大排档。 典型症状是什么？ 副溶血性弧菌感染平均潜伏期为15小时，最短1小时，最长4天。国内报告9～20小时者占81％，10小时内者占70％。副溶血性弧菌感染的典型症状是急性胃肠炎，如呕吐、腹痛、腹泻等。剧烈腹痛、脐部阵发性绞痛为主要特点，腹泻多呈水样便。病程常为2－3天，恢复较快，少数病人发展至脱水、休克。 是否有易感人群？ 人群普遍易感，男女老幼均可患病，但副溶血性弧菌引起的暴发多以青壮年为主。经常暴露于少量细菌者，感染后临床症状一般较轻，如渔民大多有生食或半生食某些海产品的习惯，暴露机会甚多，但发生食物中毒者并不多，即使发病，症状也较轻。但内陆人员到沿海地区时，饮食稍有不慎，屡见发生病情较重的食物中毒。 1 / 2
本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。 2设备和材料设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2.2冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃。 2.3恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃。 2.4均质器或无菌乳钵。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 2.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL。 2.9无菌培养皿：直径90 mm。 2.10全自动微生物生化鉴定系统。 2.11无菌手术剪、镊子。 3培养基和试剂 3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。 3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。 3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。 3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。 3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。 3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。 3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。 3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。 3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。 3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。 3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。 3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。 3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。 3.15弧菌显色培养基。 3.16生化鉴定试剂盒。 4检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图1。
一起副溶血性弧菌食物中毒的实验室检测 摘要】目的对一起食物中毒的可疑病原菌进行相关的实验室检测。方法按照 gB/T4789.-2008、GB4789-2010，对食物中毒患者肛拭子24份、酒店厨师肛拭子、手表面涂抹样各4份、厨房间餐具等涂抹样17份进行致病菌检测。结果 24份患 者肛拭子标本中检出副溶血性弧菌12株，检出率为50%，其他样本未检出致病菌。结论综合流行病学调查、临床症状和实验室检测，证实本次食物中毒由副溶 血性弧菌引起。 【关键词】副溶血性弧菌食物中毒 2010年8月3日8：00本中心接报某酒店婚宴发生了一起食物中毒，经流行 病学调查、实验室检测并结合临床症状，确认为副溶血性弧菌引起，结果报告如下： 1 流行病学调查 2010年8月2日中午连云区某酒店举办婚宴，约370人用餐，发病人数36人。最短潜伏期为10小时，最长潜伏期为25小时，发病高峰在餐后13-15小时，有近20人发病。主要症状为腹痛、腹泻、呕吐、头痛、头晕，腹痛多是在上腹 部绞痛，腹泻次数多为7-10次/天，多为水样便。经抗菌治疗和输液补水，患者 均痊愈出院，未发生死亡病例。喜宴菜谱中有较多海产品（海虾、海蜇丝、鱿鱼、黄鱼等）及其他炒菜，由于酒店未对该餐次食物留样，未采集到剩余食品。 2 材料和方法 2.1 样品来源 患者肛拭子24份、酒店厨师肛拭子、表面涂抹样各4份、厨房间餐具6份、容器5份、冷菜间刀具2份、砧板2份，共计49件检样。上述样品保存于缓冲 蛋白胨水中送样。 2.2 培养基与试剂 各种增菌、分离培养基、系列生化反应管均购自杭州天和微生物试剂有限公司；科玛嘉沙门氏菌显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、大肠O157显色 培养基、弧菌显色培养基均购自郑州博赛生物技术有限公司；药敏纸片由中国药 品生物制品检定所生产；我萋氏琼脂由本实验室自制；均在效期内使用。 2.3 检验方法 对所采样品按照GB/T4789-2008、GB4789-2010方法对可能引起食源性疾病的 各种致病菌进行增菌及分离培养。将缓冲蛋白胨水管置37℃培养2h后，转种各 种致病菌的相应增菌液，按所需时间培养后，接种相对应的选择性培养基进行分离。 3 结果 3.1 检验结果 12份患者肛拭子检出副溶血性弧菌，未检出沙门氏菌、志贺氏菌、大肠0157、金黄色葡萄球菌。厨师肛拭子、手表面、厨房间餐具等涂抹样均未检出副溶血性 弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠0157、金黄色葡萄球菌。 3.2 培养特性 所采标本经氯化钠结晶紫增菌液增菌后，其中12份患者肛拭子增菌液呈均匀浑浊，有菌膜，接种各选择性培养基，经培养后可疑菌落形态如下：TCBS平板上：菌落呈圆形，蓝绿色；科玛嘉弧菌显色培养基上：为紫红色，中等大小菌落；血 平板上：为灰白色，周围有透明溶血环菌落。
副溶血性弧菌实验活动风险评估报告 一、生物学特性 （一）种类和细菌分型 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，属于弧菌属，为革兰阴性菌，主要的栖息地在海水中。 副溶血性弧菌有鞭毛（H）、荚膜多糖（K）和菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原为所有菌株共有，无助于分型。目前，已知至少有13种O抗原、65中K抗原，根据O抗原、K 抗原可以进行血清学分型。 （二）来源 1950年，日本大阪因食用遭肠炎弧菌污染的青鱼干而发生了一起集体食物中毒事件，造成272人中毒，其中20人死亡。1960年，日本东京及千叶县一带发生了多起因食用竹荚鱼而导致食物中毒的事件，检验后发现病原菌是肠炎弧菌，引起医学界的关注。对此，厚生省（今为厚生劳动省，是日本中央政府的卫生主管单位）将肠炎弧菌列为引起食物中毒的重要病原菌之一，并进行相关研究。1963年，日本国立预防卫生研究所（今为日本国立传染病的研究所）的福见秀雄和坂崎利一证明了此种细菌应属于弧菌属，将学名改定为Vibrio。 （三)传染性 传染源为病人，本病可长年发病，多在夏秋季6~10月，发生于沿海地区、海产品大量上市时，常造成集体发病，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。集体发病时往往仅少数病情重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，因此，不存在病人散步病菌而造成广泛流行的说法。另外，有肠道病史的居民或渔民带菌率偏高，也是传染源之一。 （四）传播途径 副溶血性弧菌分布极广，主要在海水和水产品中，我国华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为47.5%~66.5%，海产鱼虾的平均带菌率为45.6%~48.7%，夏季的指标可高达90%以上。 副溶血性弧菌食物中毒，是由进食含有该菌的食物所致。含有该菌的食物主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇。其次，为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品污染。若食品制作时，熟食被接触过生海产品的刀、砧板容器等污染，熟食保管不善，则一旦受到副溶血性弧菌污染，其增代时间仅10min，故易于大量繁殖，足以达到致病菌量。 （五）易感性 男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。 （六）潜伏期 潜伏期5~72h，多数为10h左右，平均24h。进食被副溶血性弧菌污染的食物后10h 左右，会出现上腹部阵发性绞痛、腹泻。多数患者在腹泻后出现恶心、呕吐、腹泻多为水样便，重者为粘液便和黏血便。呕吐、腹泻重，失水过多者可出现虚脱并伴有血压下降。本病病程为1~6d不等，大部分病人发病后2~3d恢复正常，一般恢复较快，少数重病人由于休克、昏迷而死亡。
浅谈副溶血性弧菌 摘要：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。该菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量副溶血性弧菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。本文综述了副溶血性弧菌的生理学特性，来源，中毒特点，检测，预防措施等概况 关键词：副溶血性弧菌；食品中毒；食品安全 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。副溶血性弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。故其在含盐量高的培养基上(2%-5%)生长良好，但在无盐的培养基上则不能生长，因此被称为嗜盐性弧菌。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。2010年爆发的对虾“偷死病”就是由副溶血性弧菌引起。 一、生物学特性 副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性，多形态弧状杆菌。其菌体呈弧状、杆状、或丝状，无芽孢且无荚膜。大多数菌体在液体培养基中有单端鞭毛、能运动。此菌具有细胞色素氧化酶，不分解蔗糖，但能在不产气及不产生硫化氢的情况下分解葡萄糖而产酸等生化特性。副溶血性弧菌为一嗜盐性细菌，必须在含盐0.5%-8%的环境中方可生长，尤以含盐量在2%-4%的情况下最佳。故其在无盐的培养基上不能生长，在含盐浓度过高(10%以上) 的培养基上也无法生长。副溶血性弧菌能够在温度为5-44℃范围内生长，但以30-35℃为最佳，当温度低于40℃时则停止生长，适宜生长的pH 为7.5-8.5，以pH7.7为最佳，在pH 低于6 的
副溶血弧菌及其检测方法 1.副溶血弧菌 副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中1～3分钟即死亡，加热56℃5～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。 副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。 已知副溶血弧菌有13种O抗原及65种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(TDH)和分子量48000的TDH类似溶血毒(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。 2.副溶血弧菌的检测方法 （1）溶血性试验 我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。 此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。 有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。 （2）血清学试验 副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），其中血清学分类上有意义的是前两者：O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。 进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集
副溶血弧菌 形态染色 1、为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列 2、一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。 3、和其他弧菌的异同： （同）副溶血性性弧菌和霍乱弧菌、创伤弧菌等细菌，都是弧菌科弧菌属的成员。 （异）副溶血性性弧菌的长度约是0.3×2μm，其细菌本体不像典型弧菌的弯曲状，反而是笔直的棒状（类似杆菌）。 培养特性 1、在无盐的条件下不生长，在含2％~3％氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10％以上时不繁殖。 2、需氧性强，常在液体表面形成菌膜 3、液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。 4、在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。 5、嗜盐：VP 在含氯化钠5 –(20-30－最适) g／L的培养基上 生长，无盐和110g ／L以上不生长。
6、生长温度和PH：最适为37℃，4 ℃不生长,最适pH为7.4-8.0 7、需氧性:需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢 8、肉汤液体培养基中养基:多数菌株呈现混浊，表面形成菌膜，R 型菌发生沉淀； 培养基形状 固体SS琼脂上菌落光滑湿润，无色透明，具有辛辣刺鼻的特殊气味，菌落完整， 较扁平，如蜡滴，常与培养基紧粘而不易刮离。 氯化钠血琼脂上可见溶血环 人血琼脂平板上为绿色溶血环 氯化钠蔗糖琼脂上菌落呈绿色。 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS)琼脂典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm~3mm。
出口食品副溶血性弧菌检验方法 1.适用范围 本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。 2.主要试剂和仪器 2.1.主要试剂 30g/L氯化钠稀释液：见8.1； 60g/L氯化钠蛋白胨水(PW)：见8.2； 氯化钠多粘菌素B肉汤(SPB)：见8.3； 硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂(TCBS)：见8.4； 氯化钠三糖铁琼脂(TSI)：见8.5； 嗜盐性试验用胰胨水(TB)：见8.6； 胰胨大豆琼脂斜面(TSA)：见8.7； 靛基质试验用培养基(I)：见8.8； 氨基酸试验用培养基：见8.9； V-P半固体琼脂(VP)：见8.10； 糖类分解试验用培养基：见8.11； 42℃生长试验用培养基：见8.12； O/F试验用培养基(HLGB)：见8.13； 神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA)：见8.14。 2.2.仪器 试管：17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm； 吸管：1mL、10mL； 培养皿：直径90mm； 广口瓶或三角瓶； 电动均质器； 电动试管振荡器； 37℃恒温箱； 42℃恒温水浴箱； 试管架。 3.样品制备 3.1.冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18h解冻。若不能及时检验，应放于－15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6～10℃冰箱保存，在24h内检验。 3.2.取样：以无菌操作进行。 鱼类：取鱼体不同部位。 贝类：取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。 甲壳类：取包括鳃及肠的部分或整体。 3.3.以无菌操作称取50g检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。 3.4.加30g/L氯化钠稀释水450mL，均质(8 000r/min)1min，使成1∶10稀释液(如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1∶10稀释液，并充分振荡)。 3.5.用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入装有9mL 30g/L氯化钠稀释水
副溶血性弧菌分离 准备材料 1. 3％氯化钠碱性蛋白陈水〔APW) （成分:蛋白胨10g，氯化钠30g，蒸馏水1000ml，PH 8.5士0.2） 2. 硫代硫酸盐柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂。 3. 3％氯化钠胰蛋白胨大豆〔TSA）琼脂（成分:胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠30.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，制法：将上述成分混合，加热并轻轻搅拌至溶解，121摄氏度高压灭菌15min，调节PH至7.3士0.2。） 4. 弧菌显色培养基 操作步骤 1.样品制备 1.1冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2—5摄氏度不超过18小时解冻，若不能及时检验应放于--15摄氏度左右保存；非冷冻而易腐蚀的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置2-5摄氏度冰箱保存，在24h内检验。 1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃，如为带壳贝类或甲壳类则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按仁上述要求取相应部分。 1.3 以无菌操作取检样25g（ml），加人3 ％氯化钠碱性蛋白栋水225 ml ，用旋转刀片式均质器以8000r/min创min 均质1min，或拍击式均质器拍击2 min ，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL 的灭菌容器内，加225ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。 2 增菌 2.1 定性检测 将上述1:10稀释液于36 ℃士1 ℃培养8h ～18h 2.2 定量检测 2.2.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL ，注入含右9mL 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1：100 的稀释液 2.2.2 另取1mL 灭菌吸管，按上述操作依次制备10倍递增稀释液每递增稀释一次，换用一支lml 灭菌吸管. 2.2.3 根据对检样污染情况的估计,选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有9ml 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL 。置36℃士1℃恒温箱内，培养8h--18h 3 分离 3.1 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于36 ℃士1 ℃培养18h--24h 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圆形、半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。从培养箱取出TCBS 平板后，应尽决（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm--3 mm. 4 纯培养 挑取三个或以上可疑菌落，划线 3 ％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃土l ℃培养18h--24h.
副溶PFGE程序
2．纯水脱色4-5小时。3．凝胶成像系统拍照。
试剂储存液的配制 1、1M Tris-HCl，pH8.0 121.1g Tris base溶于650-700ml的纯水中，加入80ml 6N HCl，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。 或者157.6g Tris-HCl溶于800ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。 2、10N NaOH 400g NaOH小心溶于800ml纯水中，冷却至室温，加灭菌的纯水使终体积至1000ml。 3、0.5M EDTA，pH8.0 186.1g Na2EDTA-2HO2溶于800ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000ml，分成数份，高压灭菌。 4、20% Sodium Dodecyl Sulfate（SD S）－十二烷基磺酸钠：用于E.coli O157:H7，Salmonella和Shigella sonnei，PFGE 将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中，在35-45℃轻轻混匀溶解，定容至100ml。 5、10%Sarcosyl－十二烷基肌氨酸钠 10g Sarcosyl溶于80ml的纯水中，水浴40-50℃助溶，定容至100ml，不用高压。 6、20mg/ml蛋白酶K储存液 100mg Proteinase K粉末溶于5ml灭菌纯水中，混匀，分装在1.5ml离心管中，每管500-600 ul，-20℃保存备用。 7、10×Tris-Borate EDTA Buffer（TBE），pH8.3 0.9M Tris base（108g） 0.9M Boric Acid（55g） 0.02M EDTA，pH8.0（40ml，0.5M） 溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌 或者5×TBE： 0.9M Tris base（54g） 0.9M Boric Acid（27.5g） 0.02M EDTA，pH8.0（20ml，0.5M） 溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌