收稿日期：2005–04–06；修回日期：2005–06–01
基金项目：国家863计划项目（2002AA626020）资助 作者简介：陈丽梅（1981–），女，蒙族， 内蒙古赤峰人，主要从事水产动物遗传多样性研究，E –mail:chenlimeicd@yahoo. https://www.doczj.com/doc/0412381650.html,;孔晓瑜，通讯联系人，E –mail:carlzyu@https://www.doczj.com/doc/0412381650.html,
Marine Sciences/V ol.29,No.8/2005 27
3种蛏类线粒体16S rRNA 和COI 基因片段的序列比较及其 系统学初步研究
陈丽梅，孔晓瑜， 喻子牛，于珊珊，徐 晖
(中国海洋大学 教育部海水养殖重点实验室，山东 青岛 266003)
摘要: 对3种蛏类大竹蛏(Solen grandis )，长竹蛏(Solen strictus )和小刀蛏(Cultellus attenuatus )的线粒体16S rRNA 和COI 基因片段序列进行了比较并对其系统学进行了初步研究。得到的序列总长度分别为472~481bp （16S ）和658bp （COI ）。3种蛏序列的碱基组成均显示出较高的A+T 比例（16S rRNA 基因62.1%；COI 基因62.8%）。对位排序比较表明，16S rRNA 片段种内个体间变异较小，3种类间存在128个碱基变异位点( 其中包括127个简约信息位点)和5个插入/缺失位点， 总共12个碱基长；COI 片段有200个碱基存在变异,其中包括191个简约信息位点，不存在任何插入/缺失位点。数据分析结果表明16S rRNA 和COI 基因片段大竹蛏与长竹蛏两片段的遗传距离分别为 0.0856和0.1712，两竹蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为0.3054 ，0.2798和0.2662， 0.2933。作者认为小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，结果支持将其提升为刀蛏科的分类观点。3种蛏类线粒体16S rRNA 和COI 基因在种间明显的多态性，证实了16S rRNA 和COI 基因序列均普遍适用于蛏类种及以上阶元的系统学分析。
关键词：竹蛏科；线粒体；16S rRNA 基因；COI 基因
中图分类号 ：Q78 文献识别码 A 文章编号 1000－3096(2005)08－0027－06
蛏类大多分布于热带和温带，生活于潮间带至水深400m 左右的海域，是常见的经济贝类种类。特别是长竹蛏(Solen strictus Gould)、大竹蛏(Solen grandis Dunker)、小刀蛏(Cultellus attenuatus Dunker)在我国分布很广，北起辽东半岛，南至海南都有分布，是我国沿海群众所
喜爱的海产贝类之一，在食用贝类中占有相当重要的地位。蛏类隶属于软体动物门（Mollusca ），双壳纲（Bivavalvia ），异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)。在基于形态性状系统学上，目前对这几种蛏类的相互关系存在某些不同观点，齐钟彦[1]
将3种蛏归为竹蛏科（Solenidae ），分属竹蛏属(Solen )和刀蛏属
(C ultellus )。徐凤山
[2]
则主张将长竹蛏、大竹蛏分为竹蛏科并将
刀蛏属提升为刀蛏科Cultellidae)。
线粒体DNA 由于具有变异大、母系遗传、解析能力强且检测方便等优点而在系统学研究、遗传变异分析、种类鉴定等领域应用广泛。作者利用序列分析法，对3种蛏的mtDNA 16S rRNA 和COI 基因片段序列进行比较,分析了3种蛏两片段的序列组成特性和系统关系，以期为进一步的遗传分析、种质鉴定和系统进化研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大竹蛏，长竹蛏，小刀蛏购自青岛农贸市场。鉴定后取外套膜，-70℃冰箱保存。 1.2 DNA 提取和PCR 扩增
随机选取大竹蛏3个，长竹蛏3个，小刀蛏5个，剪取外
套膜约100mg 切碎，采用常规的“酚-氯仿”法提取基因组DNA 。所用16S rRNA 基因引物序列为：16S AR :5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT -3’；16S BR:5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’。COI 基因引物序列为：RCOIA ：5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’；RCOIB ：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’。 PCR 反应总体积为25μL ，其中含2.0mmol/ L MgCl 2，0.2mmol/L 每种dNTPs ，0.2μmol/L 每种引物，1μLDNA 模板，1UTaq (TAKARA)，2.5μL 10 ×缓冲液，补足灭菌水至终体积。PCR 反应程序为：94℃预变性2min 后，94℃变性45s ，46℃退火1min(COI 48℃)，72 ℃延伸1min ，共运行35个循环，最后一个循环结束后72℃再延伸5min 。PCR 产物用含有溴化乙锭的1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察、照相。用UNIQ-10柱式PCR 产物纯化试剂盒（上海生工）纯化后，进行双向测序。 1.3 序列分析
每个个体测得正反向序列用BioEdit 软件进行拼接，结合人工校正。用DNASP 软件检测多态位点（polymorphic sites ）、简约信息位点数（Parsimony informative sites ）和序列的碱基组成。
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28用球蚬科的Sphaerium striatinum 相应序列(GenBank 序列号 AF120666，COI ；AF 038999，16S)、蚬科河蚬 Corbicula fluminea (GenBank 序列号AF120667, COI ；AF152045，16S) 做外群进行两个基因片段对位排序，根据Kimura 双参数模型计算遗传距离（D ），相应的标准误差用Bootstrap 方法（重复数=1000）计算。NJ （neighbor -joining ）和MP （maximum-parsimony ）系统树通过MEGA2软件构建，采用Bootstrap （重复数=1000）检验分子系统树各分支的置信度。
2 结果
2.1 序列特性及碱基组成
经PCR 扩增，分别得到3种蛏类清晰的16S rRNA 和COI 基因片段扩增产物。序列测定表明，大竹蛏，长竹蛏，小刀蛏16S rRNA 序列长度分别为480bp,481bp,472bp 。COI 基因片段中，3种蛏类长度均为658bp 。3种蛏的16S rRNA 和COI 序列片段的碱基组成如表1所示，16S rRNA 序列中，平均T 30.7%，
表1 3种蛏16S rRNA 和COI 基因片段的碱基组成（%）
Tab.1 The base composition (%) of 16S rRNA and COI gene fragments of the three species
片 段
16S COI
种类
T C A G A+T
T C A G A+T Solen gradnis 28.1 15.0 32.7 24.2 60.844.8 13.7 19.3 22.2 64.1 S.strictus 30.1 13.9 32.2 23.7 62.341.3 16.6 18.4 23.7 59.7 Cultellus attenuatus 32.4 13.8 30.1 23.7 62.5
45.1 13.8 18.5 22.5 63.6 平均
30.7 14.1 31.4 23.8 62.1
44.3 14.4 18.5 22.8 62.8
Ｃ 14.1%，A 31.4%，G 23.8%，A+T 62.1%，COI 序列中为T 44.3%，Ｃ14.4%，A 18.5%，G22.8%，A+T 62.8% (表1)，A+T 明显高于G+C 含量。
在16S rRNA 片段中, 3个种的种内个体间变异较小，大竹蛏有2个转换（A-G ，C-T ），长竹蛏3个序列完全相同，小刀蛏颠换转换各1个（G-T ，G-A ）。3种类间序列的长度变异主
要是由12个碱基插入/缺失造成的，其中最长的插入/缺失(7个碱基)位于位点44-50；其它几个一个或两个碱基的插入/缺失散布于序列位点341-430之间的4个地方。3种类序列间共检测到有128个变异位点，其中简约信息位点127个（图1）。而从大竹蛏和长竹蛏来看，两者之间只有1个插入/缺失（1个碱基）、46 个变异位点。
100
S.grandis CGCCTCTTGA GGAAAGAACA TGAGAGGTTG TACCTGCCCT ATGGCTTCAT AAGGTGAAGT TAAATGGTTG CAGCTAAATG CTGTACTAAG GTAGCGTAAT
S.strictus .......... TTTTT..TA. .......... .......... ....T..T.A ...A.A.GAC .......... .......... .......... .......... C.attenuatus .......... TATT.T.TT. C......... GG.......G G..------- ..TAACT.T. https://www.doczj.com/doc/0412381650.html,. ...TG..TAA ....G..... ..........
200
S.grandis AAGTTGCCTC TTAATTGGGG GCTAGAATGA AGGGTTTGAC GTAAAAAAGT TTGTCTCCAA AATAAAAGTA TGAAGTTTTC TTTTCAGTGA AAAGTCTGAT S.strictus .......... .......... .......... .......... ........A. .......... ....GT.... .......... .......... ....C....A C.attenuatus ..A...G... ........A. AAGG.T.... .T........ ..GGTGGTA. C......AGT .....T.AGG .......... ....T...T. ....A..TGA
300
S.grandis ATAATGGTAA AAGACGAGAA GACCCTGTCG AGCTTGATAA AACATACAAA AAACAGTGTA TTAATAAGTT TAGCTGGGGC AGTTCGGAAC AAA-AAAAAG S.strictus ..TG..A... .......... .......... .......... .G.G.GT... G.GTT..A.. .......... .......... .......... ...T...... C.attenuatus ..GGC.T... .......... .......... .......... ..-...T.G. GTGTTT.TGT A......... .......... ..C.GAA... C.TA...T..
400
S.grandis TTTCGTTTAT ATAATAAAGA TCCGACTCAT GTCGAATG-A AGAAAAAGCT ACCGCAGGGA TAACAGCGCT ATTCCTCTTG AGAGGACTAA TTGAAGGGGG S.strictus ..C.....G. G.T....... .......A.. .......A-. .......... .......... .......... ...TT..... .......... .......AAA C.attenuatus ...TC...T. T.--.G.... ....GT.T.. AC...TCAT. .......... .......... ........T. ..CTT..C.. ....A..... ........AA
482
S.grandis AGATTGCGAC CTCGATGTTG GATTAAGGTT ACTTTCTGGT GCAGCCGTTA GAGTAGTAAG ACTGTTCGTC TTTTAATACC TT S.strictus .......... .......... .........A .......... .......... .......... .......... ......A... .. C.attenuatus G.T....... .......... ......AA.. T....T.... .T...A.C.. A.A.....G. .......... C.....A.TT ..
图1 3个种16S rRNA 基因片段序列比较
Fig.1 Sequence alignment of partial 16S rRNA gene fragment in the three species.
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与16S rRNA 片段相比，COI 序列不存在任何插入/缺失位点，种内个体间变异位点数为2～18个，大竹蛏种内有2个变异（A-G ，C-T ），长竹蛏共11个变异（转换6个，颠换5个），小刀蛏18个变异（转换16个，颠换2个）。但种间共有200个变异位点，其中简约信息位点191个（图2）。
扩增的COI 片段编码的肽链长219个氨基酸， 碱基替换的位置在第一、二、三位都存在，但大部分发生在密码子的第3位上，由于密码子兼并现象，虽然在碱基上有200个位点存在差异，但在序列上，仅有37个氨基酸有变化。3种蛏类间的氨基酸变异如图3所示，其中，大竹蛏和长竹蛏之间只有4个氨基酸变异，而大竹蛏和小刀蛏之间有34个氨基酸变异。 2.2 遗传距离和系统树
根据Kimura 双参数模型得出包括外群在内的遗传距离（D ）（表2），由16S rRNA 基因片段所得到的遗传距离中，大竹蛏和长竹蛏之间遗传距离最小（D =0.0856），大竹蛏和小刀蛏之间遗传距离最大（D =0.3054）。球蚬科Sphaerium striatinum 和蛏类之间的遗传距离在0.3643～0.4401之间,河蚬在0.3288～0.3798之间。COI 基因片段的遗传距离这四个数值相应的为0.1712 和0.2662；0.3867～0.4312, 0.3187～0.4254。
对实验所有个体和外群进行聚类分析，得到3种蛏的NJ ，MP 树，两种系统树的拓扑图总体趋势相似，所有的种内个体均首先聚在一起；而种间的聚类可以看出隶属于竹蛏属的大竹蛏和长竹蛏最先聚类，并得到很高的Bootstrap 支持，然后与刀蛏属的小刀蛏聚类。
100
S.grandis AACTTTATAT ATTATTTTTG CTGTTTGGTC TGGTTTAGTT GGTACTAGGC TCAGAATTTT GATTCGGTTA GAGTTAGCTC GGCCAGGGTC ATATTTAGGA
S.strictus G......... .......... .......... .......... ..A.....A. .T........ A.....A... ..C..G.... ....T..T.. T..C.....C C.attenuatus T.....G... ..G.....G. ..T....A.. ...G...... .........T .A..GT.AA. A......... .......... .T..T..TGG T.T.A.G..T
200
S.grandis GATGGGCATT TGTATAATGT AATTGTGACT GCCCATGCTT TTATTATAAT TTTTTTTCTT GTTATGCCTA TGATGGTTGG TGGTTTTGGT AATTGGTTAG S.strictus .....T..C. .A........ G.....T... .......... .......G.. .......... ..G.....A. .A........ G......... ......C...
C.attenuatus ..C.A..... .A........ T.....T... .......... .......G.. ...C...T.G .....A.... .A.....A.. G..G...... .....AC..T
300
S.grandis TTCCATTGAT GCTTACATCT CCAGATATGT GTTTTCCTCG TATGAATAAT ATGAGGTTTT GGTTGTTGCC ACCAGCTTTG TTTATACTTT TGTTTTCTGG S.strictus ....GC.... .T.G..T... ..T....... ....C..... G.....C... .......... ..C....A.. ......A... A....G..GC .......A.. C.attenuatus .A..T..... .T.G..T... ..T....... C......... .T........ T......... .A..AC.T.. TTTT...... ...T.TT.G. .A.GG.....
400
S.grandis GTTAGCTGGT ACTGGTGTTG GTGCTGGTTG GACAATTTAT CCGCCTTTAT CTGGAAATTT AGCTCATGGA GATCAGTCAA TAGATTTTGC TATTTTTTCT S.strictus AC.G...... ........G. .G..A..... A..T..C... https://www.doczj.com/doc/0412381650.html,.T. .......... G........C .....A..T. .G........ .........G C.attenuatus T..T.T...A .GG..AA... .......... A........C ..C..G.... ....T..C.. G..C...A.. AG..CT..T. .G....A..G G.........
500
S.grandis ATGCATTTGG CTGGTGTTTC TTCTATTCTT GGTGCAATTA ATTTTGTTAC TACAATAATT AATATACGAC CTGGAATTAT AGAATTGAAG CGGGTTCCGT S.strictus ........A. ....G..... ...G...T.A ..C..T.... .......... A..T...... .....G..G. .A......G. G..G...... ........AC C.attenuatus ..A....... ......C... .......T.G ..A..TGC.. .......... .......... ..C..G..T. ....TG.... G..GC.T..A ..T...AG.C
600
S.grandis TATTTGTTTG GTCTGTTGCT ATTACAGCTT TTTTGCTTAT TATTGCTATA CCTGTATTGG CTGGGGCTCT TACTATGTTG CTGACTGATC GTCATTTTAA S.strictus .G........ .........A ..C....... .C..A...G. A.....C..G .....C.... .......AT. G......... T......... .......... C.attenuatus .G........ ......AAT. .....T.... ....AT.AG. GT.G.....G .....G..A. ....T...T. A..A..AC.A ..T..A.... ....C.....
658
S.grandis TACTTCTTTT TTTGACCCGG GTGGGGGTGG TGATTCAATT TTATTTGTTC ATTTGTTT S.strictus .......... ..C..T..T. .C..T..... G.....T... ........C. .C...... C.attenuatus .......... .....T..TA .G..C..... G...C.T... ..G....... ........
图2 3个种COI 基因片段序列比较
Fig. 2 Sequence alignment of partial COI gene fragment in the three species
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30
100
S.grandis TLYIIFAVWS GLVGTSLSIL IRLELARPGS YLGDGHLYNV IVTAHAFIMI FFLVMPMMVG GFGNWLVPLM LTSPDMCFPR MNNMSFWLLP PALFMLLFSG S.strictus .......... .......... ...D...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...I...... C.attenuatus ...M.L.F.. ........LM .........G FM..E..... .......... .......... ......L... ......S... L..L...... F...F..W..
200
S.grandis LAGTGVGAGW TIYPPLSGNL AHGDQSMDFA IFSMHLAGVS SILGAINFVT TMINMRPGIM ELKRVPLFVW SVAITAFLLI IAMPVLAGAL TMLLTDRHFN S.strictus .......... .......... .......... .......... .......... .........V .......... .........V .......... .......... C.attenuatus FV.S.I.... .......... ..SSP...YG ........A. .....A.... ........V. .....S.... ..I......V L......... ..........
219
S.grandis TSFFDPGGGG DSILFVHLF S.strictus .......... ......... C.attenuatus ......S... .P.......
图 3 3种蛏COI 基因氨基酸序列片段比较
Fig.3 Alignment of amino acid sequences of partial COI gene fragment in the three species.
表2 3种蛏类及其外群的16S rRNA 和COI 基因序列之间的遗传距离和标准误差
Tab.2 Genetic distances(D ) and corresponding standard errors of 16S rRNA and COI gene fragments among the three species and
outgroups. 片
段
16S rRNA 基因 COI 基因
种类
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 S.grandis * * * 0.0142 0.0296 0.0384 0.0354* * * 0.0171 0.0218 0.0289 0.0301 2 S.strictus 0.0856 * * * 0.0283 0.0362 0.03430.1712 * * * 0.0236 0.0321 0.0313 3 .attenuatus 0.3054 0.2798 * * * 0.0339 0.03140.2662 0.2933 * * * 0.0297 0.0309 4 .striatinum 0.4401 0.4139 0.3643 * * * 0.03410.3873 0.4312 0.3867 * * * 0.0256 5 .C.fluminea 0.3798 0.3628 0.3288 0.3721 * * *
0.3834 0.3994 0.4254 0.3187 * * *
注：遗传距离：对角线下方，标准误差：对角线上方
3 讨论
一般认为, 在线粒体基因组中,12S rRNA 和16S rRNA 基因进化速率低，比较保守, 而COI 基因为变异性较大的区域,在不少无脊椎动物检测到了较大的变异
[3,4]
。从本实验的结果可以看
出,在长度为481bp 的16S rRNA 片段中, 蛏类3个种间存在128个碱基变异，而在长度为658bp 的COI 基因片段中, 蛏类3个种之间存在高达200个碱基的变异。从种内变异来看，以在16S rRNA 和COI 基因中种内变异都是最大的小刀蛏为例，在16S rRNA 中种内变异为0.5%，而在COI 基因中则高达2.3%。
由此可见，在文中得到的3种蛏的16S rRNA 和COI 基因序列中，COI 基因表现出的种内和种间趋异都要高于16S rRNA 基因，说明在蛏类的3个种类中，COI 基因的进化速率与16S rRNA 基因相比要快，16S rRNA 基因则相对保守一些。 蛏类线粒体16S rRNA 和COI 基因在不同种间其多态性的明显差异，
证实了16S rRNA 和COI 基因序列均普遍适用于蛏类种以上阶元的遗传多样性分析。
作者得到的蛏类两片段A+T 含量相差不大,分别为62.1%和62.8%，都明显高于G+C 含量，这一结果与其他研究者在头足类，甲壳类，双壳贝类等的16S rRNA ，12S rRNA 和COI 基因中观察到的结果一致[3~8]，即较高的AT 含量，是目前观测到的无脊椎动物线粒体DNA 序列中的普遍现象
［9］
。
由16S rRNA 和COI 基因片段得到的系统树及遗传距离所表现的趋势相似，5种帘蛤目的贝类中，大竹蛏与长竹蛏两片段的遗传距离分别为 0.0856和0.1712，两者在形态上相似度也较高，亲缘关系较近。两蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为0.3054 ，0.2798和0.2662， 0.2933。与两竹蛏相比，小刀蛏与两者之间的距离明显要大一些，3种蛏类与外群的球蚬科Sphaerium striatinum 和蚬科河蚬的遗传距离均在 16S rRNA 0.3288～0.4401和COI 基因片段0.3187～0.4312 之间，在 COI 基因片
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段中灯塔蛤科的缢蛏（Sinonovacula constricta ）与两竹蛏的遗传距离为0.2843 和 0.3256①
。基于两片段的系统树聚类结果可看
出所有种内个体均首先聚在一起。同属的两竹蛏先聚在一起然后再与小刀蛏聚类，外群的两种则依次加入。
S.grandis 1 S.grandis 3 S.grandis 2 S.strictus 4 S.strictus 1 S.strictus 8 C.attenuatus 4 C.attenuatus 3
C.attenuatus 1 C.attenuatus 2 C.attenuatus 5 S.striatinum C .fluminea
100
69 100
100
52
100
95
S.grandis 1 S.grandis 3 S.grandis 2 S.strictus 4
S.strictus 1 S.strictus 8 C.attenuatus 4 C.attenuatus 3 C.attenuatus 2 C.attenuatus 1 C.attenuatus 5 S.striatinum C .fluminea
73
99
99
99
99
76
NJ 树 MP 树
图4 基于3种蛏和外群16S rRNA 基因的NJ 和MP 系统树
Fig.4 NJ and MP phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequences of the three species and out groups
S.grandis 1 S.grandis 3 S.grandis 2 S.strictus 10
S.strictus 1 S.strictus 8 C .attenuatus 1 C .attenuatus 5
C .attenuatus 2 C .attenuatus 3 C .attenuatus 4 S.striatinum C .fluminea
50 100
63
100 97
80
79
100
99
100
S.grandis 1 S.grandis 3 S.grandis 2 S.strictus 10 S.strictus 1 S.strictus 8 C.attenuatus 1 C.attenuatus 5 C.attenuatus 2
C.attenuatus 3
C.attenuatus 4 S.striatinum
C .fluminea
67
100
97
78
77
100
100 99
100
NJ 树 MP 树
图5 基于3种蛏和外群 COI 基因片段序列的NJ 和MP 树
Fig.5 NJ and MP phylogenetic trees based on COI gene sequences of the three species and out groups.
杨明等[10]做了4种竹蛏的肌浆蛋白的电泳分析，通过蛋白质图谱的相似性对大竹蛏，长竹蛏，小刀蛏以及缢蛏的分类关系进行了探讨，得出大竹蛏，长竹蛏之间的相似性较大为0.52，小刀蛏与两竹蛏之间为0.13～0.32，缢蛏与两竹蛏之间为0.13～0.20。综合上两基因片段分析结果与蛋白质图谱分析结果的比较，作者认为小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，相比较形态的分类结果支持徐凤山将其提升为刀蛏科的分类观点。
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Sequence comparison and phylogenetic analysis of mtDNA
16S rRNA and COI gene fragments in three species of razor
shell
CHEN Li-mei , KONG Xiao-yu , YU Zi-niu , YU Shan-shan , XU Hui
(Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)
Key words ：Solenidae ；mitochondrial DNA ；16S rRNA gene ；COI gene Received: Apr., 11, 2005
Abstract ：Sequence comparison and phylogenetic analysis of mtDNA 16S rRNA and COI gene fragments in three species of razor
shell were made using PCR and direct sequencing. The three species are Solen grandis Dunker ,Solen strictus Gould and Cultellus attenuatus Dunker. Nucleotide sequences of 472~481bp for 16S rRNA gene and 658bp for COI gene were obtained, respectively. A high percentage of A+T base composition in the two sequences was observed. Alignment indicated that variation level of intra-species was low in both sequences. Five indels and 128 variable sites were detected for 16S rRNA gene fragment （of which 127 were parsimony informative ones ）across the three species. Two hundred polymorphic sites were detected in COI gene fragments and 191 were parsimony informative among the three species, with no indels. Genetic distances between S. grandis and S. strictus were 0.0856 (with 16S rRNA gene) and 0.1712 (with COI gene), respectively. However, with both sequence data, the genetic distances between the two Solen species and C. attenuatus were significantly larger, with numbers of 0.3054 and 0.2662 for 16S rRNA gene data, and numbers of 0.2798 and 0.2933 for COI gene data, respectively. These genetic distances have reached family level, and are in favor of the opinion that genus Cultellus should be promoted to family Cultellidae.
(本文编辑:张培新)
人类线粒体基因组与疾病 1、线粒体基因及基因组介绍 人类线粒体DNA（mtDNA），共包含37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸（tRNA）、2个编码核糖体核糖核酸（12S和16S rRNA)，13个编码多肽。 2、线粒体基因及基因组分析的现状和临床意义 对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。这些基因突变可能在mtDNA上，也可能发生在核基因上，线粒体的遗传方式可能为常染色体隐形遗传、X-连锁遗传、母系遗传，有些还是新突变。由于线粒体病涉及基因众多，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。 3、线粒体基因及基因组分析测定 （1）13个编码多肽的基因 编码产物基因分 析 基因变异对应的常见线粒体病种 类 NADH dehydrogenase (complex I)MT-ND1Leber遗传性视神经病 MT-ND2心肌线粒体病，Leber遗传性视神经病 MT-ND3进肌阵挛，癫痫，视神经萎缩MT-ND4 Leber遗传性视神经病，线粒体肌 病，Leber遗传性视神经病，张力 障碍 MT-
ND4L Leber遗传性视神经病 MT-ND5Leigh综合征，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症 MT-ND6Leber遗传性视神经病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，糖尿病，肌张力障碍 coenzyme Q-cytochrome c reductase/Cytochrome b(complex III)MT-Cytb 慢性游走性红斑，Leber遗传性视 神经病，线粒体肌病，心肌线粒 体病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒 及中风样发作综合症，帕金森病 cytochrome c oxidase(complex IV)MT- COX1 肌红蛋白尿运动神经元疾病，铁 粒幼细胞贫血 MT- COX2 线粒体肌病，线粒体多系统疾 病，线粒体脑肌病 MT- COX3 Leigh综合征，慢性游走性红斑， 骨骼肌溶解症 ATP synthase MT- ATP6 共济失调并发色素性视网膜炎， 母系遗传Leigh综合征，家族性双 侧纹状体坏死 MT- ATP8 共济失调并发色素性视网膜炎， 母系遗传Leigh综合征，家族性双 侧纹状体坏死 （2）22个编码tRNA的基因 Alanine MT-TA进行性眼外肌麻痹Arginine MT-TR
植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
第一节 线粒体DNA的结构和功能特征 一、mtDNA的结构特征 mtDNA是惟一存在于人类细胞质中的DNA分子，独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码功能。人mtDNA由16 569bp组成，双链闭合环状，其中外环DNA单链由于含G较多，C较少，使整个外环DNA分子量较大，称为重链（heavy chain）或H链；而内环DNA单链则C含量高，G含量低，故分子量小，称为轻链（light chain）或L链。mtDNA的两条链都有编码功能，除与复制及转录有关的一小段D环区（displacement loop）无编码基因外，基因间无内含子序列；部分基因有重叠现象，即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段碱基相重叠(图6-1)。因此，mtDNA的任何突变都会累及到基因组中的一个重要功能区域。mtDNA含有37个基因，其中两个rRNA基因 （16SrRNA,12SrRNA），22个tRNA基因，13个蛋白质基因（包括1个细胞色素b基因，2个ATP酶亚单位的基因。 图6-1 人线粒体基因图谱 Figure 6-1 Map of the human mitochondrial genome Box 6.1 The limited autonomy of the mitochondrial genome Encoded by Encoded by Mitochondrial nuclear
genome genome Components of oxidative phosphorylation system Ⅰ NADH dehydrogenase Ⅱ Succinate CoQ reductase Ⅲ Cytochrome b-c1 complex Ⅳ Cytochrome c oxidase complex Ⅴ ATP synthase complex Components of protein synthesis apparatus tRNA components rRNA components Ribosomal proteins Other mitochondrial proteins 13 subunits 7 subunits 0 subunits 1 subunits 3 subunits 2 subunits 24 22 tRNAs 2 rRNAs None None >80 subunits >41 subunits 4subunits 10 subunits 10 subunits 14 subunits ~80 None None ~80 All, e.g. mitochondrial enzymes and proteins 和7个呼吸链脱氢酶亚单位的基因）。位于D环区的HSP（heavy strand promoter）和LSP(light strand promoter)是线粒体基因组转录的两个主要启动子（图6-1）。 mtDNA是裸露的，不与组蛋白结合，存在于线粒体基质内或黏附于线粒体内膜。在一个线粒体内往往有一至数个mtDNA（图6－2）。mtDNA的自我复制也是以半保留复制方式进行。复制先从重链开始，形成一个约680个碱基的7sDNA，称D环。在对鼠细胞研究中发现，大多数的mtDNA均为D环的结构，只有一小部分mtDNA从D环开始合成完整的新生链。轻链的复制要晚于重链，等重链合成过OL之后才开始合成。研究发现mtDNA 的复制可以越过静止期或间期，甚至可以分布在细胞整个周期。mtDNA 的自我转录很似原核生物，即产生一个多顺反子，其中包括多个mRNA和散布于其中的tRNA，剪切位置往往发生在tRNA处，从而使不同的mRNA和tRNA被分离和释放。
《基因组学与蛋白质组学》课程教学大纲 学时： 40 学分：2.5 理论学时： 40 实验学时：0 面向专业：生物科学、生物技 术课程代码：B7700005先开课程：生物化学、分子生物 学课程性质：必修/选修执笔人：朱新 产审定人： 第一部分：理论教学部分 一、课程的性质、目的和任务 《基因组学与蛋白质组学》是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，是融合了生物信息学、计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。是当今生命科学研究的热点与前沿领域。由于基因组学与蛋白质组学学科的边缘性，所以本课程在介绍基因组学与蛋白质组学基本基本技术和原理的同时，兼顾学科发展动向，讲授基因组与蛋白组学中的热点和最新进展，旨在使学生了解现代基因组学与蛋白质组学理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、课程的目的与教学要求 通过本课程的学习，使学生掌握基因组学与蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在基因组学与蛋白质组学上的应用及典型研究实例，熟悉从事基因组学与蛋白质组学的重要方法和途
径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，并通过学习提高自学能力、独立思考能力以及科研实践能力，为将来从事蛋白质的研究奠定坚实的理论和实践基础。 三、教学内容与课时分配 第一篇基因组学
第一章绪论（1学时） 第一节基因组学的研究对象与任务； 第二节基因组学发展的历程； 第三节基因组学的分子基础； 第四节基因组学的应用前景。 本章重点： 1. 基因组学的概念及主要任务； 2. 基因组学的研究对象。 本章难点： 1.基因组学的应用及发展趋势； 2.基因组学与生物的遗传改良、人类健康及生物进化。建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题： 查阅有关资料，了解基因组学的应用发展。 第二章人类基因组计划（1学时） 第一节人类基因组计划的诞生； 第二节人类基因组研究的竞赛； 第三节人类基因组测序存在的缺口； 第四节人类基因组中的非编码成分； 第五节人类基因组的概观； 第六节人类基因组多样性计划。 本章重点： 1. 人类基因组的研究； 2. 人类基因组多样性。 本章难点： 人类基因组序列的诠释。 建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题：
线粒体DNA疾病和生殖技术发展的意义 张文敬2015602591 杨永妍2015602337 丁艺洁2015602756 杨陈祎2015602340 引言线粒体DNA疾病 线粒体是真核细胞内重要的产能细胞器。线粒体疾病是一种病理状态，在这种状态下，线粒体的产能能力受损，并且不能完成其正常功能。这类疾病是相对比较常见的，但是却很少有这样的诊断，因为大多数患者仅表现出非常轻微的症状（曼瓦林等，2007）。和线粒体疾病相关的症状严重性的不同范围使得其被报道的流行率变异性很大：例如，有一种线粒体的病理学改变（下文所讨论的线粒体基因3243A→G的突变）的流行率是1到300之间（曼瓦林等，2007），也有一种观点认为是1到14000之间（钦纳里等，2000）。 线粒体内自身存在DNA（后文称mtDNA），是人体内唯一存在于细胞核外的DNA。线粒体DNA比较特殊的是它有自己的基因序列和核糖体亚型。它编码产生呼吸链中所需要的少数亚单位，而呼吸链是由多个多聚体蛋白依次排列于线粒体膜上形成的一个产能链，此外它还编码产生转运体RNA和核糖体RNA。呼吸链中大部分的必需蛋白质是由细胞核所编码产生的，很多蛋白质同样也需要线粒体DNA来维持和复制。因此无论是线粒体DNA还是细胞核内DNA，其突变就有可能导致线粒体功能的病理性缺失，导致线粒体疾病（泰勒和特恩布尔，2005；格里弗斯等，2012）在这篇综述中，我们将重点讨论由线粒体DNA突变所引起的疾病。线粒体DNA是母系遗传的，原因很明显，在形成受精卵时，精子不携带细胞质成分，来自父亲的线粒体在卵子受精后即泛素化（Sutovsky等，1999,2000）并被靶向破坏（康明斯等，1998；史特拉等，2000；艾拉维等2011；Sato and Sato,2011;德卢卡和奥法雷尔，2012），仅在异常的胚胎中或种间交配的情况下尚存在（乔伦思丹等，1991；圣约翰等，2000）。线粒体DNA 甚至有可能在受精之前就已经被消除了（卢奥等，2013)。 线粒体DNA突变引起的疾病在发病、严重程度和遗传性方面有其独特的特点，很大一方面原因就是在典型的有核细胞中，其线粒体DNA有数以千计的复制体，（Lightowlers等，1997；华莱士，1999）。从遗传学上来讲，多数正常细胞内的线粒体DNA实际上是相同的（这在医学上称为“同型异源性”）。在线粒体DNA疾病中可能存在大量不同的、突变的DNA分子，从而产生了“异质性”（在同一个线粒体中同时存在多种类型的线粒体DNA）。 线粒体DNA是母系遗传的，使得其成为只在母系中遗传为特点的疾病。线粒体DNA单倍体能够调节由细胞核编码的基因突变造成的病理影响（施特奥斯等，2013），这种线粒体DNA的变异性也依据其背景及环境产生利弊不同的影响（治等，2012）。很多线粒体疾病具有异质性，即变异的和原株线粒体DNA共存于受损细胞内。大多数实例中观察到突变量的影响（杰普森等，2006）：线粒体DNA突变体的比例，复制量及其分布影响组织的功能（Petruzzella等，1994）。在最常见的疾病当中，当线粒体DNA突变达70%，线粒体DNA疾病开始出现临床症状（杰普森等，2006）。这种取决于突变量
1、前言（Introduction） 英国《自然》杂志网络版2006年5月18日报道，科学家已对含有2.23亿个碱基对，占人类基因组中碱基对总量的8%左右的人类第一号染色体完成测序，宣告持续16年的人类基因组计划全部完成。作为人类自然科学史上重要的里程碑，“人类基因组”的研究已从“结构基因组”阶段进入“功能基因组”阶段。在人类基因组计划后相继推出的水稻基因组计划、马铃薯基因组计划、草鱼基因组计划等，和快速增长的微生物基因测序，“海量”的基因信息的积累，催生了“功能基因组”时代的来临。针对充分利用“海量”基因组信息的生物信息学不仅应运而生，而且为以注释、阐明基因功和利用基因生物学功能的“后基因组时代”的研究发挥了重大作用。 生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头,在获得了蛋白质编码区的信息后,进行蛋白质空间结构的预测和模拟,然后依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。就是说,生物信息学的主要任务是组织和分析生物学数据,而生物学数据的分析离不开计算机算法的运用。因此,可以说生物信息学是一门集生命科学、计算机科学、数学、物理学为一身的多学科交叉的前沿学科。 动物mtDNA属母系遗传，是共价闭合的双链DNA分子，核酸序列和组成比较保守，基因的排列顺序比较稳定而且紧密，无重组和单拷贝。由于其结构和进化上的特点，mtDNA已成为研究动物起源进化以及群体遗传分化的理想对象。昆虫mtDNA大小约为15．4~16．3kb，其基因组大小的变化受A+T-rich区长度变化的影响十分显著。A+T-rich 区(A+T丰富区)的长度最短为399 bp，最长达4601 bp，两者相差4202bp，前者见于Tricholepidion gertschi，后者见于黑尾果蝇Drosophila melanogaster。昆虫线粒体基因组由2个rRNA基因(1rRNA和srRNA)、22个tRNA基因、13个蛋白编码基因[Cytb基因(细胞色素b基因，cytochrome oxidase b)，ATPase6和ATPase8(ATP酶亚基基因6和8，ATP synthase subunits 6 and 8)，COⅠ、COⅡ和COⅢ(细胞色素氧化酶亚基基因Ⅰ-Ⅲ，cytochrome oxidasesubunit Ⅰ-Ⅲ)，NDl-6和ND4L(NADH降解酶基因1~6和4L，NADH dehydrogenase subunit 1-6 and 4L)]，共37个基因和1个包含复制启动子的非编码区(A+T-rich区)组成。Aloni 和Attardi将mtDNA两条链中密度较小者命名为轻链(L链)，另一条命名为重链(H链)。考虑到昆虫mtDNA没有明显的L链与H链之分，Simon等根据昆虫mtDNA中多数基因都是从一条链上转录的特点，将这一条链定义为J链，另一条链定义为N链[1-3]。 自Wolstenholme和Clary第一个报道了果蝇Drosophila yakuba mtDNA全序列以来，GenBank已收录了80余种昆虫mtDNA全序列，其中双翅目昆虫有15个种。在双翅目实蝇科昆虫中，地中海实蝇Ceratis capitata和油橄榄果实蝇Bactrocera oleae的线粒体基因组全序列已有报道[4]。 梨小食心虫，学名Grapholitha molesta (Busck)，简称“梨小”，别名有梨小蛀果蛾、东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫。属于鳞翅目(Lepidoptera)，
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
竭诚为您提供优质文档/双击可除 线粒体dna鉴定 篇一：线粒体DnA的结构特征及在鹿科动物物种鉴定中的应用 线粒体DnA的结构特征及在鹿科动物物种鉴定中的应用摘要最新研究表明，作为生物能量的生成场所线粒体是一种具有自我遗传控制功能，本文重点针对鹿科动物的线粒体DnA结构特征进行了研究和分析，通过具体的实验验证了鹿科动物物种鉴定中线粒体DnA的实际功能和应用。同时，还对线粒体DnA的提取方法进行了探索，最后就线粒体DnA 的序列以及动物物种进行了鉴定，就鹿科动物线粒体DnA的研究成果提出了意见。 关键词染色体；线粒体DnA；鹿科动物；物种鉴定 0引言 线粒体是1898年被命名的，其实线粒体的发现却要追踪到1850年。线粒体外膜比较平滑，具有两层的膜包被，向内的折叠内膜形成嵴，两层膜中间有一个腔，基质居于线粒体的中央。基质内部有可以喝三羧酸进行循环时所需要的
所有酶类，内膜上有ATp酶复合体和呼吸链酶系。线粒体其实就是细胞内形成ATp和氧化磷酸化的关键场所，因此，被形象地成为细胞的动力加工厂。 1线粒体DnA结构特征 真核生物所呼吸所用的细胞器就是线粒体，不同物种的细胞之间，其线粒体的数目有着很大的差距，通常情况下都在100个~3000个之间，植物细胞中一般都会含有50个~100个左右的线粒体，而动物的细胞中其线粒体的数目差异性要远远高于植物体内的线粒体数目，多的要达到1000个，少的却只有50个左右。实验表明，植物细胞中的所有线粒体都会参与植物本身的一系列新陈代谢的全过程。植物体内的所有的线粒体通过自身的功能可以把细胞所吸收和合成的糖类、脂肪等所有的储藏能量经过进一步地氧化而生成了co2和h2o，最后通过特定的方式将其释放出去，同时它还能将所存储的一些太阳能经过一系列的转换生成了细胞用以维持自身的生理功能的具体能量-ATp分子。正是由于植物细胞中的线粒体少于动物体内的线粒体，从而制约了能量的来源，因此植物就不可能出现和动物一样的自由活动和快速增长。由于线粒体DnA（mtDnA）相对比较小，所以它仅能决定本身最基本的一些特征，缺少多余的编码结构，因此就难以产生有效的修复功能。实验表明，只要线粒体DnA受到了不同程度的损伤，哪怕只是一个极其微小的变化，都会直接
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
一、名词： Gene 遗传学概念：基因是世代相传的，基因决定了遗传性状的表达，基因的颗粒性主要表现在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性，基因呈直线排列在染色体上。 分子生物学概念：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 genome 细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 Protein 生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 Proteome (1)由一个基因组所表达的全部相应的蛋白质。(2)在一定条件下，存在于一个体系（包括细胞、亚细胞器、体液等）中的所有蛋白质。 exon 外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质 古细菌 定义1：常生活于热泉水、缺氧湖底、盐水湖等极端环境中的原核生物。具有一些独特的生化性质，如膜脂由醚键而不是酯键连接。在能量产生与新陈代谢方面与真细菌有许多相同之处，而复制、转录和翻译则更接近真核生物。古核生物与真核生物可能共有一个由真细菌的祖先歧化而来的共同祖先。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）定义2：现今最古老的生物群，为地球原始大气缺氧时代生存下来的活化石。为单细胞生物，无真正的核，染色体含有组蛋白，RNA聚合酶组成比细菌的复杂，翻译时以甲硫氨酸为蛋白质合成的起始氨基酸，细胞壁中无肽聚糖，不同于真细菌，核糖体蛋白与真核细胞的类似。许多种类生活在极端严酷的环境中。与真核生物、原核生物并列构成现今生物三大进化谱系。 多聚酶链式反应（PCR） 多聚酶链式反应（PCR）：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个含有20个碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5…端到3?端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。 基因芯片（DNA微阵列）
11个石蛃样本的线粒体基因组研究 石炳目在昆虫纲的系统发生关系分析中处于基部,是最早分支出来的原始类群,是一种不被人们熟知的无翅类昆虫。目前,关于石蛃目的系统发生地位及单系性已经得到普遍证实,但是关于石蛃目昆虫内部各科、各亚科、各属之间的系统 发生关系及系统地理研究一直存在着争议,有待更多的分子数据对其进行深入的研究。 因此本研究是在本实验室原有研究的基础上通过增加石蛃目昆虫样本数量,对其内部系统发生关系进行更深入地研究并对中国石蛃目昆虫的扩散机制进行 初步探讨。本研究包括石蛃目昆虫中的2亚科4属的11个样本,分别是:石蛃亚科(Machilinae)中的辽宁弓长岭的高丽韩蛃Coreamachiliscoreanus、山西衡山的高丽韩蛃 Coreamachiliscoreanu、新疆喀纳斯异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)kanasiensis、新疆新源异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)xinyuanensis、新疆玛纳斯希蛃Silvestrichilis manasiensis;新蛃亚科(Petrobiinae)中的河北承德的希氏跳蛃Pedetontus silvstri、辽宁凤城的希氏跳蛃Pedetontussilvestri、太姥山跳蛃Pedetontustaimushanensis、霸王岭跳蛃Pedetontusbawanglingensis、大陈岛跳蛃Pedetontus dachendaoensis、重庆跳蛃Pedetontus chongqingensis。 11个石蛃样本的线粒体基因组信息全部成功获得,其基因组的长度分别是:高丽韩蛃(弓长岭)Coreamachilis coreanus 15579 bp、高丽韩蛃(衡 山)Coreamachilis coreanus 15574 bp、喀纳斯异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)kanasiensis 15628 bp、新源异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)xinyuanensis 15518 bp、玛纳斯希蛃
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
第一节线粒体DNA的结构和功能特征一、mtDNA的结构特征 mtDNA是惟一存在于人类细胞质中的DNA分子，独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码功能。人mtDNA由16 569bp组成，双链闭合环状，其中外环DNA单链由于含G较多，C较少，使整个外环DNA分子量较大，称为重链（heavy chain）或H链；而内环DNA单链则C 含量高，G含量低，故分子量小，称为轻链（light chain）或L链。mtDNA的两条链都有编码功能，除与复制及转录有关的一小段D环区（displacement loop）无编码基因外，基因间无内含子序列；部分基因有重叠现象，即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段碱基相重叠(图6-1)。因此，mtDNA的任何突变都会累及到基因组中的一个重要功能区域。mtDNA含有37个基因，其中两个rRNA基因（16SrRNA,12SrRNA），22个tRNA基因，13个蛋白质基因（包括1个细胞色素b基因，2个ATP酶亚单位的基因。 图6-1 人线粒体基因图谱 Figure 6-1 Map of the human mitochondrial genome Box 6.1 The limited autonomy of the mitochondrial genome Encoded byEncoded by nuclearMitochondrial genomegenome13 subunits Components of oxidative phosphorylation system >80 subunits7 subunits>41 subunitsNADH dehydrogenase Ⅰ．4subunits0 subunitsⅡSuccinate CoQ reductase 10 subunits1 subunitsCytochrome b-c1 complex Ⅲ 10 subunits3 subunitsⅣCytochrome c oxidase complex 14 subunits2 subunitsA TP synthase complex Ⅴ ~8024 Components of protein synthesis apparatus None22 tRNAs tRNA components None2 rRNAs rRNA components ~80Ribosomal proteins None All, e.g. mitochondrial Other mitochondrial proteins None and proteins enzymes
植物基因克隆技术及其发展方向 摘要：基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。 关键词：植物基因克隆基因植物基因转化 正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中。 一、常用的目的基因克隆技术 1、1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI 基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA 对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。