临床分子生物学 1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。 （1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。 荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。 （2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA提取 4、逆转录逆转录成cDNA 5、常规PCR扩增 （1）反应体系 （2）混匀，瞬时离心。 （3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。 （5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、 实时荧光定量PCR扩增目的基因 用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。 反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。 将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析
实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1μl pMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等 四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。 表二：cDNA吸光度测定 2组3组
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定） 【实验目的】 1.掌握质粒提取的基本方法的原理； 2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 【实验原理】 重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。 1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法） 使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。 2．快速裂解菌落鉴定质粒大小 从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。 3．限制酶图谱鉴定 对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。 4．Southern 印迹杂交 为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。 5．PCR法 用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。 6．菌落（或噬菌斑）原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。 本实验采用限制酶图谱鉴定。
β—肌动蛋白的克隆与验证 李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤 摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2] 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。 关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR 1材料与方法 1.1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。 器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以
Bop基因克隆 摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。 关键词：基因克隆；PCR；BOP基因 第一章 1.前言 1.1 基因工程 狭义上仅指基因工程。 是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。 重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。 广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。 是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；
下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。 广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。 广义的基因工程是一个高度的统一体： 上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想； 下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。 从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。 基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[1] 1.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将
动物遗传学读书报告 之 新基因的分离克隆及功能鉴定 学院班级：动物科技学院动物科学10级2班 新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展 前言 随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆 基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法 基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将
这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆 通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术 随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库
实验三PCR法筛选重组克隆 【实验目的】 1.学习和了解常用重组克隆筛选方法的原理； 2.掌握PCR法快速筛选重组克隆的操作方法。 【实验原理】 重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以 －半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交（见实验十一）等方法。 1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法） 使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。lacZ编码 －半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的 肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。重组子由于外源片断的插入使 肽基因失活不能形成 互补作用，也就是说，宿主细胞表现为 －半乳糖苷酶失活。因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。 2．快速裂解菌落鉴定质粒大小 从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。 3．限制酶图谱鉴定 对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。 4．Southern 印迹杂交 为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。 5．PCR法 用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA 序列分析。因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。 6．菌落（或噬菌斑）原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第一节转化 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。 一、重组DNA分子转入原核生物细胞 1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。 （1）CaCl2处理后的细菌转化或转染 A、制备感受态细胞 受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。 所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。 转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程； 转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程； 好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。 B、细胞转化（或转染）的具体操作过程： ①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞； ②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。 ③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收； ④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因； ⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。 ⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。 （2）电穿孔转化法 基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。 （3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌 原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。 尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。
八、重组克隆的筛选方法 重组克隆的筛选方法：1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选；4、PCR筛选； 5、测序验证； 6、表达筛选； 7、生物活性筛选 1、抗性筛选—质粒载体携带的筛选标记（Amp R氨苄青霉素抗性；Tet R四环素抗性；Kan R 卡那霉素抗性） 特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入 2、蓝白斑筛选--β-半乳糖苷酶(lacZ)的显色反应 α-互补：lacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的lacZ可分解培养基平板中的底物X-Gal，生成蓝色物质。（需要IPTG的诱导表达） 外源基因插入载体后，使载体部分lacZ失活，无法进行α-互补—白斑。 特点：未载入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；无法确定基因插入的方向；特殊—基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分lacZ失活，将产生α-互补，产生蓝斑 蓝白斑筛选的原理分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lac Z）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lac Z基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 3、酶切电泳筛选 选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片段的大小 特点：可鉴定外源基因的重组和插入方向；结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变 4、PCR筛选 通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒 特点：可用2μl菌液做模板，快速，方便，可批量检测；不能检测基因插入方向；不能检测基因内部突变 5、测序验证 选取阳性克隆，送公司测序 特点：最可靠的检测方法，可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等；价格贵，适于1~2个克隆的验证 ①一次测序反应一般准确测定500bp左右（也有测准800bp，价格贵）②测定的序列靠
目的基因的克隆、转化及重组子筛选 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。 (6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1μl pMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。 四．实验步骤、现象、结果及分析： (1)cDNA电泳及胶回收 1. 提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。
植物细胞色素P450基因的克隆策略及鉴定方法 张松焕1 ,李明泽2 ,张军3 ,李春奇 1* (1.河南农业大学生命科学学院,河南郑州450002;2.濮阳职业技术学院,河南濮阳457000;3.河南农业大学林学院,河南郑州450002) 摘要 细胞色素P450是动植物及微生物体内一类重要的具有混合功能的血红素氧化还原酶,它参与多种生化反应,植物P450参与许多植物体次生代谢物质的合成和外源物质代谢解毒,在防御生物免受病虫害及逆境胁迫等方面具有重要作用。综述了植物细胞色素P450基因的克隆策略及鉴定方法,并对其未来研究作了展望。关键词 细胞色素P450;克隆策略;鉴定方法 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)11-04911-04 C l oning Strategi es and Identificati on M ethods of P l ant Cytoch ro me P 450Gene ZHAN G Song huan et al (Coll ege of L ife Sciences ,H enan A griculturalU ni versity ,Zhengzhou ,H enan 450002)Abstract Cytochro m e P450s are a di verse array ofmultif unctional heme ox i doreduct ase in anm i als ,plants and m i crobe .They partici pates i n l ots of bi oche m ica l reacti ons .P l ant cy t ochro me P450s i nvolve i n t he synthesi s o fmany secondary m etabo lites and detoxifi cati on m etabo lis m o f exogenous tox i ns .They play an m i portant role i n preventi ng plants from pat hogen and insect att acks and adversi ty stress .The cloni ng strateg ies and i dentifica ti on methods of pl ant cytochro m e P450sw ere s u mm ariz ed .And the fut ure researches were pred i cted .K ey words Cytochro m e P450;C l oni ng stra t egy ;Identifi cation m et hods 作者简介 张松焕(1980-),女,河南洛阳人,硕士研究生,研究方向: 植物分子生物学。*通讯作者,E m ai:l licq66@https://www.doczj.com/doc/0712373337.html, 。 收稿日期 2009 01 21 细胞色素P450(c ytochr o m e P450,简称P450)广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等细胞内[1] ,是与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合的一类以血红素为辅基的B 族细胞色素超家族蛋白酶。由于还原态P450与一氧化碳结合后在450nm 处有一吸收峰,因此命名为P450。最早于1958年在大鼠肝微粒体中发现。1969年,Frear 等首次发现在植物中也存在P450。已有的研究表明,细胞色素P450是高等植物中最大的酶蛋白家族,不仅参与植物体的基础代谢,还参与了植物的次生代谢,主要表现在次生代谢物质如黄酮类、香豆素、异黄酮类氰甙、生物碱、萜类等的合成以及降解外源化学药物毒性2个方面 [2-3] 。P450催化的代谢途径可 产生一些重要的次生代谢产物,使植物抵抗病虫害及逆境胁 迫,而参与物质代谢的P450将杀草剂、杀虫剂及其他毒害化学物质转化为非毒害化合物。目前,关于植物细胞色素P450的研究主要集中在基因片段的克隆、全基因的获得等方面,而关于P450功能及其鉴定方法的文献综述相对较少,因此,笔者就植物细胞色素P450的克隆策略和鉴定方法作一综述,以期对相关的研究有所帮助。1 P450基因的克隆策略 自1958年首次发现细胞色素P450基因以来,每年发表的有关P450的文章超过2000篇。迄今为止,利用缺失功能突变体法、差异筛选法、抗体或探针筛选c D NA 文库、同源序列法等方法已成功地分离了上万个P450基因(http ://www.ncb.i n l m .n i h .gov/G e nba nk /),部分P450基因功能已得到鉴定 [4] 。植物细胞色素P450基因c DNA 和片段的克隆策略大 致如下: 1.1 mRNA 差异显示技术 mRNA 差异显示技术(mRNA d iffere n ti al disp l ay PCR ,DD PCR )具有简单、快速、灵敏、重现性好、多用途和可适用于微量起始RNA 等优点。2004年,余小林等利用mRNA 差异显示技术结合c DNA 末端快速扩增 (RACE )技术成功分离并克隆到1个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450c D NA 全长CY P86MF [4] 。经过Gen Ba nk BL AST 查询,CY P86MF 与位于拟南芥第1条染色体上的编码细胞色素P450基因CY P86C4的核苷酸序列有85 3%同源性,氨基酸同源率为84.9%。M arten S 等从大丁草(G erbera hybri d s )中通过差异显示获得了一个P450基因全长c DNA CY P93B2,由酵母表达的CY P93B2可以催化黄烷酮产生黄酮,序列比较显示,该基因与黄酮合成酶 FNS 的序列同源性为54% [5] 。 1.2 功能突变体法 郑文光等利用以Col 0为背景的拟南 芥E M S 诱变的M 2群体,培养得到突变体ber 15,从而分离克隆到一个细胞色素P450单加氧酶C Y P85A2,该酶是油菜素内酯(BR )生物合成途径中的一个重要的酶[6] 。Zhou 等利用图位克隆(m ap base d clo n i ng)从拟南芥突变体pad3中,获得催化合成植保素ca m alexi n 的PA D3基因,该基因与玉米中催化源于吲哚次生代谢物2,4 di hydro xy 1,4 be nzoxazi n 3 one 合成的酶类似,且与P450单加氧酶的同源性很高,D .N elson 将其命名为CY P71B15,它能使拟南芥抗黑斑病菌(Alternaria br assicicola ),但不影响植株对丁香假单胞菌(P seudo m o nas s y ringae )的抗性[7] 。1.3 纯化P450蛋白,制备抗体以筛选c DNA 表达文库 从植物中分离和纯化具有特定目的的P450蛋白,再以此为抗原制备抗体,用于筛选同种植物的c DNA 表达文库,从中分离和调出目的P450基因c DNA 。由于蛋白质的分离纯化较困难,抗体制备也相当费时,所以利用该方法对植物P450的克隆没有广泛使用,目前,仅C Y P74B1通过该方法获得 [8] 。 1.4 用已知的植物P450基因作为探针筛选c DNA 文库或基因组文库 由于克隆出来的P450基因逐渐增多,所以利用该方法使得P450基因的克隆速度大大加快。探针可以从不同种植物已克隆出来的P450基因中进行选择,然而,探针有时与筛选的基因并不属于同一家族[9] 。Um e m oto 等以茄子CY P75A2基因的部分片段为探针,从其基因组文库中筛选出3个CY P71家族成员,即CY P71A2、CY P71A3和CY P71A4 [10] 。 安徽农业科学,Jou r n al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2009,37(11):4911-4914责任编辑 金琼琼 责任校对 张士敏
第39卷 第3期 2003年9月 青岛大学医学院学报 ACT A ACADE MIAE ME DICINAE QING DAO UNIVERSIT ATIS V ol.39,N o.3September 2003 [收稿日期]2003203216; [修订日期]2003204220 [作者简介]毛伟征(19622),男,博士,副主任医师,硕士生导师。 PCR 法快速筛选重组克隆方法的改进 毛伟征1,孙道升2,司春祥2,隋爱华3,刘湘萍3,陈 栋1,吕振华3 (1 青岛大学医学院附属医院普外科,山东青岛 266003; 2 青岛海慈医院检验科; 3 青岛大学医学院附属医院分子生物 学中心实验室) [摘要] ①目的 以PCR 法在菌液中快速筛选重组克隆。②方法 提取小鼠巨噬细胞总RNA ,反转录PCR (RT 2PCR )获得肿瘤坏死因子2α(T NF 2α)基因片段,T A 克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌JM109。在大肠杆菌培养中 的不同时间取样测定大肠杆菌A 600值及计数。以不同数量的大肠杆菌为模板进行系列PCR 扩增,获得适宜PCR 扩增条件的大肠杆菌数。③结果 以菌液为模板进行PCR 能够快速筛选重组体,大肠杆菌模板数在125～250个范围内,PCR 对阳性克隆的扩增可获得良好结果;获得常规培养条件下转化大肠杆菌的生长曲线,A 600值与大肠杆菌计数间存在显著正相关(r =0.93,P <0.001)。④结论 通过测定大肠杆菌培养液A 600值推算大肠杆菌数量,以适宜的大肠杆菌模板行PCR 法筛选重组克隆,快速准确并方便下游操作。 [关键词] 重组体筛选;聚合酶链反应;克隆,分子;大肠杆菌 [中图分类号] Q784 [文献标识码] A [文章编号] 167224488(2003)0320228203 A MODIFICATION OF RAPI D PCR SCREENING FOR RECOMBINANT C LONE MAO Wei 2zheng ,SUN Dao 2sheng ,SI Chun 2xiang ,et al (Department of G eneral Surgery ,The A ffiliated H ospital of Qingdao University M edical C ollege ,Qingdao 266003,China ) [ABSTRACT] Objective T o establish a rapid screening of recombinant clones by PCR. Methods T otal RNA of m ouse microphages was extracted.T NF 2genes were acquired by RT 2PCR.JM109,E.coli trans formed by recombinant plasmid was inoculated.At a series of time spots ,diluted 1L of medium was plated onto LB agar plate.M eanwhile ,A 600of media was detected with spectrophotometer.C olonies on agar were counted.M edia with different am ount of E.coli were used as a tem plate ,a series of PCR carried out. Results PCR screening showed that an optimized result could be obtained with tem plates of media with E.coli am ount ranged from 125-250.The growth curve of trans formed E.coli was set up.There was a significant linear relationship between colonies and A 600from 4.5to 7.0hours after inoculation. Conclusion The am ount of E.coli can be calculated through detecting A 600of the media.It is a fast and efficient way to screen recombinant clones with PCR ,which takes a proper am ount of E.coli as its tem plate. [KE Y WOR DS] screening ,recombinants ;polymerase chain reaction ;cloning ,m olecular ;Escherichia coli 外源基因经反转录PCR (RT 2PCR )获得理想的PCR 产物后,用定向克隆2T A 克隆等方法插入载体的多克隆位点,转化大肠杆菌感受态细胞,提取重组质粒后进行限制性酶切分析和DNA 测序等重组体分析。该工作颇为繁琐,费时、费力。我们在制备荧光定量PCR 阳性模板测定小鼠巨噬细胞肿瘤坏死 因子2 α(T NF 2α)mRNA 的实验中[1],以重组体转化的大肠杆菌为模板进行了PCR 扩增,通过对实验中各个参数的测定和分析,获得了对重组体筛选的快速、简便、准确方法,现介绍如下。1 材料与方法1.1 主要试剂 TRI zol 试剂:G ibco BR L ,Life T echnologies 公司; 反转录试剂盒:Promaga 公司;T aq DNA 聚合酶:华美 生物工程公司;Rsa Ⅰ限制性内切酶:Promaga 公司;PCR 纯化试剂盒:R oche 公司;质粒:p GE M 2TE ASY VECT OR SY STE M Ⅱ,Promaga 公司;大肠杆菌:E.coli JM109,大连宝生物公司。1.2 引物 根据G enBank 中小鼠T NF 2α(NM -013693)序列资料自行设计引物,上、下游引物分别为:5′2C AC AA 2G ATGG TGGG AC AG TG AC 23′和5′2G AC A 2G AGGG AAG CTG ACC ACTC 23′。扩增片段长度149bp 。1.3 目的基因 小鼠T NF 2 α基因片段,从小鼠巨噬细胞提取总RNA ,反转录为cDNA ,然后经PCR 扩增、回收纯化获得。