基因工程的基本内容
基因工程的基本内容一. 本周教学内容：基因工程的基本内容二. 学习内容：本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。了解基因工程对现代社会的贡献及基因工程应用的发展。
三. 学习重点： 1. 基因工程的概念 2. 基因工程的操作工具 3. 运载体的基本条件 4. 基因工程的基本操作步骤 5. 基因工程的应用
和发展
四. 学习难点： 1. 基因工程工具：限制酶、运载体 2. 运载体的基本要求 3. 基因工程的操作步骤 4. 如何检测基因操作 5. 基因工
程应用的两面性
五. 学习过程：（一）概念：基因工程――又叫基因拼接技术或DNA 重组技术。是指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。概念要点： 1. 在DNA分子水平上进行设计操作的 2. 在生物体外实现的基因改造 3. 对受体细胞进行无性繁殖 4. 重组基
因最终表达获得性状
（二）基因操作的工具 1. 抗虫棉的培育：将抗虫的基因从某种生物（如苏云金芽孢杆菌）中提取出来，“插入”到棉花的细胞中，与棉细胞中的DNA结合起来，在棉中发挥作用。 2. 技术要点首先：从苏云金芽孢杆菌的一个DNA分子上辨别出所需要的基因，并且把它切割下来其次：将切割下来的抗虫基因与棉的DNA“缝合”起来 A. 基因的剪刀――限制性内切酶全称： DNA限制性内切酶（以下简称限制酶）。来源：主要来自于微生物中（目前已经发现了200多种限制酶）特点：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子例如：从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A间切开。补充知识： 1. 限制性内切酶可以水解侵入细菌的外源性DNA分子，保护细菌自身 2. 每种限制
性内切酶能识别DNA中4―6个核苷酸的特殊序列 3. 细菌自身相同序列被修饰（甲基化）而不被水解 4. 限制酶能产生交错切口，形成粘性末端 B. 基因的针线――DNA连接酶黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。 DNA连接酶：两种来源不同的DNA 用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端通过互补的碱基黏合起来，DNA连接酶在断口处把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来――形成共价键 C. 基因的运输工具――运载体作用：要将一个外源基因，送入受体细胞。条件：① 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存进行复制、表达② 具有多个限制酶切点以便与外源基因连接③ 具有某些标记基因便于进行筛选常用运载体：质粒、噬菌体和动植物病毒等。质粒：是基因工程最常用的运载体，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。特点：① 含有抗性基因：大肠杆菌质粒中常含抗药基因，如：抗四环素的标记基因② 基因组很小：细菌质粒的大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一
③ 质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。④ 质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。来源：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。（土壤农杆菌很容易感染植物细胞，使细胞生有瘤状物。培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做运载体。）六. 基因操作的基本步骤（一）取目的基因目的基因:是人们所需要的特定基因苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因种子的贮藏蛋白的基因人的胰岛素基因、干扰素基因等主要途径：① 从供体细胞的DNA中直接分离基因② 人工合成基因。 1. 直接分离基因:最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。具体操作：供体细胞中的DNA 切成许多片段重组DNA 受体细胞（大量复制）基因扩增分离含有目的基因的细胞把带有目的基因的DNA片段分离出来优点：操作简便缺点：① 工作量大，具有一定的盲目性② 真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达主要应用：如许多抗虫、抗病毒的基因
都可以用上述方法获得。 2. 人工合成基因：（1）逆转录法以目
的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。目的基因mRNA 单链DNA 双链DNA（目的基因序列）（2）化学合成法根据已知的
蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因蛋白质氨基酸序列 mRNA序列 DNA
序列目的基因优点：目的性强，比较容易获得真核基因序列缺点：操作技术性强，不容易获取，基因表达不容易控制主要应用：如人
的血红蛋白基因、胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。重要发展：DNA序列自动测序仪对提取出来的基因进行核苷酸序列分析，扩增DNA技术（也叫PCR技术），使目的基因在短时间内成百万
倍地扩增。 A. 目的基因与运载体结合 B. 将目的基因导入受体细胞常用受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。主要手段：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。质粒细菌目的基因扩增感受态细胞：能够接受外源DNA的细胞将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒易进入受体细胞。 C. 目的基因的检测和表达 1. 转基因结果：① 在全部受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞很少② 重组DNA转移成功的受体细胞不一定能够表达③ 必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。 2. 检测的方法（1）抗性监测：（2）性状检测：受体细胞是否表现出特定的性状，才能
说明目的基因完成了表达过程。基因工程的成果与发展前景一. 基因工程与医药卫生 A. 生产基因工程药品传统药品生产：直接从生
物体的组织、细胞或血液中提取的原料有限，产品价格昂贵。如：
猪胰岛素，紫草素工程菌生产：通过发酵工程生产高效率、高质量、低成本的药品。如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等胰岛素：是治疗糖
尿病的特效药。
胰岛素生产传统方法基因工程来源猪、牛胰腺提取大肠杆菌工
程菌分泌产量4―5克/100千克 100克/1000升培养液比较产量低、价格高、供不应求产量高、工厂化生产、满足患者需要白细胞
介素－2：是淋巴细胞产生的一种淋巴因子本质：小分子蛋白质（分布于血清中）功能：能促进淋巴细胞活化和增殖应用：主要用于治疗肿瘤和感染性疾病生产：白细胞介素－2在大肠杆菌中的高效表达，发酵工程生产干扰素：是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白本质：可溶性糖蛋白（分布于血清和组织液）来源：被病毒感染的组
织细胞产生（非病毒基因表达产物）功能：① 它是一种抗病毒的
特效药，对细菌和真菌感染作用不大② 几乎能抵抗所有病毒引起的感染，如水痘、肝炎、狂犬病等病毒引起的感染，③ 干扰素对治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症和某些白血病也有一定疗效。干扰
素生产传统方法基因工程方法来源从人血液中的白细胞内提取
大肠杆菌及酵母菌细胞内获得产量 1mg干扰素/300L血液 20～
40mg干扰素/1kg细菌培养物比较基因工程方法生产产量高、效果
稳定、成本低，适于工厂化生产基因工程药物：蛋白质产品：胰岛素、干扰素外、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品等疫苗产品：预防乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、虐疾等疾
病的各类疫苗。 B. 用于基因诊断与基因治疗基因工程技术还可以
直接用于基因的诊断和治疗。 1. 基因诊断：用放射性同位素（如
32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。基本原理：
分子杂交诊断病例：① 病毒性疾病：利用DNA探针可以迅速地检
出肝炎患者的肝炎病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒。② 诊断遗传性疾病：用β－珠蛋白的DNA探针检测出镰刀状细胞贫血症，苯丙氨酸羟化酶基因探针检测出苯丙酮尿症。③ 肿瘤诊断中的应用：用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的DNA探针，可以用来检测白血病。 2. 基因治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的病例试验：半乳糖血症：常染色体单基因隐性遗传病病理：乳糖代谢异常由于细胞内半乳糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，因此当乳糖分解成半乳糖后，不能继续转化为葡萄糖，过多的半乳糖在体内积聚，会引起肝、脑等功能受损治疗：体外试验水平用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体
组织细胞，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了结论：用基因
替换的方法治疗这种遗传病是可能的基因治疗并非对致病基因进行
修复该种治疗方法并不能稳定遗传二. 基因工程与农牧业、食品工
业 1. 主要应用：培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品种。（1）通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。如：用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。实验：将菜豆
储存蛋白的基因转移到向日葵中，培育出了“向日葵豆”植株前景：如果以此作为技术基础，把大豆蛋白的基因转移到水稻、小麦等粮食
作物中，就可以提高这些作物的蛋白质含量，改善它们的品质。（2）
用基因工程的方法培育出具有各种抗逆性的作物新品种。原理：抗
性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如抗虫、抗
病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等（自然界中细菌身上几
乎可以找到植物所需要的各种抗性）例如：抗虫的烟草、番茄、马
铃薯、玉米、大豆、油菜、棉等作物，抗黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病
毒的作物，以及抗除草剂的植物等（3）基因工程在畜牧养殖业上的
应用：病毒DNA 实验前景：① 特殊动物：将人生长素基因和牛
生长素基因分别注射到小白鼠的受精卵，得到体型巨大的“超级小鼠”
② 乳房反应器利用某些特定的外源基因在哺乳动物体内的表达，从
这些动物的乳腺细胞中获得人类所需要的各类物质，如激素、抗体及
酶类等。③ 开辟新的食物来源可以用基因工程的方法从微生物中
获得人们所需要的糖类、脂肪和维生素等产品。
三. 基因工程与环境保护 1. 用于环境监测――用DNA探针可以检
测饮用水中病毒的含量方法：使用一个特定的DNA片段制成探针，
与被检测的病毒DNA杂交，从而把病毒检测出来特点：快速、灵敏（用传统方法进行检测，一次需要耗费几天或几个星期的时间，精确
度也不高。用DNA探针只需要花费一天的时间，并且能够大幅度地提
高检测精度，据报道，1t水中有10个病毒也能检测出来。） 2. 用
于被污染环境的净化――工程菌分解环境污染物“超级细菌”：把
能分解三种烃类的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌” 假单胞杆菌：异养需
氧型
【模拟试题】一. 判断题 1. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、
连接酶和运载体。（） 2. 限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列。（） 3. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列。（） 4. 目的基因是指重组DNA质粒。（） 5. 只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么，目的基因一定能成功地进行表达。（） 6. 基因治疗主要是对有缺陷的细胞进行修复。（） 7. 基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗性的农作物。（） 8. 用基因工程方法培育的抗虫植物也能够抗病毒。（） 9. 基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育体型巨大、品质优良的动物。（） 10. 任何一种假单孢杆菌都能分解四种石油成分，因此，假单孢杆菌是“超级细菌”。（）
二. 选择题 1. 1971年，科学家在体外做实验，将带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染半乳糖血症患者（半乳糖苷转移酶基因缺陷）的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能产生半乳糖苷转移酶，恢复了将半乳糖转化为葡萄糖的能力，从而能利用半乳糖能量。该材料说明（） A. 半乳糖血症为显性遗传病，会导致体内半乳糖积聚，进而导致肝伤害 B. 噬菌体自身携带有半乳糖苷转移酶基因，能合成半乳糖苷酶 C. 实验展示了基因治疗的前景，表明能对缺陷基因进行修复达到治疗疾病的目的 D. 人类已经能定位并且分离出半乳糖转
移酶基因，可以通过基因探针进行基因诊断 2. 关于基因工程的叙述正确的是（） A. 限制酶只有在获得目的基因时才用 B. 重组质粒的形成是在细胞内完成 C. 质粒都可以作为运载体 D. 蛋白质结构
分析可为目的基因的合成提供材料 3. 苯丙氨酸羟化酶基因探针可
以用来检测苯丙酮尿症，其基本原理是（） A. 利用苯丙氨酸羟化酶催化反应来检测酮尿症症状 B. 利用苯丙氨酸羟化酶基因测序确
定是否患苯丙酮尿症 C. 通过标记的DNA探针分子与苯丙氨酸羟化
酶基因分子杂交检测确定 D. 通过标记的DNA探针分子与苯丙氨酸
羟化酶RNA分子杂交检测确定 4. 关于运载体的描述中正确的是（）A. 运载体的物质本质是蛋白质，能够在不同的细胞间转移基因 B. 运载体主要存在于细胞膜上，完成膜两侧的信息交流和物质转运功能C. 运载体是核酸分子，能够与基因重组完成携带转移、遗传信息的作用 D. 运载体可以是动植物病毒，主要完成蛋白质转运功能 5. 基
因工程操作是在哪个水平上完成的（） A. 染色体水平 B. 细胞水平 C. 转录水平 D. DNA分子水平三. 简答题 1. β－珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的功能不正常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β－珠蛋白，想一想，应如何进行设计？ 2. 基因工程对人类产生的影响都是有益的吗？为什么？ 3. 下图是将人的
生长素基因导入到细菌M内制造“工程菌”示意图，所用载体质粒A，已知细菌M内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌M后，其上的基因能得到表达。则：（1）人工合成目的基因的途径一般有那两条？写出其过程。（2）在分子遗传学上C被称为
_____________，其特点是________________________。如何根据通过A、B来构建C，请写出简要过程。（3）通常用CaCl2处理M，完成导入过程，其原因是什么？导入过程的效率是很低的，只有少数的M才能称为工程菌，请问如何选择可用于工业发酵生产的工程菌菌株。（4）工程菌成功表达的标志是什么？ 4. 利用基因工程生产蛋白质药物，经历了三个发展阶段。第一阶段，将人的基因转入细菌细胞；第二阶段，将人的基因转入小鼠等动物的细胞。前两个阶段都是进行细胞培养，提取药物。第三阶段，将人的基因转入活的动物体，饲养这些动物，从乳汁或尿液中提取药物。（1）将人的基因转入异种生物的细胞或个体内，能够产生药物蛋白的原理是基因能控
制。（2）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为它们的分子都具有双螺旋结构，都是由四种
构成，基因中碱基配对的规律都是。（3）人的基因在异种生物细胞中表达成蛋白质时，需要经过和翻译两个步骤。在翻译中需要的模板是，原料是氨基酸，直接能源是ATP，搬运工兼装配工是，将氨基酸的肽键连接成蛋白质的场所是，“翻译”可理解为将由个“字母”组成的核酸“语言”翻译成由个“字母”组成的蛋白质“语言”，从整体来看在翻译中充任着“译员”。（4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液提
取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：处于动物都可生产药物。 5. 科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，“放入”棉花的细胞中与棉花的DNA结合起来并发挥作用，请回答下列有关问题：（1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是，此工具主要存在于
中，其特点是。（2）苏云金芽孢秆菌一个DNA 分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“鸟枪法”。具体做法是：用酶将苏云金芽孢杆菌的切成许多片段，然后将这些片段，再通过转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把分离出来。（3）进行基因操作一般要经过的四个步骤是、、、。
[参考答案]
1. × 运载体不是酶，是DNA分子
2. × 不同的限制酶有不同的识
别位点，切割位点也各不相同3. √ 4. × 目的基因是自然界中存
在的各种基因，为人类所要利用的基因 5. × 目的基因转移成功不
一定能够表达，表达是一个受调控的复杂过程6. × 基因治疗是一
种补偿性治疗，对原来的基因没有做修复处理7. √ 8. × 不同的
目的基因功能不同，抗虫基因和抗病毒基因不是同一基因9. × 转
基因动物主要是培育能产生特定蛋白质的动物10. × 一般假单孢
菌子只能分解一种烃二. 选择题： 1. D 2. D 3. C 4. C 5. D 三. 简答题： 1. 提取目的基因、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、对目的基因检测 2. 基因工程的应用不一定都是好的：（1）安全性问题：对人体是否真正安全（2）生态环境问题：转基因生物会不会导致生态平衡被破坏（3）大众能否接受：混淆了传统意义上的界限，如动物蛋白和植物蛋白等（4）社会伦理道德问题：克隆生物（人）的认可问题 3.（1）① 逆转录法：利用提取的目的基因的mRNA逆转录出单链DNA，然后合成双链DNA分子，获得目的基因；② 人工化学合成法：通过分析蛋白质的氨基酸序列，根据遗传密码子，推导出mRNA的碱基序列，根据碱基互补配对原则，推导出目的基因
的碱基序列，通过化学方法合成。（2）重组DNA分子（重组质粒）；
质粒上含有目的基因；用同一种限制性内切酶分别切割A、B，使A、B具有同一种粘性末端，将A、B以适当比例混合，利用DNA连接酶使形成重组质粒C （3）CaCl2处理使细胞壁的通透性变大，外源DNA 更容易进入细菌。利用添加青霉素的选择培养基培养转到细菌，如果长出菌落，表明该菌落细菌具有青霉素抗性，为转导成功菌株，携带人生长素基因，可作为工业生产用的工程菌。（4）能够分泌人生长素 4.（1）蛋白质的合成（2）脱氧核苷酸；A对T、G对C （3）转录；mRNA；tRNA；核糖体；多个；3个；tRNA （4）不同发育时期的 5. （1）限制性内切酶；微生物；只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子（2）限制性内切；DNA分子；分别载入运载体；运载体；复制；目的基因（3）提取目的基因；目的基因与运载体结合；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达
基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班
基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I
第二章习题 一、单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ） A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是（ A ） A. 37℃ B.30℃ C.25℃ D.16℃ E.33℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）
基因工程基本过程 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 主要过程有为四步： 一．获得目的基因 有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程： （1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。 （2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。 （3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。 （6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法 适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。 过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
有关转基因植物争论的看法摘要与前言：植物转基因工程是指通过基因枪等基因工程手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系令列人鼓舞的成果。毫无疑问,能够按照人类意愿来“创造”优良作物新品种的植物基因工程近年来所取得的长足进展是激动人心的,它必将为未来农业的发展和满足人类日益增长的器要发挥巨大的作用。但是.在给人们带来明显经济效益和社会效益的同时,植物基因工程也可能带来一些重大的潜在危险。所以.必须从利弊两方面来考虑转基因植物的最终应用，并要对其做出正确的安全性评价。
目录 一：什么是转基因植物。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。3 二：转基因植物的发展方向。。。。。。。。。。。。。。。。。。。4 三：转基因安全性评价。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。5 四：对转基因争论的看法。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。6
一：什么是转基因 转基因植物是经过遗传改良进天然物种不具有基因序列的植物。这些基因序列来自不同的物种，并通过引入改变植物的一些基本特性。农作物是最经常实施转基因工程的植物，能通过引入新遗传材料提高产量和品质。 其中一些能培育进这些转基因植物的优良品质包括抗病虫害，提高产量，更高品质的水果、蔬菜或花卉，以及天气条件耐受性增加等。在发明人工插入新遗传材料之前，植物只是简单的在同一物种中找出最好的种子加以培育以期获得更高产量和品质。而转基因能让这一过程变的更有效。 首先要做的是确定需要替代的基因。DNA的每一个部分都管辖不同的植物部位。遗传专家必须确定用哪些基因控制每一个特定过程，并确定要被替代的植物部分。在本土环境中，植物通过授粉过程获得新遗传材料。转基因植物可以通过多种方式在这一过程中人工插入新信息。例如，基因枪是一个把新DNA通过细胞壁直接注射进植物细胞的新技术。这种方法在单子叶植物植入过程中很受欢迎。 在创造转基因双子叶植物时，农杆菌介导法最成功。该过程把基于土壤的农杆菌当做载体。在注入新的DNA后，细菌被导入植物根茎附近的土壤。这种独特的菌株会侵入植物并用植物自己的细胞再生，然后引入新的遗传品系。
第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基
第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1. 转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
生物选修3专题一基因工程习题 一．单选题： 1．下列有关基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．DNA 连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 B ．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C ．目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外 D ．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 2．下列关于基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B ．细菌质粒是基因工程常用的运载体 C ．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA ，用另一种处理运载体DNA D ．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 3．下列四条DNA 分子，彼此间具有粘性末端的一组 （ ） ① ② ③ ④ A ．①② B ．②③ C ．③④ D ．②④ 4．下面图中a 、b 、c 、d 代表的结构正确的是：（ ） A ．a —质粒RNA B ．b —限制性外切酶 C ．c —RNA 聚合酶 D ．d —外源基因 5．目的基因与运载体结合所需的条件是：（ ） ①同一种限制酶 ②具有标记基因的质粒 ③RNA 聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA 连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A ．①②③④⑤⑥⑦ B ．①②④⑤⑥⑦ C ．①②③④⑤⑦ D ．①②④⑤⑦ 6．科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA 分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用的方式进入细胞内，DNA 被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA 整合到细胞染色体中的过程，属于( ) A ．基因突变 B ．基因重组 C ．基因互换 D ．染色体变异 7．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 A . 提高受体细胞在自然环境中的耐药性 ( ) B. 有利于对目的基因是否导入进行检测 C. 增加质粒分子的分子量 D ．便于与外源基因连接 8．下列不可作为基因工程中的标记基因的是：（ ） A ．抗性基因 B ．发光基因 C ．产物具有颜色反应的基因 D ．贮藏蛋白的基因 9．如果科学家通过转基因工程，成功地把一名女性血友病患者的造血干细胞进行改造，使其凝血功能恢复正常。那么，她后来所生的儿子中：（ ） A ．全部正常 B ．一半正常 C ．全部有病 D ．不能确定 10．下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是：（ ） 11．1987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明：（ ） ①萤火虫与烟草植物的DNA 结构基本相同 ②萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 ③烟草植物体内合成了萤光素 ④萤火虫和烟草植物合成蛋白质的方式基本相同 A ．①和③ B ．②和③ C ．①和④ D ．①②③④ 12．人们常用DNA 进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA ，用限制性内切酶将DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA 小片段分离，再使用特别的DNA “探针”去寻找特定的目的基因。DNA “探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X 光下，便会显示由DNA 探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA 的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA “探针”是指：（ ） A ．某一个完整的目的基因 B ．目的基因片段的特定DNA C ．与目的基因相同的特定双链DNA D ．与目的基因互补的特定单链DNA 13．2003年我国科学工作者用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用及机理是：（ ） A ．治疗“非典”,利用的是抗原抗体反应 B ．诊断“非典”,利用的是DNA 分子杂交原理 C ．诊断“非典”，利用的是抗原抗体反应 D ．治疗“非典”，利用的是DNA 分子杂交原理 T A G G C C A T T A C C G G T A
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
专题一基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析
本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些（限制酶、DNA连接酶、载体）
一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析 本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程？（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些？（限制酶、DNA连接酶、载体） （3）运载体需要具备哪些条件？（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制） 上节课我们学习了DNA重组技术的基本工具，本节课我们将继续学习《基因工程》的核心内容——基因工程的基本操作程序。我们来看本节课的学习目标。（多媒体展示学习目标，强调重难点） （三）合作探究、精讲点拨
扬州大学附属中学东部分校2015 寒假高二生物选修 《基因工程》专题测试题 班级学号姓名 一、选择题 1．有关蛋白质合成的叙述，不正确的是 A．终止密码子不编码氨基酸 B．每种 tRNA 只运转一种氨基酸 C． tRNA 的反密码子携带了氨基酸序列的遗传信息 D．核糖体可在mRNA上移动 2．酶 A、 B、 C 是大肠杆菌的三种酶，每种酶只能催化下列反应链中的一个步骤，其中任意一种酶的缺失均能导致该菌因缺少化合物丁而不能在基本培养基上生长。 现有三种营养缺陷型突变体，在添加不同化合物的基本培养基上的生长情况如下表： 由上可知：酶A、 B、 C 在该反应链中的作用顺序依次是 A．酶 A、酶 B、酶 C B．酶C．酶 B、酶 C、酶 A D．酶A、酶C、 酶 C、酶B、 酶 B A 3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的 基因完成了在受体细胞中表达的是 A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 4．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有 3 个酶切位点，如图中箭头所指，如果该 线性 DNA分子在 3 个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、 c、 d 四种不同长度的 DNA 片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA 分子上至少有 1 个酶切位点被该酶切断，则从理论 上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生 长度不同的 DNA片段种类数是 线性 DNA分子的酶切示意A． 3B． 4C．9D． 12 5．现有一长度为 1000 碱基对（ bp）的 DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI 酶切后得到的DNA分子仍是 1000bp，用 KpnI 单独酶切得到 400bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子，用 EcoRI 、KpnI 同时酶切后得到 200bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子。该 DNA分子的酶切图谱正确的 是 6．已知基因表达载体中的复制原点处比较容易打开双链，可以推断该处 A． A+T的比例较高B．C+G的比例较高 C．位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位 D．位于基因的尾端，是转录停止的信号 7．下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是 A．在特定的切点上切割B．活性受温度的影响 C．能识别和切割RNA D．可从原核生物中提取 8．下列有关基因结构的叙述，正确的是 A． . 真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的序列 B．原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的 C．非编码区是两个基因之间没有遗传效应的区段 D．终止密码子的作用是阻碍RNA聚合酶的移动
基因工程的基本内容 基因工程的基本内容一.本周教学内容：基因工程的基本内容二.学习内容：本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。基因工程的基本内容 一. 本周教学内容： 基因工程的基本内容 二.学习内容： 本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。了解基因工程对现代社会的贡献及基因工程应用的发展。 三. 学习重点： 1. 基因工程的概念 2. 基因工程的操作工具 3. 运载体的基本条件 4. 基因工程的基本操作步骤
5. 基因工程的应用和发展 四. 学习难点： 1. 基因工程工具：限制酶、运载体 2. 运载体的基本要求 3. 基因工程的操作步骤 4. 如何检测基因操作 5. 基因工程应用的两面性 五. 学习过程： （一）概念：基因工程——又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 是指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。 概念要点： 1. 在DNA分子水平上进行设计操作的 2. 在生物体外实现的基因改造 3. 对受体细胞进行无性繁殖 4. 重组基因最终表达获得性状 （二）基因操作的工具 1. 抗虫棉的培育：将抗虫的基因从某种生物（如苏云金芽孢杆菌）中提取出来，“插入”到棉花的细胞中，及棉细胞
精心整理 阶段质量检测(一)基因工程 (时间：45分钟，满分：100分) 一、选择题(每小题3分，共45分) 1．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是() A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 接 B， 下列 B 依据 A．作为标记基因，研究基因的表达 B．作为标记蛋白，研究细胞的转移 C．注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D．标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4．下列有关质粒的叙述，正确的是() A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B．质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA C．质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D．基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核DNA、动植物病毒以及λ噬菌体的衍生物 5．下列有关基因工程的叙述正确的是() A．用同种限制性核酸内切酶切割载体与含目的基因的DNA片段可获得相同的黏性末端 B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同 C．检测到受体细胞中含有目的基因就标志着基因工程育种已经成功 D．质粒上抗生素的抗性基因有利于质粒与外源基因连接 6．下列有关基因工程和蛋白质工程步骤的叙述不．正确的是() A．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法 B．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 C．蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质的技术 D．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质 7．利用细菌大量生产人的胰岛素，下列叙述错误的是() A．用适当的酶对载体与人的胰岛素基因进行切割与黏合 B．用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌 C．通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细菌 D．重组DNA必须能在受体细菌内进行复制与转录，并合成人的胰岛素 8．下列关于图中P、Q、R、S、G的描述，正确的是() A．P代表的是质粒RNA，S代表的是外源DNA B．Q表示限制酶的作用，R表示RNA聚合酶的作用 C．G是RNA与DNA形成的重组质粒 D．G是转基因形成的重组质粒DNA
Chapter I Introduction 1)什么是基因基因有哪些主要特点 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存 在对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程简述基因工程的基本过程p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同为什么 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母 Chapter Ⅱ The tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶简述其主要类型和特点 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14
基因工程的基本过程 基因工程主要包括几个过程： 1、目的基因的制备； 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子； 3、将重组DNA片段导入受体； 4、选择目的基因； 5、目的基因的表达。 对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤： 图10-3-8 基因工程过程
(1)目的基因的分离和制备 目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。 这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。 2.人工合成目的基因DNA片段 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
基因工程专题习题 一、回答有关基因工程的问题。（10分） 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割微点，图一、图二中箭头表示相关限制酶的酶切位点。 64．限制酶Sma I 和限制酶Xma I 作用的相同点是________________________________，不同点是____________________________________________。 65．研究发现复制原点的碱基序列特点通常含A 、T 碱基较多，其意义是_______________________。 66．图二中的目的基因需要同时使用Mse 酶和Pst I 酶才能获取，而图一所示的质粒无相应的限制酶切位点。所以在用该质粒和目的基因构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。试写出构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件）： ①首先用_______________酶处理质粒； ②然后用DNA 聚合酶处理质粒，使被酶切开的质粒末端连接上相应的脱氧核糖核苷酸； ③再运用_______________酶处理质粒，从而形成新的限制酶切位点，即可被__________酶识别。 基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。下图表示运用影印培养法（使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。 限制酶 Mse I Pst I EcoR I Sma I Xma I 识别序列及切割位点 GAATTAATTC CTTAATTAAG CTGCAG GACGTC GAATTC CTTAAG CCCGGG GGGCCC CCCGGG GGGCCC
2019-2020年高考生物试题分类汇编（课标版）：基因工程（2011年江苏卷）33．（8分）请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理 与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合 成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有 引物A的DNA片段所占的比例为▲。 ②在第▲轮循环产物中开始出现两条 脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。 某同学设计的两组引物（只标注了部分碱 基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。 ①第1组：▲；②第2组：▲。 (3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为▲。 (4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb 即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。 33．（8分）
(1)①15/16 ②三 (2)①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 (3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结 合到双链DNA片段的引物链上 (4)见右图 （11年北京卷）31.（16分） T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T1代）。 （1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除，因为后者产生的会抑制侧芽的生长。 代播种在含的培养基上生长，成熟后自（2）为筛选出已转化的个体，需将T 1 代）。 交，收获种子（称为T 2 代播种在含的培养基上，获得（3）为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T 2 所需个体。 （4）经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与植株进行杂交，再自交代后统计性状分离比。 （5）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失， 从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性。 （6）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。 其过程是：提取植株的DNA，用限制酶处理后，再用将获得 的DNA片段连接成环（如右图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链 DNA片断中选取作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。答案：31（16分） （1）顶芽生长素 （2）（一定浓度的）除草剂 （3）（一定浓度的）盐 （4）野生型 1 （降低 （6）突变体DNA连接酶B、C