植物DNA 甲基化与转基因沉默
蒋自立
(贵州省遵义师范学院生物系,贵州遵义563002)
摘要 D N A 甲基化是表观遗传修饰的重要形式之一,植物D N A 甲基化及其引起的转基因沉默现象的研究对植物基因工程领域的发展有着举足轻重的作用。介绍了植物D N A 甲基化作用机理及其过程中至关重要的3种胞嘧啶甲基转移酶:M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶(C M T)和结构域重排甲基转移酶(D R M),并阐述了植物D N A 甲基化的相关机制,包括RN A 介导的D N A 甲基化(Rd MD )、组蛋白修饰与D N A 甲基化和D N A 去甲基化。通过分析植物转基因沉默现象与D N A 甲基化的关系,提出了克服由D N A 甲基化引起的转基因沉默的相关对策。关键词 D N A 甲基化;转基因沉默;表观遗传;基因工程
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)12-05386-04
D NA Methylation and T ransgene Silencing in Plants
JIA NG Zi 2li (Bio lo g y D epart ment of Z u nyi N ormal Co llege,Z un yi,G uizh ou 563002)
Abstract D N A m eth ylati on is one o f the mo st sig nificant epig en etic m odificatio n m od us.A nd the research o f p lan t D N A m eth ylati on and tran sgene si 2lencing has been playin g a vital role in the dev el op ment of genetic engi neeri ng tec hnol og y.The study in tro duces the mo de o f D N A m eth ylati on and the mo st im po rtant D N A meth yltransferase throu g h D N A methy lated process:ME T1,D R M,an d C M T,w hich i ndicates the p ro g ress o f research o n the mechani sms o f D N Amethylation ,such as R N A 2depen dent D N A methy latio n,histo ne meth ylatio n,and D N A dem eth ylati on.Thro ug h analyzin g the relati on ship betw een D N A m ethylati on an d trans gene silencin g,it pu ts forw ard so me relativ e strateg ies to av oid o r reduce the effect o f trans gene silencin g.Key w ords D N A methy latio n;T ransg ene silencin g;E pigenetic in heritance;G enetic en gineerin g tech nol og y
作者简介 蒋自立(1966-),男,贵州遵义人,副教授,从事生物化学
与分子生物学研究。
收稿日期 2009202201
遗传学告诉我们,基因结构的改变会引起生物体表现型的改变,而这种改变是可以遗传的。然而,近年来的研究表明,现代生物从祖先基因组中所获得的生长、发育和进化信息并不仅仅是基因序列。在基因的D NA 序列不发生变化的条件下,基因表达发生的改变也是可以遗传的,导致可遗传的表现型变化。这种表现型变化因没有直接涉及基因的序列信息,因而是/表观0的,称为表观遗传变异,又叫表观遗传修饰。D NA 甲基化作为从细菌到人类最普遍的表观修饰方式,是表观遗传修饰的一种重要方式,对功能基因组时代的研究具有重要的意义。甲基化修饰在基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。如D NA 甲基化与基因的转录失活,尤其是转基因的失活、转座子的转移失活等多种后生遗传基因的失活存在密切的关系[1]。并且,从所报道的转基因沉默例子来看,几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化都有关。笔者就D NA 甲基化这一表观遗传现象做简要介绍,并分析D N A 甲基化同植物转基因沉默现象之间的联系,借此探讨D N A 甲基化引起的植物转基因沉默的解决对策。
1 DNA 甲基化模式
1.1 D NA 甲基化作用 D N A 甲基化修饰方式为CpG 二核苷酸胞嘧啶第5碳原子的甲基化,是通过甲基转移酶(D NA me thyltransfe rase,M tase)的催化作用,以S 腺苷甲硫氨酸(S A M )为供体,将甲基转移到DN A 分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基上的过程,主要形式有52甲基胞嘧啶,N62甲基腺嘌呤和72甲基鸟嘌呤。在高等植物中,多数D NA 甲基化发生在GC 富集区和高度重复序列处。对于重复序列,甲基化除发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子上,还常发生在C AG 、C TG 三核苷酸和C C G 模体中,并且常常是对称的甲基化,但也有非对称序列甲基化的报道[2]。而非重复序列基因
在这些位点常常并不发生甲基化[3]。
D NA 甲基化作为最早被发现,最普遍的表观修饰途径广
泛存在于生物界。研究发现D NA 甲基化在不同生物中发生情况各不相同,在原核生物中CC A/T TG 和C A TC 常会被甲基化;真核生物D NA 中,52甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基;植物则分布于5c 2C G 23c 或5c 2C NG 23c 序列中;脊椎动物中,甲基化位点存在于5c 2C G 23c 序列处。真核生物中,大部分GC 序列都处于甲基化状态,而位于管家基因和少量组织特异性基因的5c 端C pG 岛(C pG 成簇出现的区域)则呈非甲基状态。其分布一般与基因的密度有很好的线形对应关系。如,人类基因组中,大小为100~1000bp 的C pG 岛总是处于未甲基化状态,并且与56%的人类基因组编码基因相关。植物基因组的52甲基胞嘧啶水平与基因组的重复序列水平是相关的。如,总共只有120Mb 碱基的拟南芥,其基因组中约有6%的甲基化胞嘧啶;而具有2500M b 的玉米基因组中大约有25%的胞嘧啶被甲基化。在同种生物中D NA 甲基化的程度也不相同。以植物为例,植物中胞嘧啶发生甲基化的比例因植物种类而异,裸子植物比开花植物D NA 包含更少的甲基化胞嘧啶[2],高等植物D NA 的甲基化比例从4.6%~30.0%不等[4]。在同一物种不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段,基因组D NA 各CpG 位点甲基化状态也各不相同。玉米中编码胚乳特异性表达的B 2z ip 的O paque 2基因,启动子序列在叶片组织中(非表达组织)D NA 高度甲基化[5]。此外,在不同环境下以及植物特定基因及其启动子区域的甲基化分布也不同。
1.2 胞嘧啶甲基转移酶 在植物D NA 甲基化过程中,D NA 甲基转移酶起着非常重要的作用,它催化D NA 甲基化的完成。根据甲基化作用过程,可将植物细胞中的DN A 甲基转移酶分为结构和功能不同的3类[6],即M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶和结构域重排甲基转移酶。
1.2.1 M ET1甲基转移酶家族。该类甲基转移酶的主要功能可能是作为维持性甲基化酶,也可能在重新甲基化中起作用,现已在胡萝卜、豌豆、番茄和玉米中分离得到了M ET1及
安徽农业科学,Jo u rnal of Anh ui Agri.S ci.2009,37(12):5386-5389 责任编辑 孙红忠 责任校对 况玲玲
其同源物。第一个编码植物D NA甲基转移酶的基因是由Finne gan等从一个转基因的拟南芥品系中分离出来的,即M E T1甲基转移酶[7]。M E T1比原核细胞中的甲基转移酶大得多,在结构上类似于哺乳动物的甲基化酶Dnm t I[8],二者在甲基转移酶结构域上有50%的同源性。它的主要功能是将酶引向细胞核,在S期将酶引向复制叉和对半甲基化模板具高度选择性[9-10]。它在重复和单拷贝的D NA序列中维持甲基化,且对C G双核苷酸的甲基化活性比对C NG三核苷酸甲基化的活性要强。最近研究发现,M ET1在从头甲基化C G 岛的过程中与一个发起甲基化的R NA片段有应答,从而增强了从头甲基化酶的活性[2]。M ET1还对许多形态特征、花期调控、移植变化和胚胎发育等有影响。
1.2.2染色质甲基化酶(C M T)。C M T是植物中特有的一种甲基化酶[11],最初是He nikof f等在搜寻包含染色质结构域的植物蛋白数据库时发现的[12],主要负责维持C pNpG(N代表A、T、C或G)三核苷酸中胞嘧啶的甲基化。染色质结构域是指几种染色质结构调节因子具有的一种蛋白质结构域,不同的染色质结构域可以结合组蛋白、R NA和D NA。C M T结构也与哺乳动物的Dnm t I相似,但是在C M T中有一个新的有色域氨基酸基元插入到了两个甲基转移酶基元之间。它同时具有一个染色质结构域和C2甲基化催化活性,对对称结构上的甲基化有特殊作用。C M T中存在此结构域表明此类酶与异染色质区域的D N A甲基化有关。目前,在拟南芥中已经识别了至少3个C M T编码的基因,其中C M T1被认为是没有功能的[13]。
1.2.3结构域重排甲基转移酶(DR M)。该类酶包括D R M1、DR M2和Z me t3,已在拟南芥和玉米中发现,其结构与哺乳动物的Dnm t II I甲基化酶类似[5]。D R M的作用是在非对称位点从头甲基化D NA序列并维持失活转座子及转基因沉默位点的胞嘧啶甲基化修饰,并且对与外源siR NA同源的D NA中所有的胞嘧啶进行从头甲基化[14]。DR M与C M T共同维持Cp NpG和C pNpN(N非G)核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化。
此外,植物中还存在其他甲基化转移酶,如玉米中发现的D M T104和拟南芥中发现的D M T11,它们可能是D NM T I I 家族的同系物。因其在不少物种中是保守的,所以功能目前尚不清楚[15]。
1.3D NA甲基化的相关机制
1.3.1RN A介导的D NA甲基化(RdD M)。RdD M是首次在植物中发现的基因组表观修饰现象,在外源基因转录过程中,过剩的R NA与同源的cD NA配对,从而使外源基因甲基化或异染色质化。1994年,Wassene gge r等用农杆菌转化法将类病毒(一类可自主复制的R NA分子)cD NA序列导入烟草基因组时发现,当类病毒再次感染烟草并进行复制时,烟草基因组中与病毒R NA同源的c D NA序列发生了甲基化,这是首次在植物中发现的Rd D M现象[16]。
在植物基因组中,维持性D NA甲基化优先发生在对称的C G序列的胞嘧啶上,在C NG(N指任意核苷)序列及非对称序列中也有发生。RdD M的独特之处在于它既包含了C G 序列的胞嘧啶甲基化,又包含了非C G序列的甲基化。RdD M 是依赖于RN A的DN A甲基化作用,在拟南芥中发现,它的发生依赖于RN A干扰(R NAi)途径中相似的酶,如DC L3、R NA 聚合酶(RdR2)、S D E4和AG O4,这些酶的缺失会影响RdD M 的发生[17-18]。进一步研究发现,RdD M还依赖于诱发因子大小为21~25nt的小干扰RN A(siR NA)的存在[19],这类siR NA 在细胞质或细胞核内经特定的D C L加工双链RN A(dsR NA)而产生,是植物所特有的。
1.3.2组蛋白修饰与D NA甲基化。与哺乳动物和菌类类似,植物DN A甲基化也与组蛋白修饰紧密相关。例如在拟南芥中发现的一种类蛋白质,既有蛋白甲基化酶(HM T)的活性,又有非C G序列D NA甲基化的维持功能[20-21]。对麦孢菌的相关研究结果表明,D IM25基因(编码一个SE T域蛋白质)对DN A甲基化是必需的,而SE T域蛋白质形成的一个蛋白质家族,能够通过组蛋白甲基化影响基因的表达。另外,组蛋白脱乙酰酶基因是小R NA指导的D NA甲基化的必备要素,因此DN A甲基化同组蛋白去乙酰化有关。首先,表观遗传信息是通过组蛋白去乙酰化和D NA甲基化从组蛋白流向D NA,C e rvoni等研究发现,组蛋白去乙酰化可能指导D NA甲基化,而且去乙酰基酶抑制剂会引起特异的胞嘧啶低甲基化[22]。其次,有证据表明DN A甲基化可能对赖氨酸甲基化产生反馈作用,甲基化C pG结合蛋白可能有利于它们调控的甲基化基因邻近的组蛋白H3中赖氨酸29(H3K9)的甲基化,使D NA甲基化优先于H3K9的甲基化,并指导它的完成[23]。
1.3.3D NA去甲基化。D NA去甲基化是一种重要的D NA 功能调节机制,通常分为2种类型:位点特异性去甲基化和总基因组的去甲基化。两者在胚胎发育过程中有着重要的作用,保证在特定细胞中只有需要的基因才处于活性状态[3]。DN A去甲基化的机制分为被动去甲基化和主动去甲基化两种。被动去甲基化过程与DN A半保留复制有关,而主动去甲基化过程需要/去甲基化酶0的参与。在植物中, D NA糖基化酶家族的蛋白质能够去除DN A甲基化并减轻沉默的程度。拟南芥中的RO S1(REP RES S OR OF S ILE NC I NG1)基因编码的蛋白质是首个被报道有去甲基化功能的D NA糖基化酶[24]。在胞嘧啶去甲基化过程中,RO S1识别甲基化的胞嘧啶致使糖基酶从D NA骨架上移除甲基化的胞嘧啶,随后D NA骨架在原甲基化位点处裂开,最后D N A被未甲基化的胞嘧啶修复。另一个具有去甲基化功能的D N A糖基化酶是DEM E TER(D M E)。它是通过研究不同亲本对种子发育的影响筛选到的。在控制种子发育过程中,雌配子体中的D ME 基因的表达使得母本基因FW A被激活,且此过程中伴随FW A基因的去甲基化[25]。此外,B hatta chary a等的研究表明,一种甲基结合蛋白M B D2也具有去甲基的功能,因此认为MB D2就是一种去甲基化酶[26]。
2DNA甲基化引起的植物转基因沉默
转基因沉默(transge ne silencing),又称转基因失活,即当向生物体内导入外源基因时,引起目的基因及其相应序列的同源内源基因的表达被特异性抑制的一种基因调控现象。通常转基因沉默只发生在转基因及与其同源的内源基因之间,不影响其他基因的表达。转基因沉默可以分为2类:转录水平上的基因沉默(TGS)和转录后水平上的基因沉默(P T2 G S)。转录水平的基因沉默是由于某种原因造成启动子失
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37卷12期蒋自立植物D NA甲基化与转基因沉默
活,不能正常合成mR NA,导致基因失活,现在也把位置效应引起的基因沉默归到转录水平;转录后水平上的基因沉默表现为启动子是活跃的,但m RN A被降解而不能积累[27]。
在与转录水平上的基因沉默相关的诸因素中,D NA甲基化对基因沉默的影响最大。因其过程发生在D NA合成之后,通常以半保留复制进行D NA修饰,仅对新合成链的胞嘧啶残基逐一进行甲基化修饰[28]。研究发现,几乎所有转录水平的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。不同方式的D NA甲基化导致的植物转基因沉默主要表现在以下几个方面。
2.1位置效应引起的甲基化位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响,当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时,外源基因一般表现沉默。各种生物间的甲基化系统机制有一定差异,外源基因进入植物基因组后,相邻植物基因甲基化向外源基因扩展,引起外源基因的甲基化,导致基因沉默。在矮牵牛植株基因组中整合玉米A1(二氢酮醇还原酶)基因时发现,GC含量为52.5%的基因被高度甲基化,而整合位点两侧的宿主基因(GC含量为26%和23%)仍保持低甲基化状态[29],这是植物基因组对外源基因的一种限制修复反应。外源基因转入该区段,改变了其原来的碱基组成,植物D NA甲基化修饰通过不同的碱基组成来识别外源基因,并激活了甲基化酶使外源基因甲基化而沉默[30]。
2.2重复序列诱导的甲基化多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合到植物基因组上而导致外源基因不同程度失活的现象称为重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。它包括2种作用方式:顺式失活和反式失活。顺式失活是相互串联或紧密连锁的重复基因的失活;反式失活是由于某一基因的失活而引起同源基因的失活,可通过有性繁殖过程的基因分离重组而逆转。当多拷贝的外源基因整合到宿主基因组时,可能重复序列间发生了自发配对,甲基化酶特异地识别这种配对结构使其甲基化,从而抑制了外源基因的表达。研究发现,这种重复序列诱导的基因沉默现象与外源基因拷贝的数量有关,当插入受体基因组一个位点的外源基因拷贝数越多,基因沉默现象越严重。
2.3RdDM介导的转基因沉默这是一种当外源基因转录水平过高时,过剩的R NA与同源的c D NA配对,从而使外源基因甲基化或异染色质化而诱发的转录水平的基因沉默现象。M ette等研究证明,含有启动子序列的双链R NA可以引发启动子区域的从头甲基化[31],诱导转录水平的基因沉默。3DNA甲基化介导的转基因沉默的解决对策
近年来,对于D NA甲基化的研究越来越深入,而D NA甲基化引起的转基因沉默也日益受到关注。为克服转基因沉默,提高转基因效率,世界各国的研究者对转基因沉默机理及其控制方法作了广泛的研究,普遍认为采取以下几方面策略来克服D N A甲基化引起的转基因沉默。
3.1外源基因拷贝数及转化方法的优化既然整合进植物基因组的外源基因的表达水平与拷贝数有着密切的关系,多拷贝的整合方式并不能使基因表达水平有所增加,反而使外源D NA发生甲基化或异染色质化,导致转基因沉默。因此,在植物外源基因转化过程中,应当尽量避免外源基因以多拷贝方式整合到宿主中,而是以单拷贝插入植物基因组。单拷贝个体的筛选可以利用S outhern杂交,反向PC R等分子生物学方法来确定,也可采用杂交、回交等常规育种方法,通过分析后代的分离比来确定。对于筛选到的单拷贝转基因个体,还应对转基因株系转基因表达的稳定性进行鉴定。另外,对于转化方法的选择,通常采用的是方法简单,效率高,且转入基因拷贝数少的农杆菌介导法,也可采用一些改良方法。如选用基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体,Lebel等借助该系统成功将10kb的大片段以完整、单拷贝的方式整合到受体基因组中[32];利用M AR或S AR与转基因构成的转化载体[33]可有效避免转基因的位置效应,以提高转化效率;利用细菌、酵母等可将外源基因以单拷贝方式整合到受体特定位点。
3.2转基因密码子的优化及增强子的使用外源DN A序列与受体植物基因组DN A碱基的不同会造成D NA甲基化,最终导致转基因沉默。因此,在转化前应当对外源D NA进行密码子的优化,尽量使外源基因与受体植物的DN A碱基组成一致,以降低外源基因甲基化的可能性。转化载体中应尽量避免使用相同的启动子及重复序列并保证载体的构建序列在同一个方向阅读以免产生异常或反义RN A,造成反式失活或共抑制。另外,Lichte nstein等研究发现,K链基因的增强子在细胞发育的特定阶段指导该基因区段的去甲基化从而启动基因的转录[34]。因此,可利用外源基因与植物基因组中克隆出的具有组织与发育特异性调控作用的增强子构建嵌合基因进行植物转化,以确保外源基因按照合适的调控模式表达。
3.3去甲基化修饰D NA甲基化会引起转基因沉默现象,那么最直接的克服方法就是采取去甲基化措施,使沉默的外源基因重新表达。目前,主要使用的去甲基化试剂是二羟基丙基腺嘌呤和52氮胞苷。经过这类去甲基化试剂的处理,可使转基因序列非编码区约30%的胞嘧啶去甲基化,转基因水平相应提高12倍。但这类试剂也表现出明显的副作用,吴刚等在对cr y1Ab转基因沉默的水稻植株的研究发现:52氮胞苷虽能使10%左右的转基因沉默植株恢复表达活性,但这些植株分别不同程度出现了植株矮小、结实率低、分蘖数下降和生育期延迟等不利性状,且研究发现52氮胞苷具一定致癌性[35]。因此,对这类试剂的使用方法、用量及作用时间等方面应作进一步研究,以减少副作用和次生危害的产生。
3.4MO M基因及与甲基化作用相关基因的去除M O M基因是一种编码核蛋白的基因,参与染色质的重构过程。已有报道用突变M O M基因或通过其反义R NA的表达来消除M OM基因的转录的m RN A,可以使多种已经沉默的高度甲基化的位点恢复转录活性[36]。研究发现,拟南芥转录水平沉默的释放有2个水平,一个是依赖甲基化水平,即DD M1突变株表现出的去甲基化,另一个是不依赖甲基化水平。后者是对前者的加强,尤其在甲基化缺失时,防止外遗传失控。由此也证明了去除M O M,能够消除转录水平的转基因沉默现象。
另外,将与甲基化相关的基因去除或者使其沉默,同样
5388安徽农业科学2009年
可以消除D NA甲基化引起的转基因沉默现象。如用R NAi 技术去除水稻中的OsM E T121和O sM ET122酶[37],就能够消除由于甲基化导致的转基因沉默现象。因为OsM E T121和OsM E T122酶是与水稻D N A甲基化密切相关的甲基转移酶,对于它们的去除就能阻断D NA甲基化过程的进行。但是这些基因的敲除是否对受体植物正常的生理活动产生重大影响尚需要进一步研究。
4展望
基因沉默是基因表达调控的一种重要方式,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制,在外源D NA侵入、病毒侵染和D N A转座、重排过程中普遍存在。由于基因沉默现象的存在导致转基因效率较低,表达水平不高,在一定程度上制约了植物基因工程的发展。关于转基因沉默现象的分子机理研究尚不够透彻,但已明确D NA甲基化是造成转基因沉默的主要因素。因此,对D N A甲基化及转基因沉默现象的研究有助于提高转基因的表达和效率。目前,虽然研究找到了一些克服D N A甲基化引起的转基因沉默的对策,但研究如何活化导入基因的表达尚处于起步阶段。近年来,研究发现一些小分子RN A也与转基因沉默密切相关,如miR NAs和siR NA对转录后水平沉默的介导,以及siRN A指导的D NA甲基化与组蛋白共同作用对转录水平的介导等。总之,随着对D NA甲基化和转基因沉默机理研究的不断深入,人们终将获得更多的调控机制来有效控制DN A甲基化和转基因沉默现象的发生。
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37卷12期蒋自立植物D NA甲基化与转基因沉默
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。 几种抗病基因进化模式得到提出。重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。而有的这些重组事件发生在高保守区域上。LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。 近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组 成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克 隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功 能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表 型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位 置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
2011年真题答案 1.T-DNA插入诱变原理及应用？ 原理：T-DNA是农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植物。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中，基因由于发生碱基的插入或缺失而发生突变。 应用：T-DNA插入诱变已成为反求遗传学研究的重要手段之一。 1）通过T-DNA插入获得突变植株，通过对突变体与野生型的变化对比，可对植物特定基因的功能进行分析。 2）已广泛应用与拟南芥等模式植物的突变体库构建。 3）T-DNA作为外源基因的载体，可携带外源基因感染植物，获得转基因植物。 2.反向遗传学原理及应用？ 原理：在已知生物体基因组全部序列的基础上,通过DNA重组、RNA干扰、基因沉默等技术对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等,对生物基因组进行改造，研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。 应用：1）用于研究高等动植物相关基因功能: 2）利用反向遗传学,可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编产物在病毒生命周期中的作用,为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。 3)利用反向遗传操作技术对RNA 病毒的cDNA 克隆进行点突变, 降低或消除病毒的活力，可能获得理想的减毒株来研制疫苗。 3.植物转基因沉默的可能原因？ 1）位置效应：因为转基因均是在基因组D N A序列的不同位置随机整合。如果转基因整合位置处于基因异染色质区或转录不活跃区，转基因就会在该区空间结构和成分影响下形成类似结构，导致转录不活跃或异染色质化而失活。 2）转录水平的基因沉默：整合进去的外源基因可能发生了DNA甲基化，抑制其转录。3）转录后和翻译水平的基因沉默：转录后形成的mRNA进入细胞质中，可能被植物细胞质内的RNA酶识别，将其降解；或发生RNA干扰，将mRNA降解。 翻译出的多肽发生了异常的剪接或折叠，失去活性，或被蛋白酶降解。 4.分子标记技术在植物学研究和育种工作的应用？ 分子标记技术主要包括RFLP、VNTR、SNP、染色体原位杂交等技术。 1）植物基因遗传图谱的建立：如通过RFLP技术对植物基因进行限制性片段多态性分析，从而建立植物基因组的遗传图谱，对于研究植物基因的功能有很重要的意义。 2）利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。3）标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。
中国农业科学 1999,32(增刊):94～102 Scientia A gricultrua Sinica 植物与病原菌互作和抗病性的分子机制3 刘胜毅1 许泽永1 何礼远2 (1中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;2中国农业科学院植物保护研究所) 提要 概述了近几年在寄主植物抗病基因与防卫反应基因、病原菌毒性基因、寄主抗病性机制和抗病基因工程策略等方面取得的主要进展,重点分析了抗病反应的一般过程、毒性基因 产物胞外水解酶和毒素的作用与关系、作物抗毒素基因工程策略。 关键词 植物;抗病基因;防卫基因;毒性基因;基因工程策略 早在40年代末50年代初,F lo r(1947;1955)在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中,提出了基因对基因假说(gene2fo r2gene hypo thesis)〔4,5〕,这标志着对植物与病原菌互作的认识深入到了基因水平,从而为应用分子生物学手段研究植物抗病性奠定了基础。本文概要地综述近几年在寄主植物抗病基因、病原菌致病基因、寄主抗病机制等方面取得的主要进展,并试图侧重分析概括抗病反应的一般过程及毒素的作用与基因工程策略。 1 抗病相关基因 根据基因的作用性质,可把抗病反应过程中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反应基因。抗病基因是决定寄主植物对病原菌的专化性识别,并激发抗病反应的基因。即按F lo r的基因对基因理论,它与病原菌的无毒基因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对基因理论分子机制的配体2受体模型〔6〕,它的产物是抗病反应信号传导链的起始组分,即信息链的前端,当它与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物互补结合后,启动信号传导激发植物的抗病反应。防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。除此之外,抗病基因和防卫反应基因的区别还有:(1)抗病基因编码产物具有特异性,而防卫反应基因编码产物具有普遍性,即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因,如植保素合成链中的酶基因、病程相关(PR)蛋白基因、植物细胞壁成分合成酶基因等。(2)抗病基因产物是植物防卫反应基因表达的直接或间接调节因子。防卫反应基因一般是受病原菌诱导表达的,编码产物比较容易分离的一类基因,而抗病基因是组成型表达的,编码产物不容易分离的一类基因。因此在基因克隆、基因编码产物的结构和功能分析等方面的研究工作中,防卫反应基因均早于抗病基因。所以植物防卫基因既有普遍性,又有特殊性。除有一部分是相似的外,还有一部分是不同的,如对真菌、细菌毒素的解毒基因,因毒素不同而不同。而人工赋予植物的解毒基因则可能更加不同,有动物源的,也有微生物源的。 1.1 抗病基因 接收病原菌信号,启动植物抗病反应信号转导的是植物抗病基因的编码产物,这是分子植物病理学研究寄主植物的重点和难点。自1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 收稿日期 1999207215
1转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种,是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导 入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术,可最大限度地满足人类的需要[1]。 与此同时,转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度,对于这种急剧的生物物种变化,自然界能否容纳和承受?自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏?转基因植物及其产品被人们食用时,是否会向人体肠道微生物发生基因转移?是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响?要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序,积累足够的数据,根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全,对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产,对存在安全隐患的加以限制,避免危及人类生存及破坏生态环境[2]。因此,制定科学完善的安全性评价的原则与方法,对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 2转基因农产品安全评价的内容 2.1转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中;是否会破坏自然生态环境,打破原有生物种群的动态平衡[2]。 转基因植物演变为农田杂草的可能性:转基因植物可通过传粉进行基因转移,可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草,如果杂草获得了这些抗性,就会变成超级杂草,使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性:在自然生态条件下,有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交,从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转
植物DNA 甲基化与转基因沉默 蒋自立 (贵州省遵义师范学院生物系,贵州遵义563002) 摘要 D N A 甲基化是表观遗传修饰的重要形式之一,植物D N A 甲基化及其引起的转基因沉默现象的研究对植物基因工程领域的发展有着举足轻重的作用。介绍了植物D N A 甲基化作用机理及其过程中至关重要的3种胞嘧啶甲基转移酶:M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶(C M T)和结构域重排甲基转移酶(D R M),并阐述了植物D N A 甲基化的相关机制,包括RN A 介导的D N A 甲基化(Rd MD )、组蛋白修饰与D N A 甲基化和D N A 去甲基化。通过分析植物转基因沉默现象与D N A 甲基化的关系,提出了克服由D N A 甲基化引起的转基因沉默的相关对策。关键词 D N A 甲基化;转基因沉默;表观遗传;基因工程 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)12-05386-04 D NA Methylation and T ransgene Silencing in Plants JIA NG Zi 2li (Bio lo g y D epart ment of Z u nyi N ormal Co llege,Z un yi,G uizh ou 563002) Abstract D N A m eth ylati on is one o f the mo st sig nificant epig en etic m odificatio n m od us.A nd the research o f p lan t D N A m eth ylati on and tran sgene si 2lencing has been playin g a vital role in the dev el op ment of genetic engi neeri ng tec hnol og y.The study in tro duces the mo de o f D N A m eth ylati on and the mo st im po rtant D N A meth yltransferase throu g h D N A methy lated process:ME T1,D R M,an d C M T,w hich i ndicates the p ro g ress o f research o n the mechani sms o f D N Amethylation ,such as R N A 2depen dent D N A methy latio n,histo ne meth ylatio n,and D N A dem eth ylati on.Thro ug h analyzin g the relati on ship betw een D N A m ethylati on an d trans gene silencin g,it pu ts forw ard so me relativ e strateg ies to av oid o r reduce the effect o f trans gene silencin g.Key w ords D N A methy latio n;T ransg ene silencin g;E pigenetic in heritance;G enetic en gineerin g tech nol og y 作者简介 蒋自立(1966-),男,贵州遵义人,副教授,从事生物化学 与分子生物学研究。 收稿日期 2009202201 遗传学告诉我们,基因结构的改变会引起生物体表现型的改变,而这种改变是可以遗传的。然而,近年来的研究表明,现代生物从祖先基因组中所获得的生长、发育和进化信息并不仅仅是基因序列。在基因的D NA 序列不发生变化的条件下,基因表达发生的改变也是可以遗传的,导致可遗传的表现型变化。这种表现型变化因没有直接涉及基因的序列信息,因而是/表观0的,称为表观遗传变异,又叫表观遗传修饰。D NA 甲基化作为从细菌到人类最普遍的表观修饰方式,是表观遗传修饰的一种重要方式,对功能基因组时代的研究具有重要的意义。甲基化修饰在基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。如D NA 甲基化与基因的转录失活,尤其是转基因的失活、转座子的转移失活等多种后生遗传基因的失活存在密切的关系[1]。并且,从所报道的转基因沉默例子来看,几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化都有关。笔者就D NA 甲基化这一表观遗传现象做简要介绍,并分析D N A 甲基化同植物转基因沉默现象之间的联系,借此探讨D N A 甲基化引起的植物转基因沉默的解决对策。 1 DNA 甲基化模式 1.1 D NA 甲基化作用 D N A 甲基化修饰方式为CpG 二核苷酸胞嘧啶第5碳原子的甲基化,是通过甲基转移酶(D NA me thyltransfe rase,M tase)的催化作用,以S 腺苷甲硫氨酸(S A M )为供体,将甲基转移到DN A 分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基上的过程,主要形式有52甲基胞嘧啶,N62甲基腺嘌呤和72甲基鸟嘌呤。在高等植物中,多数D NA 甲基化发生在GC 富集区和高度重复序列处。对于重复序列,甲基化除发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子上,还常发生在C AG 、C TG 三核苷酸和C C G 模体中,并且常常是对称的甲基化,但也有非对称序列甲基化的报道[2]。而非重复序列基因 在这些位点常常并不发生甲基化[3]。 D NA 甲基化作为最早被发现,最普遍的表观修饰途径广 泛存在于生物界。研究发现D NA 甲基化在不同生物中发生情况各不相同,在原核生物中CC A/T TG 和C A TC 常会被甲基化;真核生物D NA 中,52甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基;植物则分布于5c 2C G 23c 或5c 2C NG 23c 序列中;脊椎动物中,甲基化位点存在于5c 2C G 23c 序列处。真核生物中,大部分GC 序列都处于甲基化状态,而位于管家基因和少量组织特异性基因的5c 端C pG 岛(C pG 成簇出现的区域)则呈非甲基状态。其分布一般与基因的密度有很好的线形对应关系。如,人类基因组中,大小为100~1000bp 的C pG 岛总是处于未甲基化状态,并且与56%的人类基因组编码基因相关。植物基因组的52甲基胞嘧啶水平与基因组的重复序列水平是相关的。如,总共只有120Mb 碱基的拟南芥,其基因组中约有6%的甲基化胞嘧啶;而具有2500M b 的玉米基因组中大约有25%的胞嘧啶被甲基化。在同种生物中D NA 甲基化的程度也不相同。以植物为例,植物中胞嘧啶发生甲基化的比例因植物种类而异,裸子植物比开花植物D NA 包含更少的甲基化胞嘧啶[2],高等植物D NA 的甲基化比例从4.6%~30.0%不等[4]。在同一物种不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段,基因组D NA 各CpG 位点甲基化状态也各不相同。玉米中编码胚乳特异性表达的B 2z ip 的O paque 2基因,启动子序列在叶片组织中(非表达组织)D NA 高度甲基化[5]。此外,在不同环境下以及植物特定基因及其启动子区域的甲基化分布也不同。 1.2 胞嘧啶甲基转移酶 在植物D NA 甲基化过程中,D NA 甲基转移酶起着非常重要的作用,它催化D NA 甲基化的完成。根据甲基化作用过程,可将植物细胞中的DN A 甲基转移酶分为结构和功能不同的3类[6],即M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶和结构域重排甲基转移酶。 1.2.1 M ET1甲基转移酶家族。该类甲基转移酶的主要功能可能是作为维持性甲基化酶,也可能在重新甲基化中起作用,现已在胡萝卜、豌豆、番茄和玉米中分离得到了M ET1及 安徽农业科学,Jo u rnal of Anh ui Agri.S ci.2009,37(12):5386-5389 责任编辑 孙红忠 责任校对 况玲玲
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 ４．重复序列 外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基
植物转基因沉默的机制及克服方法 专业：植物学学号：220100905010 姓名：潘婷 摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制 1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。 1 转基因沉默机制 转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。 1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制 1．1．1 甲基化作用从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。 1．1．2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA
至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。1．1．3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。 1．2 转录后水平基因沉默(PTGS)机制 1．2．1 RNA阈值模型 1994年Dougherty等提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。 1．2．2 异常RNA模型鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp 再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。 1．2．3 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程 张永强 （西南大学植物保护学院， 重庆 400716） 摘 要：病虫草害历来是植物保护工作的重中之重，农药为病虫草害防治立下了汗马功劳。近来由于大量使用、滥用农药给环境带来了巨大的负面影响。20世纪70年代兴起的基因工程为这一问题的解决带来了新的途径。本文就植物抗病基因分类、最新报道的相关基因；抗虫基因的来源、最新报道的抗虫基因及试验结果；抗除草剂基因以及基因工程技术在现代农业中的应用予以综述。 关键词：植物抗病；植物抗虫；抗除草剂；基因工程 农药伴随人类改造自然，征服自然已经有100多年的历史，在促进农业发展和对人类发展做出卓越贡献的同时，也不可避免的带来许多负面影响，如：对非靶标生物的毒害、对环境的污染、对生态系统的破坏以及病虫草抗药性的产生等。特别是化学农药对动物和人类健康的影响，已经成为全人类普遍关心和急需解决的全球性问题。诞生在20世纪70年代的基因工程技术为这些问题的解决提供了一条新的途径。进入20世纪90年代具有实用价值的转基因生物品种因其诸多的优势，逐渐被人们所接受，而迅速走向商品化和产业化。 1 植物抗病基因与基因工程 植物受病原菌侵染时，会诱导相关的基因产生一系列参与植物防御反应的拮抗物质，阻止病害的传播和病原菌的进一步侵入。将这些参与植物防御反应的相关基因导入植物，使其在植物体内表达，可以提高植物的抗病能力。植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生；另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择；同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化（庄军等，2004）。 1.1 植物抗病基因的分类 植物中许多抗病基因已被克隆，根据抗病蛋白（R蛋白）将抗病基因（R基因）分为以下几类。第一类，玉米抗圆斑病的基因Hml，其编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC 毒素，代表着抗病基因中与病原物亲和性因子作用的一类基因。 第二类，番茄抗细菌叶斑病的基因pto，其编码蛋白Pto是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。AvrPto 蛋白是病原菌假单胞杆菌Pseudomonas进入植物细胞中通过Ⅲ型分泌系统分泌的，现已证实Pto激酶噜噗结构域中204位苏氨酸决定着Pto对AvrPto的特异性识别。具有自动磷酸化能力的Pto激酶与AvrPto相互作用从而产生了过敏性反应。 第三类抗病基因所编码的蛋白显示出与细胞间信号转导蛋白具有结构相似性。这些蛋白所共有的基元是富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR），一般由24个氨基酸残基组成，其共同蛋白序列是LXXLXXLXXLXLXXNXLSGXIPXX（氨基酸的单字符号，X代表任何一种氨基酸）。这一类型基因的共同结构是LRR-TM，它们编码的蛋白包括胞外N端LRR 重复区、膜锚定蛋白和胞质内C末端部分（如图1所示）。 第四类是水稻抗白叶枯病Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo的基因xa27。这一基因所编码的Xa21蛋白具有3个受体激酶特征的主要结构域：胞外LRRs结构、跨膜结构域及胞内激
１转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种，是利用遗传工程的手段，有目的地将外源基因或ＤＮＡ构建导入植物基因组，通过外源基因的直接表达，或通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术，可最大限度地满足人类的需要［１］。 与此同时，转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度，对于这种急剧的生物物种变化，自然界能否容纳和承受？自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏？转基因植物及其产品被人们食用时，是否会向人体肠道微生物发生基因转移？是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响？要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序，积累足够的数据，根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全，对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产，对存在安全隐患的加以限制，避免危及人类生存及破坏生态环境［２］。因此，制定科学完善的安全性评价的原则与方法，对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 ２转基因农产品安全评价的内容 ２．１转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中；是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡［２］。 转基因植物演变为农田杂草的可能性：转基因植物可通过传粉进行基因转移，可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草，如果杂草获得了这些抗性，就会变成超级杂草，使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性：在自然生态条件下，有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交，从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转基因植物安全评价时应从两个方面考虑，一是转基因植物释放区是否存在近缘野生种，若没有，则基因漂移就不会发生。另一个可能是存在近缘野生种，基因可以从栽培植物转移到野生种中，这就要分析考虑基因转移后会有什么效果。 对自然生物类群的影响：在植物基因工程中所用的许多基因是与抗虫或抗病有关的，其直接作用的对象是生物。如转入ＢＴ杀虫基因的抗虫棉，其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等植物害虫，如大面积和长期种植抗虫棉，昆虫有可能对抗虫棉产生适应性或抗性，这会影响抗虫棉的应用和ＢＴ农药制剂的防虫效果。因此，在抗虫棉推广时一般要求种植一定比例的非抗虫棉，以延缓昆虫产生抗性。 ２．２转基因植物的食品安全性 转基因食品又称基因修饰食品（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｆｏｏｄ，ＧＭＦ），即用转基因生物制造或产生的食品。进行转基因食品安全评价时，应从宿主、载体、插入基因、重组ＤＮＡ、基因表达产物及其对食品营养成分的影响等方面来考虑［３］。主要内容有：转基因食品基因修饰导致的新基因产物的营养学评价、毒理学评价以及过敏效应。 ３转基因植物的安全评价方法 ３．１转基因植物安全性评价等级与原则 中国农业部在２００２年１月５日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》中，按照对人类、动植物、微生物和生态环境的潜在危险程度，由高到低的顺序将农业转基因生物分为４个安全等级（表１）［４］。 表１农业转基因生物安全等级的划分标准 在对农业转基因生物进行安全性评价时一般遵从以下几条原则：（１）促进而不是限制农业转基因生物的发 转基因植物的安全性评价 李茜 （南京农业大学，国家生命科学与技术人才培养基地，南京２１００９５） 摘要：简要论述了转基因植物安全性评价的意义、内容和方法。 关键词：转基因植物；安全性；评价。 安全等级潜在危险程度 Ⅰ尚不存在危险 Ⅱ具有低度危险 Ⅲ具有中度危险 Ⅳ具有高度危险 农业生物技术 ６２ －－ 中国农村小康科技２００８年第１期Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｉｎａｘｉａｏｋａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ地址：１０００２６北京市朝阳区麦子店街２０号农业部北办公区中国农学会
RNA干扰基因沉默 基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面，基因沉默是遗传修饰生物（genetically modified organisms）实用化和商品化的巨大障碍，另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance,RMVR）。
转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默。 转基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS）。TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止导致基因沉默，PTGS是指 RNAi——基因沉默指南 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成以染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。
转基因食品及其安全 摘要：转基因食品自从出现以来就一直备受争议，近日转基因水稻、玉米等作物获得农业部农业转基因生物安全管理办公室颁发的安全证书，这一事件更是加剧了群众对于转基因食品的质疑，转基因食品的安全性的疑问又被重新摆上台面。本文对转基因食品的来源、分类以及其安全性做了初步探讨，对于帮助了解转基因食品及转基因食品的安全性都具有一定的理论意义和现实意义。 关键词：转基因食品安全性 一、转基因食品的定义 所谓转基因食品，就是通过基因工程技术将一种或几种外源性基因转移到某种特定的生物体中，并使其有效地表达出相应的产物（多肽或蛋白质），此过程叫转基因。以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。根据转基因食品来源的不同可分为植物性转基因食品，动物性转基因食品和微生物性转基因食品。 转基因食品是具有一定的优点的，例如转基因食品可增加作物产量、降低生产成本；可增强作物抗虫害、抗病毒等的能力；提高农产品耐贮性；缩短作物开发的时间、摆脱四季供应、打破物种界限，不断培植新物种，生产出有利于人类健康的食品。 但是，即便转基因食品的优点非常多，其具有的一些缺点也是不容忽视的：所谓的增产是不受环境影响的情况下得出的，如果遇到雨雪的自然灾害，也有可能减产更厉害。许多转基因食品本身就能产生一定量的有毒物质和某些营养因子以抵抗细菌和害虫的入侵。现有转基因食品中的毒素含量并不一定会引起毒反应，当然如若处理不当，某些食品（如木薯）能引起严重的问题甚至可能引发死亡。 根据《农业转基因生物标识管理办法》规定，我国目前已有5类17种在售转基因生物被列入转基因标识目录并在市场上销售，这17类转基因生物包括：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花种子、番茄种子、鲜番茄、番茄酱。卫生部的《转
引起基因沉默的原因 研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。 1.染色体DNA水平的转基因沉默 发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。 按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。MAR可能使转基因在受体基因组整合
后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异 2.转录水平的基因沉默 发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。 （1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。然而,从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。而发生在DNA的CG和CNG序列上的甲基化并不是植物中转基因转录水平沉默起始的前提,但C碱基甲基化对维持基因沉默是必需的。 （2）多拷贝重复基因多拷贝重复基因序列整合进基因组后,无论正、反都容易形成异位配对,引起基因组防御系统的识别而被甲基化或异染色质化失活。 （3）染色体包装转导基因在染色体上的遗传位点相同,但受染色体包装的影响,产生沉默。当转导基因由染色体区域的正常位点包装到另一区域的位点时,其与转录因子的接触机会就会发
植物抗病基因研究进展 摘要：植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用。综述了植物抗病基因的克隆方法，结构特点，作用机制以及未来的发展前景。 关键词：R-基因；克隆方法；结构特点；作用机制 Advance on Plant Resistance Gene Research Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene. Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用。植物时刻受到周围各种潜在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。随之所产生的现象包括局部细胞坏死(过敏性细胞死亡)，木质素和胼胝质形成，以及所有与抑制病原菌生长和病害发生相关的抗菌物质产生。病原菌还有可能通过不同的途径赋予植物长期的系统抗性诱导系统免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。随着分子生物学的发展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用机制逐渐为人们所发现，也有更多的植物抗病基因的功能得到了证实。 1 R基因的克隆方法 1) 表型基因克隆法：利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来，从而分离特定的与表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就能直接分离该基因。 2) 转座子标签技术：转座子标签技术是比较经典的方法，是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部，基因发生突变而被标识，然后利用插入2个和小麦(Triticum aestivum)1 个(表1)[5]。 尽管R基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征，根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：
转基因植物及其安全性综述 一，摘要 介绍目前转基因植物概念、常用的植物转基因方法，就转基因植物的生态安全性进行讨论。 二，正文 转基因植物概念：将人工分离和修饰过的基因导人到生物体基因组中，由于导人基因的表达，引起生物体性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。转基因植物：通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体。在过去十多年来，植物学家们已成功地把具有各种新性状的基因转移到了50多种不同的植物上，为农作物育种创造了一个又一个的新品种。 ?每一个植物都有很多基因。基因的本质，就是我们常说的DNA(去氧核糖核酸)。一个基因，在DNA双螺旋结构中占据着一个限定长度的片段。所以要想从供体植物上获得某个决定遗传性状的基囡，只要我们能从供体植物的DNA结构中取出这个基因片段可以了。这个决定遗传性状的基因也称目的基因，将它转化或转移到受体植物上，使它整合到受体植物的染色体上重新组合并使其(目的基因)在再生植株中表达出来，这样就完成了目的基因的传导操作，达到了转基因植物的合成及改造植物性状的目的。 1983年，植物学家首次完成了将一个容易鉴别的抗卡那霉
素基因转移到烟草上的试验，其后代也具有抗卡那霉素的特征。这一开创性的研究成果，为开拓转基因植物的研究与应用展示了广阔的前景。 自此以后，在水稻，玉米，大豆、番茄，马铃薯，烟草，油菜等很多重要的农作物上又得到了转基因植物。如美国孟山都等公司把杀蠋菌的苏云金杆菌的毒素蛋白基因引入到棉花、烟草、番茄和马铃薯等植物上，产生了杀死吃这些作物的蠋幼虫的毒蛋白，培育出了抗虫的棉花，烟草新品种。将毒壳蛋白基因转入苜蓿、黄瓜，烟草等作物，它们可对致命的病毒产生抗性，从而获得了抗花叶病毒感染的抗病植株。 植物转基因方法大致分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前技术比较成熟的主要有花粉管通道法。 1.农杆茵介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，分根瘤农杆菌和发根农杆菌两种，其细胞中分别含有Ti质粒和Ri 质粒，其上有一段T-DNA，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，但近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是日益作为模式植物的水稻中也已经得到了广泛应用和认可，这是该领域