分子植物育种，2009年，第7卷，第4期，第839-844页Molecular Plant Breeding,2009,Vol.7,No.4,839-844
新思路、新技术、新方法
Novel Thinking &Technology
孝顺竹种胚愈伤组织悬浮培养条件优化
袁金玲1张朵1,2顾小平1*岳晋军1陈益泰1
1中国林业科学研究院亚热带林业研究所,富阳,311400;2河南农业大学林学院,郑州,450002*通讯作者,guxpzj@https://www.doczj.com/doc/0010687099.html,
摘要本研究利用孝顺竹种胚诱导出的淡黄色胚性愈伤组织为材料，对影响细胞悬浮培养的摇床转速、培
养液2,4-D 浓度、
继代天数、接种细胞浓度(W/V)等因素进行了研究。结果表明，悬浮培养时的摇床转速以120r/min 时培养效果较好，转速低于100r/min 时，愈伤组织容易结团，分散性差；适宜的2,4-D 浓度为4~6mg/L ，低于4mg/L 时愈伤组织易褐变；接种后培养7d 是最佳的转接时期，至多不能超过10d ；接种细胞密度以4.0%最为合适，可保持较高的增殖速度，同时培养产物较多。在50mL 培养液(NB +500mg/L Pro-line +500mg/L Glutamine +300mg/L Hydrolyzed casein +30mg/L Sucrose +4~6mg/L 2,4-D)中接种4.0%的愈伤
组织，于120r/min 的转速下经过7d 培养，
可增殖一倍以上，以后每7d 继代转接一次，培养大约一个月，便可以建立生长迅速、分散性好、均一的悬浮细胞系。关键词孝顺竹,愈伤组织,悬浮培养,转速,2,4-D
Suspension Culture Optimization of Seed Embryo Callus from Bambusa multiplex
Yuan Jinling 1Zhang Duo 1,2Gu Xiaoping 1*Yue Jinjun 1Chen Yitai 1
1Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang,311400;2College of Forestry,Henan Agricultural University,Zhengzhou,450002
*Corresponding author,guxpzj@https://www.doczj.com/doc/0010687099.html, DOI:10.3969/mpb.007.000839
Abstract Yellowish embryogenic callus induced from mature seed embryo of Bambusa multiplex was used as material.Rotation speed,concentration of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D),days of subculture,and inocu-lation cell density were optimized in this research.The results showed that a rotation speed of 120r/min was good,callus blocks cling at a rotation speed of less than 100r/min.The optimal 2,4-D concentration was 4~6mg/L for the suspension culture system,otherwise browning happened at a concentration of no more than 4mg/L.Subculture every 7days was best for suspension culture,at the longest of 10days.An inoculation density of 4.0%was effective for callus increase.Adding 4.0%callus into 50mL culture fluid (Wu's NB medium supplemented with 500mg/L Proline,500mg/L Glutamine,300mg/L Hydrolyzed casein,30g/L Sucrose and 4~6mg/L 2,4-D),suspension cul-tured at a rotation speed of 120r/min,the callus doubled at 7days,then subculture every 7days,a good suspension culture system could be established during one month.
Keywords Bambusa multiplex ,Callus,Suspension culture,Rotation speed,2,4-dichlorophenoxyacetic acid https://www.doczj.com/doc/0010687099.html,/doi/10.3969/mpb.007.000839
基金项目：本研究由浙江省重大科技专项重点项目和中国林科院亚热带林业研究所基本科研业务费（RISF6908）共同资助
细胞悬浮培养是植物离体培养的形式之一，即将根尖、幼茎、嫩叶、种胚等愈伤组织的植物细胞和细胞集聚体悬浮在液体培养基中在摇床上进行振荡培养。液体培养基中的营养成分较为均一且细胞与
其充分接触，因此细胞增殖状态相对一致，建成的悬
浮系细胞增殖速度快、重复性好，在基因遗传转化，原生质体的分离、培养与杂交，突变体筛选以及人工种子等方面有着广泛的应用，成为现代植物新品种
分子植物育种Molecular Plant Breeding
培育的有效工具之一，尤其可在水稻、小麦等禾本科单子叶植物以及农杆菌不能浸染的植物上体现出优势(贝丽霞,1998;方文娟等,2005;化青报等,2008)。
竹子是我国南方广泛分布的禾本科竹亚科林木树种，具有重要的社会、经济和生态价值。由于其无性繁殖容易且开花周期长，长期以来竹类植物的科学研究多集中于竹林的高效培育和竹材的加工技术方面，而在新品种培育相对滞后。国内外在竹子愈伤组织植株再生(Rao et al.,1985;Yeh and Chang,1986; Lin et al.,2004;Gillis et al.,2007)和细胞悬浮培养(吴益民等,2000;Shinjiro,2005)方面虽已有些文献报道，但尚未见进一步应用于新品种培育的技术实例。已见悬浮培养报导的竹种有孝顺竹(Bambusa multi-plex)、绿竹(Bambusa oldhami)、黄竹(Denrocalamus
membranaceus)和紫竹(Phyllostachys nigra)，其愈伤组织来源于笋尖、秆芽、根茎等营养器官，易出现褐变及再分化困难等现象，建立悬浮细胞系的时间较长。
本研究在建立孝顺竹种胚愈伤组织植株再生的基础上(袁金玲等,2009)，利用经筛选的种胚愈伤组织为材料，对悬浮培养的关键因子如转速、接种细胞浓度、培养液2,4-D浓度、转接时间等因素进行了优化，拟为进一步开展竹子生物技术育种工作奠定基础。1材料与方法
1.1材料
将灭菌后的孝顺竹种胚接种于愈伤组织诱导培养基，即NB+500mg/L Proline+500mg/L Glutamine+ 300mg/L Hydrolyzed casein+30mg/L Sucrose+8g/L Carrageenan+4mg/L2,4-D)，其中NB配方参照吴传银和陈英(1987)，30d后从产生的愈伤组织中挑选淡黄色、质地优良、色泽均一的胚性愈伤组织转接到液体培养基。
1.2基本培养基及培养条件
基本液体培养基：NB+500mg/L Proline+500mg/L Glutamine+300mg/L Hydrolyzed casein+30mg/L Su-crose+0.2~8.0mg/L2,4-D。用1mol/L KOH或者1mol/L HCl调节pH5.8，分装到容积为200mL三角烧瓶中，每瓶装50mL培养液，121℃下灭菌20min。非特别说明时接种细胞密度为4.0%，2,4-D浓度为4mg/L，26℃，黑暗培养，转速120r/min，每5d转接继代一次。
1.3培养液组分及培养条件设置
悬浮细胞系振荡培养的摇床转速分别设90r/min、100r/min、120r/min和140r/min4个水平，每水平4次重复，培养21d观察结果；液体培养基中2,4-D浓度
设0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L、6.0mg/L、7.0mg/L和8.0mg/L 共10个水平，4次重复，培养7d称重；培养时间：于基本培养基及基本培养条件下接种后振荡培养，逐日定时取出3瓶，分别称重，连续检测11d；接种细胞浓度(W/V)设0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%共12个水平，培养20d称重。继代培养时先将培养物摇匀，稍静置片刻，将上层培养液连同小的细胞团倒入另一无菌三角烧瓶中，待小细胞团沉入到瓶底部后，弃去上清液，加入新鲜培养基。
1.4处理与统计
愈伤组织鲜重量计算：初始接种鲜重量记为W
i
，
培养后鲜重量记为W
j
，增重量W=W
j
-W
i
，增殖倍数N=(W j-W i)/W i，相对增重量W%=(W j-W i)/W i×100%(i, j=1,2,3……n)。数据处理采用Excel、DPS软件。
2结果与分析
2.1转速对悬浮培养效果的影响
观察不同转速条件下愈伤组织的悬浮培养产物，发现在摇床转速为90r/min条件下，愈伤组织多数褐变死亡，培养液颜色深暗；当转速为100r/min 时，愈伤组织结成大块，有褐变趋势；在摇床转速增至120r/min及140r/min时，愈伤组织团块比较均匀，培养液相对清澈，无褐变发生或偶有个别褐变。分析原因认为：转速90r/min时悬浮体系通气不足，氧气供应困难，容易褐变死亡；100r/min转速条件的氧气供应有所改善，但培养液剪切力较小，不能及时将增殖的细胞团从初始细胞团上分离，从而导致结块，难以进一步培养。当摇床转速≥120r/min时，培养液氧气供应充足，液体剪切力增大，随着新生细胞团的增殖，结合不紧密的愈伤组织细胞逐渐脱落并分散在悬浮液中，形成较为均一的悬浮培养系。
刘春朝等(1998)研究认为适当的剪切力可以改善通气，使植物细胞保持良好的生长状态并能维持悬浮细胞系的分散性，但过高剪切力可使细胞受到机械损伤，甚至导致细胞丧失活性。本研究发现悬浮培养效果不仅受剪切力影响较大，而且与容器容积、培养液体积及接种细胞浓度相关，采用容积为200mL的三角烧瓶，培养液50mL，接种4.0%(2.0g)愈伤组织，在保证悬浮细胞均匀一致的前提下，为减少过高
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剪切力对细胞的机械损伤，应尽可能调低摇床速度，因此，确定120r/min 为本实验的最佳转速。2.22,4-D 浓度对愈伤组织增殖及外观状态的影响
不同2,4-D 浓度条件下孝顺竹种胚愈伤组织的增重及外观状态如表1所示。方差分析显示不同2,4-D 浓度间愈伤组织的增殖重量的F =13.78**，表明差异达极显著水平，进一步采用多重比较的结果列入表1。可以看出，
在不同2,4-D 条件下愈伤组织平均增重量为1.72~5.89g ，总变异幅度为1.39%~6.88%；
除0.5mg/L 水平有较大波动外，增殖重量表现为随着2,4-D 浓度的升高而提高，
表明2,4-D 浓度的提高对愈伤组织的增殖有促进作用，各处理水平内愈伤组织增重的变异系数为8.84%~29.71%，表明尽管初始接种的愈伤组织经过挑选，外观看来比较一致，但其细胞团内部仍有较大的不均一性。
对增殖的愈伤组织进行形态观察发现，在2,4-D
浓度低于3mg/L 时，愈伤组织增殖速度缓慢，分泌物较多，愈伤组织易变褐，培养液颜色变黄，随着继代次数的增加，逐渐丧失增殖能力；当2,4-D 浓度达到4~6mg/L 时，
增殖速度较快，愈伤组织黄白色，分泌物少，培养液颜色清亮，继代可保持稳定增殖速度；当2,4-D 浓度超过6mg/L 时，增殖速度加快，愈伤组织苍白，培养液容易变浑浊。因此，悬浮培养过程中2,4-D 的浓度应确定为4~6mg/L 。2.3培养时间对愈伤组织增殖的影响
孝顺竹种胚愈伤组织在不同培养时间下的增殖重量及相对增重结果如图1。可以看出，细胞重量增殖呈S 形曲线，
整个生长周期可分为缓慢生长期(第0~4天)、对数生长期(第4~7天)、生长停滞期(第7~11天)，最大增殖鲜重为2.58g ，
相当于接种量的229.0%。从相对增重曲线来看，接种后4d 内愈伤组织的相对增重较小，均≤11.30%，第5天相对增重达到最
表1不同2,4-D 浓度条件下愈伤组织的增重及外观状态
Table 1Callus proliferation and it's apparent feature under different 2,4-D concentration 2,4-D 浓度(mg/L)2,4-D concentration (mg/L)
8.07.06.05.04.03.00.52.01.00.2
均值Mean
5.89Aa 5.18ABab 4.84ABab 4.73ABCbc 3.69BCDcd 3.28CDde 2.41DEef 2.28DEef 2.19DEef 1.72Ef
变异幅度Variation range 4.32~6.883.98~6.324.28~5.424.22~5.542.20~5.122.20~4.202.00~2.901.49~2.651.94~2.681.39~2.20
变异系数(%)
Variation coefficient (%)17.5716.018.8410.3629.7126.8314.2120.6913.4617.84
外观状态Apparent feature
愈伤组织白色,培养液浑浊Callus white,fluid blurry 愈伤组织黄白色,培养液稍浑浊Callus yellowish,fluid slightly blurry 愈伤组织黄白色,培养液清亮Callus yellowish,fluid transparent 愈伤组织黄白色,培养液清亮Callus yellowish,fluid transparent 愈伤组织黄白色,培养液清亮Callus yellowish,fluid transparent 愈伤组织黄白色Callus yellowish 愈伤组织略褐变Callus slightly browning 愈伤组织黄白色Callus yellowish 愈伤组织略褐变Callus slightly browning 愈伤组织褐变Callus browning
注:数据后的大写和小写字母分别表示0.01水平和0.05水平差异显著
Note:Values followed by a different capital letter denote significant difference at 0.01probability level and those by a small letter at the 0.05probability level
愈伤组织增重(g)
Callus proliferation (g)孝顺竹种胚愈伤组织悬浮培养条件优化
Suspension Culture Optimization of Seed Embryo Callus from Bambusa multiplex
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大值32.79%，此后相对增重逐渐降低，第10天时出现负值，表明持续培养不转接愈伤组织增殖困难，逐渐变褐死亡。综合考虑增重量及相对增重，接种第5天是愈伤组织增重速度最快的时期，第7天是愈伤组织总增重最大的时期，因此适宜的转接时间应该是7d，此时转接可以较好地利用5d时最大的增殖速度和7d时最大的增殖量。
2.4接种细胞浓度对愈伤组织增殖的影响
图2为不同接种细胞浓度条件下愈伤组织增重量及增殖倍数的散点图。从增重量的点分布来看，在接种细胞浓度为0.2%~4.0%范围内，增重量随着接种细胞浓度的增加而增加，尤以在0.6%~4.0%的接种细胞浓度范围内增殖曲线的斜率最大，增殖速度最快；在接种细胞浓度为4.0%~8.0%范围内，愈伤组织的增重量呈现稳定或略为下降的趋势，以4.0%接种细胞浓度时的增重达最高值。从愈伤组织增重倍数的点分布可以看出，不同接种细胞浓度下愈伤组织的增殖倍数为1.04~8.35；在0.2%~1.0%接种细胞浓度范围内，愈伤组织的相对增重逐渐增大，至1.0%时达极大值，此后逐渐下降。
综合分析增重及相对增重的散点图发现，采用1.0%接种细胞浓度可以获得最大的增殖速度，但由于初始接种密度较小，最终得到的培养物密度也较小；采用4.0%接种细胞浓度不仅可以保持较快的增殖速度，并且增重量达到最大值。因此，确定最佳接种细胞浓度为4.0%。
3结论与讨论
经优化，孝顺竹种胚愈伤组织悬浮培养条件为，在容积为200mL三角瓶中装入50mL液体培养基，接种4.0%愈伤组织，于120r/min的转速下振荡培养；经过7d培养可增殖一倍以上，以后每7d转接一次，用筛孔80目(7.6滋m)无菌不锈钢网过筛，将直径大的细胞团过滤掉，剩下较为均一的细胞团，转接时去掉大颗粒和无用的细胞碎片和畸形细胞，经过约1个月的继代培养，建立生长迅速、分散性好、均一的悬浮细胞系，且无褐变发生，可以作为基因转化和细胞工程的受体。
邢登辉等(1994,生物学通报,29(4):1-3)在总结大量文献的基础上提出2,4-D是禾谷类作物愈伤组织诱导唯一不可缺少的激素，其适宜的浓度范围为0.5~5.0mg/L。如朱根发和余毓君(1995)在水稻愈伤组织诱导和悬浮培养阶段均使用2.0mg/L的2,4-D，王海波等(1996)在小麦悬浮细胞系的继代培养基中使用相同浓度的2,4-D。本试验也发现2,4-D 在孝顺竹种胚愈伤组织诱导和分化方面非常有效，但过低的浓度对竹子并不适宜，一般以4.0mg/L的浓度为好，否则容易褐变，这个浓度相对水稻、小麦等作物较高，可能是物种不同的原因所致。
适宜的继代周期是愈伤组织增殖质量的保证，试验跟踪检测了孝顺竹种胚愈伤组织在1~11d内的增殖情况，发现其增长曲线呈S形，在4~7d为快速增殖的对数生长期。李勇等(2007)利用桑树茎段愈伤组织悬浮培养建立的S形生长曲线中5~10d为快速生长期；胡海英等(2007)在香花槐叶片愈伤组织悬浮培养的S形生长曲线中发现3~9d为快速增长期，表明竹子和其它林木树种相似，尽管外植体来源不同，但悬浮体系中愈伤组织的生长曲线均呈S形，快速生长期一般在3~10d，从而为转接周期的确定提供了相应的参考依据。
图1愈伤组织增重量及相对增重随培养时间的变化曲线Figure1Change curve of relative weight and weight changes of callus along with culture time
图2不同接种细胞密度条件下增重量和增殖倍数散点图Figure2Scatter diagram of weight increase and increasing times of callus under different inoculation density https://www.doczj.com/doc/0010687099.html,
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起始细胞浓度对悬浮培养效果的影响已有较多的研究报道，并有接种量临界密度、培养液浊度、以及接种浓度与生长周期和增殖倍数相关性等方面的探讨(方文娟等,2005)。就孝顺竹种胚愈伤组织而言，在50mL培养液中接种4.0%愈伤组织培养效果最好，而陈琰(2005)对小麦悬浮培养时接种浓度的优化结果表明以3.75%最佳，李明军等(2008)对怀牛膝悬浮培养的接种浓度筛选后确定3.0%为好，虽然物种不同，但悬浮体系中初始接种浓度则差别不大。
与多数每年开花结实的林木树种不同，竹子采用传统技术开展遗传改良受其自身开花周期长、花期不确定、开花不遇等特性的限制较大，而现代生物技术育种对生殖生长的依赖性相对较低，并具周期短、目标明确等优点，理应成为竹类育种的发展方向。在全球一千多种木本竹子中，我国有自然分布的竹种占到近50%，因此，加强基础研究、特别是悬浮细胞培养及体细胞胚胎发生体系的优化和完善，提高再生效率，开展转基因、原生质体融合等生物技术措施培育竹子新品种将为竹子的可持续发展提供保障，彰显竹子在人类生活中的价值和贡献。
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