蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)
1 原理
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备
2.1 分析天平：精度0.0001g
2.2 恒温水浴：精度±0.2℃
2.3 计时表
2.4 分光光度计
2.5 沸水浴器
2.6 振荡混合器
2.7 pH计: 精度0.01pH单位
3 试剂和溶液
3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠（Na
2HPO
3
.12H
2
O）6.02和磷酸二氢钠（NaH
2
PO
3
.2H
2
O）
0.5g,加水定容至1000ml
3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶
甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：
准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：
准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml
3.6 0.5mol/L的NaOH：
准确称取2g NaOH溶解并定至100ml
3.7 10.00mg/ml酪素溶液
称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液
3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.
3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至
100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.
3.9 酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。
4 分析步骤
4.1 标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制。
试管号0 1 2 3 4 5
取 100 μ g/ml 酪氨溶液（ ml ） 0 1 2 3 4 5 蒸馏水（ ml ）10 9 8 7 6 5 酪氨酸实际浓度（μ g/ml ）0 10 20 30 40 50
4.2 分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠
溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
4.3 样品测定：
4.3.1 先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min
4.3.2 取4支试管，各加入1ml酶液
4.3.3 取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入
1ml酪素，摇匀，40℃保温10min
4.3.4 取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪
素。
4.3.5 静置10min，过滤沉淀
4.3.5 各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的 Na
2CO
3
5ml、福林试剂1ml。
在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。
注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。
5. 计算
5.1 酶活定义：
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。
5.2 计算酶的活性单位依据以下公式
蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值
K：吸光常数
4：反应试剂的总体积
10：酶解反应时间
n：酶液稀释总倍数
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
蛋白酶活性测定方法 一蛋白酶活力单位定义 1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。 二测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 三应用范围 本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 四测定条件 4.1 底物：酪蛋白 4.2 pH： 3.00 4.3 温度： 40℃±0.5℃ 4.4 保温时间： 10min 五仪器 5.1 紫外分光光度计 5.2 超级恒温水浴40±0.2℃ 5.3 秒表 5.4 分析天平：感量0.0001g 六试剂和溶液 6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB 601配制。 6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L 按GB 601配制。 6.1.6 缓冲溶液 a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。 b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 6.1.7 l0 g/L酪素溶液 称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。 6.1.8 l00μg/mL L-酪氨酸4)标准溶液
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 分别取上述溶液各3.00ml，各加碳酸钠溶液（4.3）15.00ml、福林试剂使用溶液（4.2）3.00ml，
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4．2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5．pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度
蛋白酶酶活测定方法 一、实验原理： 一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。 一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。 二、试剂配制： A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0） 试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。 底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。 三、操作步骤： 1. 试样 1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用 2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min 3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止 4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。 2.空白 1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min 2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min 3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
2020年测定蛋白酶活力实验 （课件） 测定蛋白酶活力实验 一、实验目的?１.加深了解酶活力的概念.?2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理?酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力. 三、仪器和试剂?仪器：?恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。?原料?枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分
钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.?试剂?1. Folin－酚试剂：?在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.?２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液?4．0。5５mol/L 碳 10%三氯乙酸溶液酸钠溶液?5 . 6. ０．0２mol／LpＨ7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH 7.５磷酸缓冲液，可长期 7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。? （50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。
分光光度法测定蛋白 酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na 2CO 3 ）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl 3 COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O） 0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。
实验四蛋白酶活力的测定 一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理； 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。 本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。 三、实验试剂 ①微生物蛋白酶萃取液（ml）：称取酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数； ②L磷酸盐缓冲液（）； ③1%酪蛋白溶液：取酪蛋白，加100ml L磷酸盐缓冲液（），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； ④5%三氯醋酸（TCA）溶液。 四、实验步骤 1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入酶液，在B1和B0试管中各吸入酶液，分别用L磷酸盐缓冲液定容至。在
A0和B0试管中各吸入%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。 3、在各试管中吸入 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入%三氯醋酸溶液。 4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。 5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。 五、计算 1、在规定的实验条件下，以每分钟增加吸光度定义为一个酶单位。 2、每克酶制剂中酶活力的计算： ?A ×1000 / (t ×w) 酶活力单位/克酶制剂 式中，?A——样品与空白吸光度差值（即A1和B1的吸光值）；t ——酶作用时间（本实验为10min）；w——反应中酶的用量，g 六、说明 1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。 2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持较长时间的稳定性。 七、思考题 1、蛋白酶有哪几类 2、影响酶活力的因素有哪些 3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题 六、数据记录与处理 A1 = B1 = 酶含量为 ml 酶活力1 = ?A × 1000 / (t × w) = ×1000/10/=×105酶活力单位/克酶制剂
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE 酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品 的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋 白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。 2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液. 3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。 表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序 试剂步骤1：空白调零步骤2：样品测定 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL 250C预热5min 250C预热5min 胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10 μL 蒸馏水10 μL 0 μL 充分摇匀充分摇匀 步骤1：?A253 nm/min 调0 ----------- 步骤2：?A253-nm/min -------------- 记录 在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5μL -20μL之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。
测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器:
恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 原料 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。 试剂 1. Folin-酚试剂： 在2L 磨口 回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. L 氢氧化钠溶液
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
2013/05/13 紫外分光光度法测蛋白酶酶活 1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 2、试剂和溶液 三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。 2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。 2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
. 实验四蛋白酶活力的测定 一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理； 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。 三、实验试剂 ①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数； ②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）； ③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； ④5%三氯醋酸（TCA）溶液。 四、实验步骤 1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。 1 / 4 . （准确计时）10min37℃下保温3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在三氯醋酸溶液。试管中吸入6.00ml5%后，再向A1和B1，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保1h4、将试管从水浴中取出，在室温下放置留滤出液。滤液的吸光和B1和B0滤液为空白，测定A15、在280nm波长下，分别以A0 度。 五、计算0.001吸光度定义为一个酶单位。1、在规定的实验条件下，以每分钟增加2、每克酶制剂中酶活力的计算：克酶制剂酶活力单位/×1000 / (t ×w) A ?酶作用t ——和B1的吸光值）；A1 式中，?A——样品与空白吸光度差值（即g w——反应中酶的用量，时间（本实验为10min）； 六、说明范围表现出活力，但是在接近中性条、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH 1 件下最有最高活力。℃以下可保持较长时间的稳定性。2、微生物蛋白酶在45
精品文档 蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009） 1 原理 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林 - 酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。 2 仪器和设备 2.1 分析天平：精度 0.0001g 2.2 恒温水浴：精度土 0.2 C 2.3 计时表 2.4 分光光度计 2.5 沸水浴器 2.6 振荡混合器 2.7 pH计：精度0.01pH单位 3 试剂和溶液 3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（ 80%-90%）1 0 .6g, 加水溶解并定容至 1000ml。 乙液：称取乳酸钠（70% 16g,加水溶解并定容至1000ml. 使用溶液：取甲液 8ml, 加乙液 1ml, 摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。 3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（ NaH2PO3.2H2O） 0.5g, 加水定容至1000ml 3.3 硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠 19.08g, 加水溶解并定容至 1000ml。 乙液：称取氢氧化钠 4.0g, 加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液：取甲液500ml, 加乙液 400ml, 摇匀，用水稀释至 1L。 3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液： 准确称取无水碳酸钠 42.4g, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml. 3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液： 准确称取 65.4 三氯醋酸, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml 3.6 0.5mol/L 的 NaOH： 准确称取2g NaOH溶解并定至100ml 3.7 10.00mg/ml 酪素溶液 称取酪素 1.000g, 准确至 0.001g, 用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴）润湿,, 加入适量的各适宜的缓冲液约 80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中 , 用适宜的缓冲液稀释至刻度 , 此溶液在冰箱内贮存 , 有效期为三天 . 3.8 100卩g/ml酪氨酸标准溶液 3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐
中华人民共和国专业标准 蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)4 2.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃管号 试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━