第1课时工具酶的发现和基因工程的诞生
1．基因工程的概念
基因工程是狭义的。广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在中表达。其核心是构建分子。3．基因工程的技术保障
限制性核酸内切酶、和的发现与应用，为基因工程的创建提供了技术上的保障。
遗传工程遗传物质细胞受体细胞重组DNA
二、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是能够和DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。
2．来源
主要从生物中分离，如细菌。
3．作用
能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。如：某种限制性核酸内切酶能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切断DNA，
4．作用特点
具有专一性，一般每种限制性核酸内切酶只识别种特定的核苷酸序列。5．结果
形成末端。
识别和切割原核磷酸二酯键一粘性
三、DNA连接酶
1．概念
DNA连接酶是将具有末端的2个DNA片段连接在一起，形成分子的酶。
2．功能
缝合DNA片段。在基因工程中，可以将和DNA连接在一起。3．作用特点
两种来源不同的DNA用的限制性核酸内切酶切割，形成的粘性末端。DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间的形成，将两
DNA末端的缝隙“缝合”起来。如图：
碱基互补重组DNA 外源基因载体相同相同
磷酸二酯键
四、质粒
(1)概念：质粒是能够的双链环状分子，它在细菌中以独立于之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质。
(2)作用：质粒是基因工程中最常用的载体，可将基因送入细胞。
自主复制DNA 拟核外源基因宿主细胞
第2课时基因工程的原理和技术
1．基本原理
让人们感兴趣的基因(即基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。
2．变异类型。
1．获得目的基因
①如果目的基因的序列是已知的，可用合成目的基因，
或者用(PCR)扩增目的基因。
②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以从中获取。2．形成重组DNA分子
(1)一般用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA(如质粒)，形成。
(2)用将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子，目的基因) 基因重组化学方法聚合酶链式反应基因文库同一种相同的粘性末端DNA连接酶
3．将重组DNA分子导入受体细胞
(1)常用受体细胞：、枯草杆菌、和动植物细胞等。
(2)导入方法举例：用质粒作为载体，宿主细胞应该选择，
用处理大肠杆菌，增加其细胞壁的，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。
4.筛选含有目的基因的受体细胞
(1)筛选原因：不是所有细胞都接纳了。
(2)筛选方法举例：若质粒上有四环素的抗性基因，含有这种重组质粒的受体细胞就能够在有的培养基中生长，否则不能生长，这样就筛选到含有重组DNA分子的受体细胞。具体如下图：
5．目的基因的表达
目的基因在细胞中表达，产生人们需要的功能物质，如人胰岛素原。1．转基因植物
(1)传统育种方法的不足：培育新品种所需时间，而且亲本难以杂交。
(3)培育成功的转基因农作物：抗除草剂的，抗植物病毒的，抗害虫的，耐贮存的等。2．基因治疗
(1)概念：基因治疗是向中引入正常功能的，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。
三、基因工程与生态环境保护
1．利用基因工程技术开发具有生物可的新型塑料，以替代不可降解的化学合成塑料。
2．利用基因工程技术，对能够分解石油的进行了改造，大大提高了其分解石油的能力。
3．利用转基因微生物吸收环境中的、降解有毒化合物和处理工业废水。
大肠杆菌酵母菌大肠杆菌氯化钙通透性
重组DNA 四环素宿主细胞较长远缘转基因烟草转基因番茄转基因棉转基因番茄目标细胞
基因降解细菌重金属
第4课时植物的克隆
1．植物细胞的全能性
(2)原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套，都有发育成为完整个体所需的全部基因。
(3)在生物体内细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织或器官，这是基因在特定的时间和空间条件下的结果。
2．植物组织培养
(1)一般程序：配制培养基→获取的植物组织→组织培养，获得→诱导新植株形成。
(2)过程：离体的植物器官、组织或细胞――→脱分化愈伤组织――→再分化胚状体(或根、芽)→
幼苗――→移入大田成熟植株。
遗传物质 选择性表达 半固体 消毒 愈伤组织
二、植物克隆的成就
1．细胞培养
(1)过程：单个植物细胞经过培养基中成分的诱导，依次发育成细胞团、 、心形胚和 ，最后再生出完整的植株。
(2)细胞培养的诱导方法：主要通过平衡的植物激素配比进行调控。例如，适量的激动素和细胞分裂素配比可以诱导 的分化；适量的吲哚乙酸(IAA)及适当减除其他植物激素，则可以诱导 。
2．器官培养
在植物器官培养方面，雌性 的培养成果显著，例如子房的培养、胚囊的培养均已取得进展。
3．原生质体培养和植物细胞工程
(1)植物原生质体的获得方法：在0.5～0.6 mol/L 的 溶液环境(较高渗透压)下用 混合液处理根尖、叶片愈伤组织或悬浮培养细胞，将 消化除去。获得球形的原生质体。
(2)植物细胞工程的概念和操作过程：培养植物细胞(包括原生质体)，借助基因工程方法，将外源遗传物质(DNA)导入受体细胞(包括原生质体)中，或通过细胞 融合、 等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。
4．多途径的植物克隆实践
胚状体 芽 生根 花器官 甘露醇 纤维素酶和果胶酶 细胞壁 显微注射 次生代谢产物 单倍体 有益性状 抗盐或抗病 抗赖氨酸类似物
第5课时动物的克隆
1．动物克隆的技术基础
动物克隆的技术基础是。
2．动物细胞培养
(2)原代培养和传代培养
将动物组织通过或方法分散成细胞后进行的初次培养，称为原代培养。初次培养的细胞生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，影响细胞的生长，因此需要重新用等处理，进行分瓶扩大培养，称为传代培养。
动物的细胞和组织培养。酶或机械方法单个胰蛋白酶生长细胞培养原基整个分化
3．动物组织培养
(1)概念：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或特性。
(2)结果：由于细胞的运动、变化和培养物的组织成分发生变化，长期的培养结果最终成了简单的。
(3)在广义的组培中还包括器官培养，即器官的、器官的一部分或器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及能力。
4．细胞系和细胞株
(1)细胞系：可的细胞。原代培养物在首次传代时就成为细胞系，能连续培养下去的细胞系称为细胞系，不能连续培养下去的细胞系
称为细胞系。二倍体细胞通常为有限细胞系。连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系，大多数具有。有的连续细胞系是，具有异体致瘤性；有的连续细胞系获得了不死性，但保留现象，不致癌。
(2)细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的
具有的细胞称为细胞株。细胞株一般具有恒定的、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。可以连续多次传代的细胞株称为连续细胞株，可传代次数有限的细胞株称为细胞株。
5．克隆培养法(或细胞克隆)
(1)概念：把一个从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。
(2)结果：由于来源于一个共同的祖细胞，所以称为，也就是克隆。
(3)提高细胞克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加(胎牛血清最好)、以细胞支持生长、(胰岛素等)刺激、使用CO2培养箱、调节等。
连续传代连续有限异倍体核型恶性细胞系接触
抑制特殊性质染色体组型有限单细胞纯系血清滋养细胞激素pH
二、动物的细胞融合技术及其应用
1．细胞融合与细胞杂交
②原理：。
③诱导融合的方法
a．物理方法和化学方法：电激法、等。
b．生物方法：(如仙台病毒)。
(2)细胞杂交
①概念：的细胞间的融合就是细胞杂交。
②过程
③应用：由于细胞杂交中染色体容易丢失，利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物(蛋白质)减少的对应关系可以进行。
2．杂交瘤技术和单克隆抗体的制备
①用外界刺激动物，使其发生免疫反应，使产生抗体。
②利用或聚乙二醇等作介导，使经免疫的动物的脾细胞与可以无限传代的融合。
③经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生、又能增殖的杂交瘤细胞克隆。
(2)杂交瘤技术制备单克隆抗体的最大优点：可以从特异抗原成分的抗原混合物中提取单抗。
(3)单抗的运用：可作为，研究相应抗原蛋白的、细胞学分布及其功能。
细胞膜的流动性聚乙二醇灭活的病毒基因型不同基因定位抗原B淋巴细胞仙台病毒骨髓瘤细胞特异抗体无限增殖比例极少特异探针结构
三、动物的克隆繁殖
1．动物细胞全能性的表现程度
(1)在动物发育过程中，细胞的发育潜能逐渐。
3．动物体细胞克隆
原理和主要技术：利用的全能性进行，将动物的一个细胞核移入一个已经去掉细胞核的中，使其重组并发育成为一个新的胚
胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体(克隆动物)。
变窄细胞核核移植卵母细胞
第6课时从受精卵谈起
1．含义：成熟的精卵融合成为的过程。
2．过程：→精子附着于卵膜→精卵质膜融合。
3．同种动物精卵结合的原因之一：同种动物精子、卵细胞表面有相互
识别的。
受精卵精卵识别特异性蛋白
二、胚胎发育的过程
1．胚胎发育的概念
受精卵发育为的过程。2．胚胎发育的过程
→→原肠胚期→组织、器官的形成→幼体。
(1)卵裂期：受精卵不断进行即卵裂，卵裂产生的细胞团叫卵裂球，随着卵裂球数目的增多，细胞逐渐。当卵裂球含有2～8个细胞时，其中的每一个细胞都具有。
(2)囊胚期：具有囊胚腔、滋养层、内细胞团(如图)。
①囊胚腔：囊胚中间的空腔，是由于卵裂球的细胞继续分裂，细胞间出现的间隙。
②滋养层
a．存在部位：外表的一层扁平细胞。
b．作用：进一步发育
为，如胚盘。
③内细胞团
a．存在部位：内部的细胞团。
b．作用：不断增殖分化，将发育成完整的胚胎。
c．特点：是细胞，是一种的细胞，具有，能分化出成体动物的所有组织和器官。
(3)原肠胚期
原肠胚期是囊胚进一步发育形成的具有原肠腔、、胚孔的胚胎时期。
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
第二章基因工程工具酶 第—节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA聚合酶 第四节末端脱氧核苷酸转移酶 第五节核酸酶 第六节核酸外切酶 第七节碱性磷酸酶 第八节T4噬菌体多核苷酸激酶 第—节限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、 8bp的 4.2 识别序列结构：回文对称 4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶 4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能 4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割 4.6 星号活性(star activity) （1）星活性产生的原因 （2）抑制星星活性的条件(措施) 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 5.1 标准酶解体系的建立 5.2 酶切反应的基本步骤 5.3 终止反应常用方法：
（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它 5.4 多酶联合酶解策略： （1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 （2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法 5.5 DNA分子酶切常用缓冲液 5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解 5.7 内切酶酶解反应中的注意事项 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 6.1. DNA的纯度 6.2 DNA的甲基化程度 6.3 酶切消化反应温度 6.4 缓冲液(Buffer) 6.5 DNA分子的构型 6.6 反应时间 6.7 酶量使用 第二节DNA连接酶 1、DNA连接酶的发现 2、概念及其特点 3、DNA连接酶的种类 ?大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。 ?T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。 ?T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。 4、DNA连接酶的反应体系
1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。 二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
基因工程基因操作过程中的工具酶 09生物工程（2）班0902012010 摘要：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。 关键词：基因工程工具酶聚合酶连接酶内切酶 正文：一、基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 二、限制性核酸内切酶及其应用 （一）限制性核酸内切酶的发现 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB 甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。 最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K 菌株，Eco B和Eco K，是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae 的Rd菌株中Hin d II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 （二）限制性核酸内切酶的分类 分为I型、II型和III型。
基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS ）,便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一） 质粒的生物学特性 （1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 （少数为线形和 RNA ） DNA 分 子。 广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。 在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。 大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子）、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （2） 质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。 （ 3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （4） 质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型： 严紧型"质粒（stigent plasmid ），拷贝数为1-3 ；松弛型"质粒（relaxed plasmid ） ,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。 （5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 载体 质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹ 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。 （ 7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， （二） 质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解 细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。 1. 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。 在pH 值12.0?12.5范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变 性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。 2. 碱变性法提取质粒的步骤： 而目的基因本身无法进行复 “载体 ”及其“寄主细 胞
基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 限制性核酸内切酶 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 防御机制: 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制 人：免疫系统 细菌：限制与修饰系统 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 限制酶(restriction enzyme) 修饰酶(modifying enzyme) 核酸酶切位点： 既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）， 也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键
1）核酸限制性内切酶的类型 2）核酸限制性内切酶的基本特性 3）同裂酶和同尾酶 4）核酸限制性内切酶的命名法 5）影响核酸限制性内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶的类型及特性 按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因 如：Eco B、Eco K等 第二类(II型)限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序） 并在该顺序内的固定位置上切割双链 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的 回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同 切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段 限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链
第二章基因工程中常见的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。§2-1核酸内切限制酶 定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。 核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图) 一、限制修饰系统的种类( 图) 二、限制性内切酶的定义、命名 1.定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。 2.命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、菌系编号、分离顺 序。 例如: Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae, ”ｄ” 表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichiacoli RI
Hin dⅢ—Haemophilusinfluensae dⅢ Sac I(II)—Streptomycesachromagenes I(Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分 子。——远距离定点切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程 中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合 物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点: ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序 列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接 相正确; ——单链切割部位 ③因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链
第二章基因工程的载体和工具酶 【教学时数】9小时 【教学目录与学时分配】 2.1 载体（6） 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.1.4 穿梭载体与表达载体 2.2 工具酶（3） 2.2.1 限制性内切核酸酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶 【教学目的】 让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。 【教学重点】 常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。 【教学难点】 基因工程载体的结构和使用 【教学方式】 多媒体讲解结合启发讨论式教学 第一节载体 一、质粒载体（3） 【教学重点】 质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程 【教学难点】 质粒的结构 【教学过程与内容】 载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。 作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。 2.1.1 质粒载体 质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。 质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制
基因工程常用的工具酶 常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系 生物制药0911 刁亚军学号:2009423134 引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。 限制性内切酶 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 限制性内切酶的由来 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组
限制性核酸内切酶 成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。 类型 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶