利用噬菌体展示技术筛选
白介素4受体特异性结合小肽
任红霞
摘要: 噬菌体展示是一种九十年代以来发展起来的对于蛋白质功能研究非常有用的技术工具在生命科学
的多个研究领域如肿瘤治疗新药开发和疫苗制造等均有广泛应用白介素4interleukin 4, IL-4是
一个多功能的细胞因子在调控免疫应答的过程中起到关键的作用IL-4 发挥其生理功能需要依赖与白介
素4受体复合物interleukin 4 receptor, IL-4R结合,及其下游信号级联式放大在本研究中由人外周血
单核细胞来源的总mRNA反转录出白介素4受体链cDNA,将其胞外段在大肠杆菌体系中表达将纯化后
的蛋白作为靶蛋白利用噬菌体表面展示技术得到与其特异性结合的小肽可进一步用于未来体内和体外
的研究
Abstract: Phage display is a very useful tool for the functional study in very diverse scientific areas, such as drug screen. Interleukin 4 (IL-4) is a pleiotropic cytokine which plays a critical role in the shaping immune responses. Its effects depend upon binding to and signaling through a receptor complex consisting of the IL-4R chain and the common gamma chain (c), resulting in a series of
phosphorylation events mediated by receptor-associated kinase. In this study, the cDNA of the IL-4R chain extracellular domain is obtained by RT-PCR from the
peripheral blood mononuleate cells (PBMCs). After it is expressed in E.coli., the protein is purified by metal chelate affinity chromatography. A random peptide library displays on bacteriophage M13 was used to screen against the purified protein, and peptide motif was emerged after 3 rounds of panning. This successful example proved that it is possible to identify receptor agonists/antagonists through the screens of phage display libraries, and thus can be used on further in vitro or in vivo studies.
关键词噬菌体展示 phage display 白介素4受体Interleukin 4 Receptor 哮喘 asthma
前言
(1) 噬菌体展示 phage display
近来基因组和蛋白质组数据的大量丰富使我们能够在更加坚实可靠的基础上去设计和发现新的生物分子应用于制药农业工业及环境等多个领域因此基因工程和理性设计必将会对未来的生活造成更加深刻的影响但是理性的设计不是唯一的选择与之相对的还有筛选策略要达到筛选的目的就需要有足够大的库容以囊括理论上所有的可能个体还应具备有效的方法发现与靶标结合的配体基于此约十年前许多不同的高通量筛选技术发展起来相对于传统的基于理性的遗传工程这些
技术被称为反求遗传工程reverse genetic engineering而在这场反求遗传工程
的浪潮中噬菌体展示以其特有的广泛应用前景脱颖而出
1985年George P. Smith 首次提出将噬菌体表面应用于分离单克隆抗体1此后
噬菌体展示技术迅速发展被应用于肿瘤治疗新药开发疫苗制造等方面2不同
的展示系统被构建如菌体表面展示多聚体展示等3简言之噬菌体展示即把肽段或蛋白以融合的形式表达在噬菌体的衣壳蛋白上结果是这些肽段蛋白被展示在噬
菌体粒子表面同时编码这些融合蛋白的DNA驻留在噬菌体内部噬菌体表面展示提供了大量肽段表型与基因型间的物理联系可以快速鉴定筛选出特定靶分子如抗体酶细胞表面受体等的特异性配体体外筛选成为panning, 过程如下将一定量展示有肽段的噬菌体与固定有靶分子的板或球珠共育洗脱没有结合能力以及非特异性结合的噬菌体最终用酸碱洗脱特异结合的噬菌体再经过扩增重复上述循环即可富集噬菌体库中有特异结合能力的个体循环完成后通过对单克隆测序确定一致性序列随机肽段噬菌体展示可以用于确定表位确定蛋白之间的相互作用鉴定酶的底物或抑制物鉴定受体激活物或拮抗剂
2白介素4白介素4受体Interleukin 4, Interleukin 4 Receptor
白介素4IL-4是CD4+ T 细胞亚群B细胞肥大细胞等分泌的多效性细胞
因子在调节T细胞分化调控免疫球蛋白亚型的转换过程中发挥重要作用在抗原刺激下IL-4诱使幼稚T细胞发展成为能产生IL-4及其它一系列细胞因子如IL-5IL-10
IL-13的细胞同时强烈抑制产生IFN的CD4+ T细胞的产生4,5调控免疫球蛋
白亚型的转换过程是IL-4的第二个重要生理功能IL-4促使人B细胞转化为分泌IgE 和IgG46IL-4和IL-4R基因剔除小鼠比正常小鼠产生IgE的能力下降一百多倍7-9
IL-4的生理功能决定了其在调节过敏性反应中的重要作用IL-4可增强IgE的合成IgE 含量升高则介导I型超敏反应导致多种疾病包括哮喘的发生10
IL-4生物活性的发挥是通过与细胞表面IL-4R结合既而激活胞质内多种非受体型蛋白质酪氨酸激酶PTK进一步启动信号传导途径包括PI3K途径IRS-1/2
Ras-MAPK途径和Jak-STAT途径4介导的信号转导途径4与受体结合后,
4与链二聚化激活,细胞内底物磷酸化,从而触发信号级联式放大
4及链均不具有内源性激酶活性,因而4需要受体相关激酶作为信
号转导的始动因子,其中酪氨酸激酶在其过程中发挥着重要作用激酶家族
包括12和3,1与4链连接,而3与链连
接当4与受体链结合后,1和3的酪氨酸发生磷酸化作用,4
自身亦出现酪氨酸磷酸化,进而与下游的信号蛋白通过2或磷酸化酪氨酸结合
区相互作用究竟哪种激酶真正催化4及受体停靠蛋白磷酸化,尚待进一步研
究11
人IL-4R hIL- 4R基因定位于16p11.2-12.1与IL-4的多种生物功能相对应IL-4R 广泛分布在造血细胞内皮细胞上表皮细胞肌肉成纤维细胞肝细胞和脑组织平均每个细胞有100至5000个受体分子表达-4有两型,型由链构成,
亚基与-4高度亲和,链与-4和- 4复合物结合尽管链只能中度增
加-4对- 4的亲和力,但它是-4信号转导途径必不可少的成分之一型
-4含有-13-13和-43种亚基前二者的作用与链
相似-4属于促红细胞生成素受体超家族,由胞外区跨膜区和胞内区组成其
胞外区含有型纤连素区保守的成对半胱氨酸残基及近膜区的序列,后者与
受体构象优化有关4的胞外区(4)呈型,含两个共价结合区:1
区(191位氨基酸残基)和2区(97197位氨基酸残基),序列位于2区,折
叠成由7个反向平行的片层构成的三明治结构游离型4含4个螺旋束,分别命
名为和,4与4在螺旋面呈11结合,形成嵌合结构
(12)IL-4R胞外段结构的改变可能导致受体传导信号的能力的改变人IL-4R链的一个突变Ile50Val已经从特异体质个体中分离出来该突变能增强信号传导从而导致IgE 的产量增加(13)缺失跨膜部分和胞内部分的IL-4R可与膜上的IL-4R竞争结合IL-4R 目前已有将可溶的重组IL-4R用做IL-4R的拮抗剂治疗哮喘且在临床初期显示了良
好的效果14小分子多肽经气道可直达肺部由于分子量小更易扩散不易被免
疫系统识别所以小分子多肽比可溶性抗体更适合作为拮抗剂治疗哮喘
材料与方法
一材料
菌株
(1)大肠杆菌菌株Top10F’{lacI q Tn10(Tet R)}mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80lac Z M15
lacX74deoRrecA1araD139(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nup 克隆转化用菌株(2)大肠杆菌菌株BL21-Condonplus(DE3)-RP E.coli B.F-ompT hsdS(r-m B-)dcm+Tet r gal(DE3)
EndAHte[argUproLCam r] 表达用菌株
{3} 大肠杆菌菌株F lacI q⊿(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn10(Tet R)/fhuA2 supE thi ⊿(lac-proAB) ⊿(hsdMS-mcrB)5 (r-k-m-k McrBC-). 宿主菌
(4)而二硫键限制的七肽噬菌体展示库购自Biolabs 公司
2质粒
(1) pBlueScriptIIKS+用于基因片段的克隆,购自生工公司
2pET-30a(+)质粒用于E. coli表达购自Novagen公司(如图 2)
3化学试剂
各种限制性内切酶连接酶修饰酶及其他工具酶购自Boechringer Manneheim
TAKARA及华美公司SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳SDS-PAGE所用药品及分子量Mark 购自BIO-RAD公司引物-96gIII sequencing primer包含在Ph.D.-C7CTM Phage Display Peptide Library Kit TRIZOL购自BioBasic Inc.Cananda. BcaBEST RNA PCR Kit 购自
TaKaRa.其他试剂均为分析纯
4培养基略
二.方法
1人mRNA的抽提
采集人的血样用常规方法提取白细胞然后按以下流程收获细胞1~5*106移入1.5ml的Eppendorf管中加TRIZOL试剂1 ml混匀置室温5 min加氯仿0.2 ml摇振15秒置室温3 min41000 r/min离心10 min吸取上层水相移至另一Eppendorf
管中加0.5 ml异丙醇室温10 min 4 1000 r/min离心10 min70% 乙醇0.5 ml
摇振充分洗涤 4 1000 r/min,离心5 min弃上清真空干燥加无RNase水25 μl
置-20 备用
2RT-PCR
A:RT
1PCR反应管中调制反应液:
(2)反转录反应
B PCR
(1) PCR反应管中调制反应液引物见表
表PCR引物
引物序列克隆位点Sense GAA TTC CCC ACC AAT TGC AGC AC EcoRI
Anti-sense GGT ACC GAG GTG CTG CTC GAA G SalI
(2) 把(1)的反应液加入到A步骤反转录反应结束后的反应管中轻轻混合.
(3) 按以下条件进行PCR反应
3.DNA序列测定:
DNA序列测定工作由上海联合基因生物公司完成
4.PCR产物克隆
PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方法进行分析鉴定正确后克隆到载体pBlueScriptIIKS+上酶切PCR及测序鉴定其正确性
DNA片段回收采用玻璃粉法质粒抽提采用碱法大肠杆菌转化采用氯化钙法具体步骤参照分子克隆(15)
5. 大肠杆菌表达质粒的构建及IL-4R在大肠杆菌中的表达:
pBlueScriptIIKS+- IL-4R及pET-30a(+)以EcoRI & SalI酶切后连接转化, 抽提质粒pET-30a(+)-IL-4R鉴定正确后转化到BL21-Condonplus(DE3)-RP中
6.免疫印迹法(Western Blot Analysis) 检测IL-4R在大肠杆菌中的表达:
完成12%不连续SDS-PAGE蛋白电泳(具体步骤参见分子克隆)
7.发酵,纯化
具体步骤参见分子克隆
8.噬菌体展示
1噬菌体扩增略
2检测效价
取E.coli. ER2738单克隆接种于2 ml LB100 μl /ml Tc37 250 r/min振荡培养过夜次日以1% 接种量转接于2ml LB培养基37 250 r/min振荡培养至O.D.
600值为0.5备用将溶解的Agarose Top分装为3ml/试管置于45水浴保温37预
热LB/IPTG/Xgal平板梯度稀释噬菌体分别取10ul与100ul宿主菌混合室温静置1-5min与Top Agarose混合铺平板冷却5min倒置37培养过夜次日计数计算
pfu
3纯化的蛋白样品0.5ml与100ul1得到的噬菌体TBS溶液2*1011 phage 混合于室温静置30min镊离子缓冲溶液与树脂混合1lm TBST洗涤4次离心去上清结合了镊离子的树脂与蛋白噬菌体混合物混合室温静置15-30min偶尔搅动离心去上清用1ml TBST洗10次用1ml噬菌体洗脱酸性溶液悬浮树脂室温静置10min
离心1min取上清加150ul Tris碱性溶液中和取10ul 梯度稀释测效价
4扩增噬菌体
1重复1-4循环2次
2取合适的稀释度的平板保证每板噬菌体斑在100个以下选单克隆分别扩增
编号待用扩增过程中保留菌体抽RF DNA, 以被测序之用
9. 应用SPR surface plasmon resonance分析
纯化后的蛋白与扩增的噬菌体单克隆溶液共同在TBS体系中透析应用SPR仪逐个分析蛋白与噬菌体克隆的结合情况
10. DNA序列测定
选取SPR结果有强烈响应的噬菌体单克隆测序DNA序列测定工作由上海联合基因生
物公司完成
结果
一IL-4R链胞外段cDNA的克隆及表达质粒构建
按方法1 - 4所叙述的方法PCR扩增得到基因片段该片段以相应的酶切位点克隆到载体上对克隆的质粒进行酶切和测序鉴定数据略结果确认了PCR扩增产物为IL-4R 链胞外段基因连接表达载体与PCR扩增产物的酶切片段得pET-30a(+)-IL-4R表达质粒其正确性通过酶切和PCR得到确认
二IL-4R链胞外段cDNA在大肠杆菌中的表达
CaCl 2法转化表达质粒pET-30a(+)-IL-4R到BL21-Condonplus(DE3)-RP表达结果如下图所示
a b c
a. 含pET-30a(+)-IL-4R的E.coli全细胞蛋白
b.含pET-30a(+)的E.coli全细胞蛋白
c.标准蛋白
Marker箭头所示即为表达的目的蛋白
2表达产物的Western blot检测
按方法6所叙述步骤操作结果下图所示
d a b c
a. 含pET-30a(+)的E.coli全细胞蛋白
b.包涵体
c.含pET-30a(+)-IL-4R的E.coli全细胞
蛋白 d. 标准蛋白Marker箭头所示即为表达的目的蛋白
3.纯化结果
纯化且透析后蛋白定量为25ng/ml
左图为2M Urea洗涤后包涵体右图为经镊柱纯化且透析后的蛋白
3.噬菌体展示
取0.5-1.0ul primary phage library扩增测效价为2x1010plaques/10ul如方法8所述筛选每轮效价分别为106 plaques/10ul107 plaques/10ul108 plaques/10ul
筛选结束后随机取克隆17个进行SPR检测背景为由primary phage library随机选取三个单克隆
3.SPR 结果
1- 17号样品为第3
轮筛选结束后选取的单克隆检测结果18-20为随机挑取原噬菌体库中单克隆SPR 测试结果作为前者的背景
phage 加入phage 前的步长读数 加入phage 后的步长读数
差值
1 78500 79500 1000
2 79100 79550 450
3 79200 80000 800
4 78050 79500 1450
5 78100 79250 1150
6 77750 78600 850
7 77750 78600 850 8 77740 78400 660 9 77100 77400 300 10 77200 77900 700 11 81800 83500 1700 12 81900 83250 1350 13 81750 82200 450 14 82000 82800 800 15 82300 82500 200 16 82250 82500 250 17 82000 82500 500 18 83800 83850 50
19 83750 83900 150
20 83700 83800 100
20 83700 83800 100
4.选51112号克隆测序序列略
以上三序列比对所示为三个随机7肽段的序列
将三个7肽段的氨基酸序列比对结果如下
positives 6 indentity12.5%
consensus sequence: MMMRL
讨论
多种载体可用于将肽段展示在M13噬菌体表面最常用于插入融合肽的展示位点是噬菌体外壳蛋白pIII和pVIII的N末端16-17pIII在噬菌体粒子中有5个拷贝是M13噬菌体5种衣壳蛋白中最长的蛋白全序列含406个氨基酸Smith第一个证实pIII的N端可插入外源多肽而不影响噬菌体的生理功能且pIII突出于噬菌体表面是表达融合肽的理想位置与pIII不同的是pVIII仅含50个氨基酸在M13噬菌体中有约2800个拷贝其N 末端的5个氨基酸短片段暴露与外部pVIII上可融合表达的肽段较短一般为6-8个氨基酸的大小而pIII上可以融合表达多至38个氨基酸长度的肽段由于pIII 与pVIII的拷贝数不同导致当融合肽表达于pVIII时低亲合力的噬菌体粒子将在筛选中有明显的优势
即当采用pIII为载体时更易通过较少的循环获得高亲合力的肽段基序在本研究中进行3轮筛选即获得可能基序而有报导采用pVIII为融合肽载体筛选5轮才获得基序pIII在噬
菌体最初侵染细菌中起作用即噬菌体与E.coli.的作用发生在pIII的N末端和细菌纤毛TolA内膜蛋白之间所以pIII融合表达可能影响噬菌体侵染效率的降低在筛选过程中如果有野生型噬菌体的混入将导致野生型噬菌体逐渐占多数致使筛选失败本研究中采用pIII融合表达体系噬菌体由常用克隆载体M13mp19衍生而来由于含lacZ基因当培养基中有IPTG和Xgal存在是噬菌斑显蓝色可以很好的区别与野生型噬菌体为提高筛选效率可以考虑以下因素对因素的影响优化实验方案
表面活性剂 在结合和洗脱缓冲溶液中表面活性剂起到降低非噬菌体和靶分子之间特异性结合的作用随循环数的增加逐渐升高表面活性剂的浓度可以提高噬菌体结合的特异性如三个循环中分别为0.10.30.5%
温度 筛选的严格性可以由温度的升高或降低控制
结合及洗脱时间 可以通过缩短结合时间延长洗脱时间来提高筛选的严格性但是考虑到
噬菌体的侵染能力用酸性洗脱溶液洗脱的时间不应超过10min
靶分子浓度 液相筛选时靶分子浓度降低导致筛选严格性的提高最初靶分子浓度为10
nm随循环数的增加最终浓度降为1 nm
循环数 在保证每轮循环起始加入噬菌体量不变的前提下增加循环数可以提高高亲合力
噬菌体个体在总体中占的比例
噬菌体表面展示在筛选细胞表面受体激活剂或拮抗剂方面有广阔的前景已有成功的例子报导仅通过以结构为基础的理性设计某些高效拮抗剂和激活剂很难被设计出来考虑到大部分配体受体之间的相互作用是蛋白之间的作用一些与靶分子结合的肽段与已知配体同
源但另一些是完全崭新的配体如果不是已筛选出来这种亲和性很难被预测出来例如
EPO erythropoietin的激活剂与其对应的天然激素几乎完全不相似18
目前已有靶分子筛选到了与之结合的一致性序列consensus sequence如链霉亲合素
伴刀豆球蛋白白介素1受体促红细胞生成素等最近噬菌体表面展示系统已经用于更复杂的靶分子筛选肽段如人病毒活细胞及鼠组织和肿瘤19-20
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致 谢
本文是在黄伟达教授和钱志康老师的悉心指导和关怀下完成的在本论文的完成过程中黄伟达教授和钱志康老师广博的知识严谨的治学态度敏锐的科学洞察力
脚踏实地的工作作风不仅对我的科研工
作而且对我的为人亦产生了巨大的影响令我受益匪浅
感谢李政道博士及其亲属捐赠设立的秦惠君与李政道中国大学生见习进修基金