第十六章法医DNA分析技术
第一节概论
1985年英国遗传学家Alec Jeffreys建立了DNA指纹技术，并成功的应用于一起移民案涉及的亲子鉴定，开辟了法医物证DNA分析的新纪元，实现了法医物证鉴定从否定、排除到认定的飞跃。法医DNA技术在短短的十几年里得到了飞速的发展和广泛的应用。特别是在2000年全国公安系统开展打击拐卖妇女儿童专项斗争中，应用DNA分析技术进行了大量的亲子鉴定。辨明了被拐儿童的身份，使他们回到了亲生父母的身边和亲人团聚，从而使广大公安政法人员及人民群众认识到法医DNA分析技术的重要作用。
一，法医DNA分析研究的内容。
法医DNA分析是应用现代DNA分析技术，分析DNA遗传标记在群体中的分布与传递规律。确定分析样品的一致性与遗传关系，为侦察破案和司法审判提供证据的一门科学技术。他涉及遗传学，分子遗传学，群体遗传学，生物化学，分子生物学和计算机学等多门学科的交叉和综合应用。
脱氧核糖核酸简称DNA(deoxyribonucpeic acid )是存在于细胞中的遗传物质。它包含了机体发育和功能所必需的全部信息。除同卵双生外，每个人的DNA碱基(A、T、C、G)序列均不相同，是独一无二的。这些DNA序列上的差异有的在个人特征如眼睛、发色、肤色等表现出来，更多的是不表现在个人的生理外观特征上，必需用实验室特殊技术才能测定出来。法医DNA分析就是应用特殊的实验技术研究个体间的DNA差异及其遗传规律，而服务于侦察破案和司法审判。(
自1985年DNA指纹诞生以来，经过十几年的发展，法医DNA分析已建立了DNA指纹技术，PCR扩增片段长度多态性分析技术和线粒体DNA测序等三大主要技术，并在此基础上发展了一些新的技术方法如MVR——PCR、PCR——SSOP、SSP——PCR等共同形成了法医DNA分析技术。
二，法医DNA分析的对象
法医DNA分析的案件中主要涉及人体各种体液斑、组织、毛发及表皮脱落细胞等。但是在某些案件中已涉及到动物、植物及犯罪现场土壤中微生物的DNA分析。
三，法医DNA分析的任务。
法医DNA分析的主要任务是个人识别和亲子鉴定，由于DNA遗传标记的高识别率，Y染色体遗传标记呈父系遗传，线粒体DNA呈母系遗传，从而使亲子鉴定由过去一般遗传标记亲子鉴定的有限范围得到较大的扩大，可以进行隔代、几代甚至多代的亲子关系鉴定。
四，法医DNA分析的应用范围。
法医DNA分析应用于所有涉及有细胞的生物物证的案件中。(1)凶杀、性犯罪、恶性械斗。
(2)犯罪现场无意中留下的指纹、毛发、唾液(烟头、口香糖、面罩盗窃案使用的面罩等)。(3)碎尸案尸源鉴定。(4)空难或突然性事件中尸源认定。交通事故中尸源及带有可疑血痕，组织，毛发等肇事车的认定。(5)拐卖儿童、离婚、移民、入户、寻亲、遗产继承、计划生育超生及医院错抱婴儿的亲子鉴定。(6)器官移植，医疗纠纷中的个人识别与亲子鉴定等。
五，法医DNA分析的特点。
DNA遗传标记与传统的蛋白遗传标记相比有以下特点。(1)遗传标记多，信息量大。(2)标记的遗传类型全，常染色体遗传标记按孟德尔规律遗传，Y染色体的遗传标记呈父系遗传，线粒体DNA呈母系遗传。(3)可分析的物证种类多，存在广泛。凡是含有细胞的生物物证均能进行DNA分析。(4)DNA在自然环境中具有较高的稳定性。保存几十年的血痕，精斑可进行DNA 分析。(5)同一个体物证具有比对的通用性。DNA遗传标记具有个体组织的同一性，可以用同一个体的任何组织或体液均能得到该个体相同全部遗传信息。因此进行比对和鉴定，不必采用相同的组织。(6)方法灵敏，检材用量少。以PCR技术为基础的分析方法只需ng级DNA就可获得检验结果。(7)自动化程度高，速度快。(8)可以建立数据库，进行查档对比，检索破案。
六，法医DNA发展简史与进展
(一)法医DNA发展简史
1944年，Oswald Avery证实了细胞成分DNA(脱氧核糖核酶deoxyriibonucleic Acid)为遗传
特征从上代向下一代传递的载体。1953年，James Watson和Francis Crick阐明了DNA分子结构为双螺旋结构。1980年，David Bostein和同事首先发现在遗传水平上人群间存在小的差异，用RFLP技术检测这种差异。1984年，Alec Jeffreys在调查疾病的DNA遗传标记时，发现了DNA指纹图(DNA fingerprint)。1985年，首次进行一起移民涉及的亲子鉴定，1986年首次应用于二起强奸杀人案。1985年，Kary Mullis发明了多聚酶链反应(polymerase chain Reaction，简称为PCR)，同时4色荧光自动测序问世。1990年，PCR技术在法医学应用，第一个用PCR分析的遗传标记为HLADQα。1990年，Jeffreys报道小卫星D1S8基因座串联重复单位内部存在差异，1991年报道用；MVR—PCR分析小卫星可变重复序列。1991年，荧光标记复合扩增分析STR基因座和应用Chelex—100方法提取DNA。1992年，开始报道用毛细管电泳分析STR 结果。1993年，第一个商业STR试剂盒面世，PCR同步扩增Amelogenin基因座进行性别鉴定。1996年，多色荧光标记STR试剂盒向世，开始报道用MALDI—TOF分析STR扩增产物和线粒体DNA基因芯片。1997年，开始大量报道Y—STR基因座。1998年，2 000个SNP杂交芯片闻世。1999年，Y—STR得到比较广泛的研究、应用。2001年，人类基因组计划框架初步完成。
(二)国内外进展
DNA指纹技术问世后受到了各国司法、警察和法庭科学界的高度重视，各国广泛研究和采用DNA技术进行办案。欧洲各国初期广泛采用的主要是DNA纹印系统，北美除DNA纹印系统外，开发和应用了HLADQa和Polymarker等系统，现在世界各国广泛使用的是复合STR系统，并进行DNA的直接测序分析(主要用于mtDNA)。
我国于1986年开始法医DNA分析技术应用研究，1988年有研究成果报道，1989年正式应用于实际案件鉴定。研究和应用的法医DNA分析主要有DNA指纹(3′HVR—α—珠蛋白探针，Myo探针等)、小卫星(VNTR)扩增片段长度多态性(D1S80，APOB等)、微卫星(STR—PCR)复合扩增、数字编码小卫星系统、线粒体DNA测序、DNA的性别鉴定。等等。现在广泛使用的是复合STR系统和DNA的直接测序分析(主要用于mtDNA)。
20世纪末的微制造技术解放了集成电路工业，加快了计算机的速度和运行能力。同样微制造技术使DNA分析中的样品制备和一些分析步骤微型化，设计一些仪器可以在犯罪现场进行生物物证的分析，使DNA分析比传统实验室分析得更快、成本更低。目前在研究开发的主要有以下三个微型化DNA分析仪器：微芯片毛细管电泳装置(microchip capillary electrophoresis device)、微型热循环仪(miniature thermal cycler)和杂交阵列(hybridization array)。未来的法医DNA分析发展方向是微型化、智能化、网络化与全自动化，从DNA分析的结果中获得更多的个体信息。
第二节检材的提取、保存与送检
DNA分析检材的提取、保存与送检原则与一般物证检验相同下面介绍常见检材的的提取、保存与送检方法。
一、常见检材的提取与保存
(一)血液和血斑
1．新鲜血液(1)新鲜血液由医务人员用无菌一次性的注射抽取1-5ml静脉血液，加入EDTA二钠盐或枸缘酸钠抗凝放入试管中，充分混匀，加封。或者将抽取的血液直接涂抹在无菌纱布或干净滤纸上，晾干制成血痕，也可采集末梢血制成1 cm 2以上的血痕。如果要进行DNA 指纹分析，以液体血液送检为最佳。(2)每个试管应标明日期、时间、嫌疑人的姓名、地点、采血员的姓名、采集的数量、案件名称编号和物证编号。(3)血液样品应置于4℃冰箱保存，制成血斑的，则在室温晾干，并应尽快送检。
2．现场的液体血(1)液体血应该使用干净的(最好是灭菌的)注射器或一次性吸管，将其吸至洁的(最好是灭菌的)试管内。(2)凝血块可以使用清洁的药匙将其移至清洁的试管内。(3)可以使用清洁的纱布吸取液体血或凝血块制成血痕，在包装和送往实验室前应晾干(禁止阳光直射)。
(4)标明样品案件名称编号、物证编号、日期、时间、采集物证的位置，以及物证采集员的姓名。
3．冰雪上和水中的液体血(1) 冰雪上和水中发现的血液应立即提取，以免被进一步稀释。
(2)将那些最浓的样品尽可能地搜集到清洁、适合的容器内；采集时应尽可能避免杂质污染。
4．衣服上的未干血斑(1)将带有未干血斑的衣服放在一个清洁的表面晾干(避免阳光直射)，不能用电吹风等热力加速干燥(2) 晾干后用干净的纸包装起来或装入纸袋内。(3)禁止抖动带血斑的衣服，以防引起血痂的脱落。
5．物品上的未干血斑(1)带有未干血斑的小件物品应晾干后整件收集并包装。(2)对于不宜从现场移出的大件物品存在的未干血斑，将其转移到干净的棉纱布上晾干后装入纸袋内。
6．大的或不可移动物品上的干血斑，如墙壁或混凝土上的干血斑(1)对血斑的形状必须做记录、照相并且画图。(2) 用蒸馏水湿润清洁的纱布或拭子将血斑样品擦拭转移下来或将血斑直接刮到一张清洁的纸上；或用高粘质胶带将每一个斑点从其所在的物体表面上粘下来；或用一个小吸管吸少量蒸馏水置于斑痕上，反复吸排多次，将斑点从物体上洗下来，然后将样品吸到一个清洁的试管内。(3)转移到纱布或拭子的血要晾干，再将其放在专门的纸袋。(4)每一件物证都要收集没有斑痕的部分，作为“基质对照”送验
7．可以切割的物体，如地毯或室内装潢材料上的干血斑(1)详细记录、照相斑点情况。
(2)用一个清洁的刃器将带有血斑部分的物证材料切割下来。(3)对每个切割下来的物证都应该分别包装和标记。
8．小的飞溅的血点常常很难从物体的表面上转移下来。在做了适当的记录以后，可以用胶带或湿润的消毒棉纱线将样品提取下来，应避免从周围区域提取污染物。
9．交通肇事案件中汽车上的血斑(1)全面检查汽车的外表面，确定有无毛发、组织、血液、以及其他的痕迹物证。所有的检查发现都要一一记录。发现血斑用湿纱布转移提取血斑，然后晾干包装。(2)如需要进行指纹显现，宜用对DNA检验无害的显现方法，如铝粉法显现指纹。否则应在显现指纹前提取血斑。
10．尸体上的血斑(1)尸体上的血斑在提取前应仔细记录。(2)应注意血斑的位置；大小、数量、形状和类型。(3)由于尸体上血斑易于脱落，因此在移走尸体以前将血斑提取下来。(4)在收集尸体上的血斑时，为了减少附带尸体本身的皮肤细胞，应尽可能轻轻地将斑点取下。如使用湿纱布轻轻地擦拭斑痕。(5)指甲下的血斑应该使用清洁的牙签刮下。用清洁的指甲剪将指甲剪下并收集起来。尽量不要带死者本人的血液和组织。每个指甲和牙签均应分开包装。
（二）精液和精斑
1．现场上发现的液体精液物证(1)精液物证应该照相、录像和画图记录。(2)用一个清洁的注射器或一次性吸管将液体精液吸至一个灭菌的试管内保存在冰箱内。(3)也可将液体精液吸取到干净的纱布或棉球上。然后晾干、包装、加封和标记。
2．可移动物体上精斑(1)裤子、衣服、床单、枕头、纸张，以及其他可移动物体上的精斑整件进行收集。(2)如果物品上的斑痕是湿的，在收集包装以前必须将其彻底晾干。(3)每一件物证都必须单独包装，并做好标记。
3．可以切割的大的物体上的精斑(1)大的物体，如地毯、床垫、室内装潢材料上的可疑精斑可以将其切割下来。(2)分别包装并做好记录。
4．不可移动的、非吸湿性物体表面上的精斑(1)不可移动的具有非吸湿性表面的物体，如地板、柜台、金属表面的样品等。(2)提取精斑前必须做好采证记录。(3)用干净的解剖刀将精斑刮到干净纸上，然后将其折叠包起来。也可以用胶带粘下来或用棉球拭子将斑痕擦拭下来晾干。
(4)分别包装并标记。
5．从性犯罪案件受害者身上提取精液(1)性犯罪案件受害者的物证的采集应在医院、门诊室进行。(2)根据被强暴案情，用无菌纱布或棉球擦拭阴道、口腔(口交案例)和肛门(鸡奸)。纱布或棉球的面积千万不要过大，否则因擦拭物面积过大，精液斑不集中，影响下一步检验。提取的擦拭物要晾干保存。
(三)组织、器官和骨骼
1．新鲜组织、器官和骨骼(1)每件物证都要采用各种方法进行描述，包括笔录、照相或录像做采证记录。(2)每个物证都要使用一个清洁的器械进行收集。所使用的镊子在使用之中，要彻底地进行清洗。对腐败尸体，要取深层肌肉或肋软骨。放在一个清洁的可固定的容器内。
(3)密封后，做好标记并放冰箱冷冻保存。
2．陈旧组织、器官和骨骼(1)在收集前应该对每个物证进行拍照和画图。详细记录大小、
形状、类型及其和其它物证相互之间的空间关系。(2)每个物证都应使用清洁的镊子提取。对仍然连在一起的物证应该一块儿提取。收集时不应将其分开。(3)骨骼尽量提取长骨，而且不要人为地将长骨切成两截。否则，骨内DNA容易被污染。
(四)唾液、尿液和其他体液
1．液体样品(1)液体的唾液或尿应尽快装入一个清洁的消毒的容器内(试管或烧杯)。(2)每个容器上都要加封并做好标记冷藏保存。
2．斑迹(1)唾液斑、尿斑和其他体液斑可以整件物证收集，也可以将其从载体上刮下或剪切下，予以收集。(2)物证必须彻底干燥并且放入纸袋内。刮削物和剪切物应收集在一张清洁的纸上并折叠包好。然后再将其放人第二个纸包装袋内，加封并做好标记。
(五)毛发
(1)用清洁的镊子夹取毛发。(2)不在一起的毛发应分别搜集、包装，做好标记。(3)在收集过程中必须小心操作，不要损坏可能存有的毛根组织。(4)与血液、组织、或其他体液混合存在的毛发，提取时应小心处理。每个物证都要单独包装，并做好标记。(5)如果毛发与体液混在一起，应晾干后包装送检。
(六)强奸致孕案件的检材
受害人被强奸致孕，如果已人工引产，可用干净无菌的手术刀切开胎儿颅骨，用干净无菌的药勺或滴管取引产胎儿脑组织，放人干净试管或烧杯内，或取胎儿肌肉，登记受害人姓名、采集时间、地点和采集人等，密封，冷冻保存，送检。如未人工流产(怀孕3个以内)可在医院采集绒毛。如要人工流产，一定在流产前告知医院妇科彻底清洗吸引器，不能留有其他人的组织，而且吸引时不能将胚胎弄得太碎，以免分不清是胚胎还是母体组织。
二、检材的送检
提取的检材要尽快送往实验室进行检验。在送检现场提取检材的同时，采集与案件有关人员的样品并一同送检。有关人员的样品一般均采集其血液，或制成血痕，血液采集方法同前。在送往实验室的过程中也要注意避免检材DNA发生降解，为此在送检过程中要尽量避免检材经受高温、高湿、日光照射以及过长的运输时间，鲜血要求放在冰壶中送检。不同案件需要收集的有关人员样本如下。
1．现场物证为精斑的案件：要求采集受害人、有关犯罪嫌疑人的血液(痕)；如果精斑的载体上有可能留有其他人的精斑如受害人丈夫等，必须采集他们的血液(痕)一同送检。
2．强奸致孕的亲子鉴定案件：采集受害人血液、受害人所怀胎儿组织或绒毛(未人工流产)与有关嫌疑人血液。
3．确定身源的亲子鉴定案件：除现场检材外，还需采集嫌疑父母血液、或妻儿(或丈夫和孩子)，如因某种原因不能采集到其嫌疑父母血液、或妻儿(或丈夫和孩子)样品，可采集嫌疑人的同胞血液，并尽可能多地采集所有同胞血液，或同一父系的或同一母系的亲属血液送检。
4．个体识别类的案件：现场检材以及比对样品，如嫌疑人、受害人血等。
第三节检材的DNA提取
DNA存在于细胞内，在进行DNA检验前，需将DNA从细胞中提取出来将其与细胞其他成份分开。现场提取的检材如血痕、精斑等常留于各种载体上也需将其分开。目前DNA提取常用方法有(1)有机提取法(经典的饱和酚-氯仿法) (2)Chelex-100提取法(3)无机提取法(4)其他提取方法如磁性珠提取法、硅珠提取法、碱裂解法等。
一、常见检材的DNA提取
(一)有机提取法提取各类检材DNA
1．血液(1)3ml EDTA—抗凝血，加入等体积裂解液，剧烈振荡，使细胞裂解，溶液呈透亮状。(2)3 000-5 000r／min离心15min，去掉上清液，收集沉淀，用3ml生理盐水洗净沉淀，3 000-5 000r／min下离心15min，收集沉淀，如果此时沉淀仍带有红色，再反复用生理盐水洗沉淀，直至沉淀呈无色。(3)加入1.5mlEDTA—Na2提取液，悬浮沉淀，并反复吹打，使沉淀分散开来。(4)加入1／10体积10％SDS，使其最终浓度为1％混匀。(5)加入1／20体积2mg／ml PK (最终浓度100μg／ml)，混匀，封口，置于37℃保温4h。(6)向溶液加入等体积的饱和酚，以上下反复颠倒试管混匀液体，将试管内溶液混合成乳状液。3 000～5 000r／min下离心
5min，此时溶液分成三层，DNA在无色的上层水相中，中间白色混浊层为变性蛋白质。最下层带褐或黄色的是酚。(7)转移上层水相到一干净试管中。为增加DNA回收量，可以在有机相中加入等体积TE溶液(pH7．8)，充分混匀后，离心，吸取上层水相，与第一次抽提的水相合并。(8)加入1／2体积的饱和酚和1／2体积的氯仿—异戊醇（24：1），混匀。3000—5000r／min离心5min。如果水相层和有机层的界面不甚清楚，说明其中含蛋白质较高，可采用多次酚／氯仿抽提，并可适当加大离心速度和或延长离心时间。(9)转移上层水相到另一干净试管中，加入等体积的氯仿—异戊醇混匀，3 000-5 000r／min离心5min。(10)转移上层水相到另一干净管中，加入1／10体积的3mol／LNaCl轻轻混匀，加入2．5倍溶液体积的冰冷(-20℃保存的)无水乙醇，混匀，沉淀DNA。(11)10000r／min离心5min，收集沉淀，用70％乙醇洗去DNA 中的盐，5 000r／min离心5min，除去液体，真空抽干DNA 5min，使DNA成无色透明状。(12)加适量(50—100u1)TE缓冲液溶解DNA，溶解后的DNA溶液于4℃保存。
2．血斑(1)将血斑剪碎，加入适量TNE浸泡底物，TNE的体积以底物全部浸湿，底物表面还保留1-2mm左右高度的TNE溶液层为宜，加入1／10体积的10％SDS和1／20体积的PK(2mg／m1)使终浓度分别为1％和100ug／ml，37℃保温3小时。(2)用套管法离心(5 000r／min离心5min)除去载体底物。也可以不用除去载体，直接加酚抽提。(3)收集溶液，用酚—氯仿抽提，以下步骤同血液(6) —(12)。
3．精液与精斑(1)取0．5ml精液加入等体积生理盐水，洗涤2-3次，3 000r／min离心5min，收集沉淀物，加入精子DNA提取液和蛋白酶K(终浓度为100ug／m1)混匀，于37℃水浴保温消化3h。DNA提取及溶解过程同血液(6) —(12)。(2)从精斑中提取DNA ：方法基本同血斑将消化血斑用TNE改为精子提取液。
4．从精液和阴道分泌液混合斑中提取精子DNA（差异消化法）(1)精子检查：取少许检材经染色，于显微镜下观察，确认精子的存在。(2)将带有精子的检材剪碎，装入1．5ml离心管中，加lml TNE于37℃浸泡30rain。然后加入1／10体积的10％SDS至终浓度为1％，加蛋白酶K至终浓度40μg／ml，于37℃保温2h消化上皮细胞。对于那些需要对女性阴道上皮细胞进行鉴定的检材，加TNE后先在37~C保温1-2h，通过离心收集细胞，使女性上皮细胞和精子等细胞先与载体分离开来，此时不要加SDS和PK。然后在收集的细胞中加SDS和PK进行分步提取。(3)将消化后的混合物用套管法离心去载体，3 000-5 000r／min离心15rain，收集流出液中的沉淀物。(4)用TNE洗沉淀物，3 000—5000r／min离心15min，重复此步骤一次，收集沉淀物。(5)向沉淀物中加入精子提取液和蛋白酶K，终体积为300μl，PK终浓度为100ug ／m1，于37℃水浴中消化3h。(6)DNA抽提步骤同血液DNA提取(6)—(12)。
5．人体有核细胞组织取组织约0.1g，用生理盐水洗净附着的血液后将检材剪碎，加入DNA提取缓冲液，用匀浆器研磨，再加入蛋白酶K(终浓度200μg／m1)和1／10体积的10％SDS，于37℃消化3h。随后DNA提取步骤同血液(6)—(12)。
6．唾液(斑) 同血液(斑)。
(二) Chelex—100法提取微量检材DNA
1．血液 (1)取lO—50μlEDTA抗凝血加到0．5ml离心管中，再加入500μl灭菌蒸馏水,剧烈振荡，室温下放置15min。(2)13 000r／min下离心3min去上清液，收集沉淀，反复用无菌蒸馏水洗净白细胞沉淀物，直至无色或血色素很少。 (3)加入200μl 5％Chelex-100溶液，置56℃保温30—60min，振荡8s，100℃保温8min后，剧烈振荡8s，10000r／min下离心3min，上清液可用于PCR反应或者4℃保存。
2．血斑 (1)取0.2—0.5cm2的血痕放入0.5ml离心管中，加入500ul无菌蒸馏水，剧烈振荡，室温下放置15min。(2)13 000r／min下离心3min，去上清液，收集沉淀，载体不需要去除，始终留在离心管内。(3)同血液(3)。
3．精液和阴道分泌液混合斑按有机提取法中精液和阴道分泌液混合斑提取DNA方法解分离理除去混合斑中上皮细胞，干净的精子沉淀物用200μl 5％Chelex-100溶液悬浮，加DTT 和PK至终浓度分别为39mmol／L和100μg／ml，在旋涡振荡器上振荡7秒钟，56℃保温过夜，振荡7秒钟，100℃保温8min后，剧烈振荡7秒钟，10000r／min下离心3min，上清液用于PCR 反应或4℃保存。
4．唾液(斑) 唾液(斑)样品的Chelex法处理同血液（斑）。
5．毛根剪取毛发的毛根部分5—10mm，置于 1.5ml离心管中，加入200μl 5％Chelex-100 2μ1 10mg／ml蛋白酶K，56℃保温过夜(至少6h)，剧烈振荡5—10s，沸水煮8min振荡5—10s，10000r／min离心2—3min，取上清液用于扩增反应。
6．其他有核组织取冷冻组织少许，研碎，用生理盐水洗去附着在组织上的血，5 000r ／min离心5min，去上清液；用200μl 5％Chelex-100悬浮沉淀，加2μ1 10mg／ml蛋白酶K，56℃保温过夜(至少3h)，剧烈振荡5-10s，沸水煮8min，再剧烈振荡5—10s，10000r ／min离心2-3min，取上清液用于PCR扩增反应。
7．羊水取500μl羊水，15 000r／min离心3min，弃上清，加入200μl 10％Chelex —100和2μl 10mg／ml蛋白酶K，混匀；56℃保温30min；高速振荡5-10s,沸水煮8min，高速振荡5—10s，10000r／min离心2-3min，取上清液用于PCR扩增反应。
二、DNA的贮存
在适宜条件(如TE，pH8.0)下，纯净的DNA能长期贮存而无明显降解。DNA一般溶于TE溶液，4℃保存。在pH8.0下，DNA的脱氨基速度比在中性时慢。TE溶液中的EDTA螯合二价阳离子，抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。因为二价阳离子是大多数核酸酶的激活剂，而核酸酶又恰是降解DNA的主要因素。EDTA还能抑制微生物生长，从而抑制核酸酶的形成。通常，在贮存DNA的溶液中加一滴氯仿，防止霉菌生长。将DNA在上述缓冲液中冰冻贮存时，产生缺口的速度更慢；但解冻时又可产生新缺口，因此不宜反复冻融，不宜使用自动除霜的低温冰箱贮存DNA。Chelex—100提取的DNA溶液应于4℃保存，对于长期保存的，最好将上清液转移到一干净离心管中，除去Chelex—100颗粒，置于-20℃下保存。
第三节DNA分型基础
一、DNA的分子结构
DNA是由4种核苷酸组成的多聚体。4种核苷酸的不同之处在于与脱氧核糖共价结合的含氮碱基类型。碱基分两大类；嘌呤类及嘧啶类碱基。嘌呤类碱基有：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；嘧啶类碱基有：胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA分子结构中的核苷酸通过磷酸二酯键将一个核苷酸脱氧核糖的5′位碳与前一个核苷酸糖的3′位碳共价结合。4种不同的碱基则沿磷酸脱氧核糖结合形成的骨架以任意次序与脱氧核糖结合，几十万个核苷酸聚合成一条DNA长链，链上有无数不同核苷酸序列的排列方式。细胞核的DNA由两段多聚核苷酸链组成，它们形成一种很特殊的双股螺旋状分子。两股链之间由各股链特有的碱基以碱基配对原则形成氢键而连接：A只能与T形成氢键；G只能与C形成氢键，A-T，G-C结合后形成碱基对(bp)。互补碱基配对原则是所有DNA分析方法的最基本原理。
将DNA加热至80℃以上或在碱性环境下，DNA分子中的氢链断开，产生2条多核苷酸单链的过程称为变性(denaturation)。当缓慢冷却至室温，或将碱性溶液中和，2条单链重新按互补原则配对结合，形成原来双链的过程称为退火或复性(annealing)。
二、结构基因
人类有46条染色体，各包含有一个DNA分子，每一个体细胞内的双倍体基因组含6×109个核苷酸。基因是DNA分子上的一个具有特定序列的片段。结构基因是决定某一种蛋白质分子结构的一段DNA或染色体，由前导序列、外显子、内含子及尾随序列组成。5′端和3′端均有侧翼序列。编码部分为外显子，非编码部分为内含子。内含子长度为40bp～1kb，比外显子长。编码部分大多数是单拷贝序列，高度保守；非编码部分则有单拷贝和多拷贝DNA序列之分。多拷贝序列又称重复序列，变异很大。基因组中编码的DNA占极少数，约1％～3％，非编码DNA占97％～99％。人类约有10000个结构基因被大量非编码的DNA不均一地穿插其间。
三、DNA多态性类型
DNA碱基序列变异称为DNA多态性(DNA polymorphism)，按孟德尔定律遗传。DNA多态性可分为序列多态性及限制性片段长度多态性两大类。
(一)序列多态性
序列多态性(sequence polymorphism)指某位点碱基排列的个体差异，例如HLADQα多态位
点，在相同242bp的扩增片段上，某些局部的碱基序列变异，形成了多个等位基因，用探针(指已标记的，与目的DNA碱基序列互补的单链DNA或RNA片段)杂交，测出4个主要基因：DQAl、2、3、4。DQAl和DQA4各有3个亚型：DQAl.1；1. 2；1.3和DQA4.1；4.2；4.3，故DQA基因碱基序列变异区段共有8个等位基因。人类线粒体DNA在个体间有明显的序列差异，这些差异存在于线粒体D环区附近，可用DNA测序方法测定。
(二)限制性片段长度多态性
限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)简称限制酶，这是一类能识别DNA分子内特殊序列的酶，能特异地与DNA识别序列内或其附近的特殊位点结合，将双股DNA切割。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms RFLP)是指DNA限制酶识别序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片段数目及长度发生改变所呈现的DNA多态现象。产生限制性片段长度多态性的分子结构基础有下列3种类型。
1．点突变点突变是指DNA序列中限制性内切酶识别位点发生单个碱基替换或修饰，使识别位点丢失或获得，以致限制性片段大小或数目发生改变，又称单碱基突变(single base change)。点突变包括碱基置换突变、移码突变及回复突变3种。一个碱基被另一个碱基所取代的点突变属于碱基置换点突变。镰状红细胞贫血的发生，是因与其基因相关的β珠蛋白基因发生了点突变的结果。编码正常血红蛋白分子的核苷酸序列是5′—CCTG(A)GGAG，而编码镰状细胞贫血患者血红蛋白分子的核苷酸序列是5′—CCTG(T)GGAG，编码谷氨酸的密码子GAG发生点突变，成为编码缬氨酸的GTG，即单一碱基A被单一碱基T置换，导致形成限制片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)。这种点突变可用限制性内切酶MstⅡ检出，编码正常血红蛋白的基因显示两条谱带：一为1.1kb；另一为o.2kb。镰状细胞贫血患者由于发生了点突变，原切割点消失，所以只显示一条谱带，大小为 1.3kb。这是一个典型的点突变例子，也是第一个报道的人类DNA点突变的RFLP。
在分析过的所有人类基因或基因附近均观察到这种类型的RFLP，只有那些影响限制酶识别位置的变异，才能测出RFLP；只有用同一限制酶切割的DNA在探针识别的区段内发生点突变才能测出RFLP。这种类型的DNA序列多态性只有2或3种等位基因，法医学应用价值有限，但遗传疾病诊断方面却很重要。
2．片段插入与缺失在探针识别的限制性片段内有一段DNA插入或缺失，会导致酶切割点的增多或消失，导致限制性片段大小发生改变。以C4 cDNA′片段为探针，以Hind Ⅲ酶解基因组DNA，对C4基因进行RFLP分析时，单倍型基因C4A﹡C4B(L)可检出32kb和15kb两条谱带，而在部分缺失的单倍型基因则只能检测到一条8.5kb的谱带。
3．重复序列数目的变异以多拷贝形式存在的DNA序列称重复序列(repetitive sequence)。人类整个基因组内重复序列约占20％～30％，它们大多存在于基因内非编码区(如内含子)或基因附近。重复序列的命名与分类主要依据其结构和分布特点。
DNA重复序列
散在重复序串联重复序倒位重复序
短片断长片断经典卫星DNA 中卫星DNA 有间隔无间隔
间隔型间隔型(大卫星DNA) 小卫星DNA 倒位重倒位重
卫星I 微卫星DNA 复序列复序列
卫星Ⅱ
卫星Ⅱ
卫星Ⅳ
α卫星
表16—1 DNA重复序列分类
DNA重复序列可分为散在重复序列、串联重复序列及倒位重复序列3类(表16—1)。倒位重复序列(inverted repeats)是一类特殊的重复序列，重复单位间是互补序列，在同一条DNA链上呈反向排列。倒位重复序列有2种形式：一种是两个互补拷贝之间隔着一段间隔序列；另一
种倒位重复序列是2个互补拷贝串联在一起，中间无间隔序列，呈迥文结构(palindrome)。180'旋转对称。人类基因组中大约5％为倒位重复序列。复重复序列的组成、分布、拷贝数目及长度是极其多样的。重复序列单元所在位置称基因座，按孟德尔定律遗传。
(1)散在重复序列：单拷贝DNA序列以其单体出现在不同染色体或相同染色体的不同位置，称为散在重复序列DNA(interspersed repetitive segment)。因其间隔片段大小不同又分为短片段间隔型(short interspersed segment SINEs)和长片段间隔型(long interspersed segment，LINEs)。
①SINEs：一般说来，SINEs包含＞500bp长的DNA序列。灵长类中最显著的SINEs是Alu家族，这个家族包含近300bp的一个重复单元(或称重复子，repeats)，含有一个AluI限制酶切点。人类每个单倍体基因组Alu序列的拷贝数估计有300万～910万，所以人类基因组中Alu家族占3％～9％。其他灵长类只有很少的Alu序列拷贝。
②LINEs：在研究过的种属中，仅有一个LINEs家族。人类的LINEs家族就是LIHs(或称Kpn)家族。LINEs重复子DNA序列长约6～7kb，有些成员片段长度大于7kb，最短的片段为o.5kb。这些短片段家族成员多数失去5′端片段。据估计,人类基因组中LINEs的拷贝数目高达107 000。有证据证明，LINEs主要存在于染色体G／Q带，与Alu家族序列最初定位于R带不同。G／Q带富含AT，是迟复制DNA的代表，能被Giemsaquinacrine染料着色。
(2)串联重复序列：多个特定序列首尾相连组成的重复序列称串联重复序列（andem repeats），又称卫星DNA(satellite DNA)，分成4类；①经典卫星DNA(classical DNA)，又称大卫星DNA(macrosatellite DNA)；②小卫星DNA(minisatellite DNA)；③微卫星DNA(microsatellite DNA)；④中卫星DNA(midsatellite DNA)。大卫星DNA及中卫星DNA因多态性相对简单，在法医学上应用极少，小卫星DNA及微卫星DNA则因具有极高的多态性，是法医学研究和应用的重点。
①可变数串联重复序列(小卫星DNA)多态性：可变数串联重复序列(variable number oftandem repeats，VNTR)，Wyman和White最初发现时，因其具有高度多态性，称之为高变区(hypervariable region)。VNTR是由许多长度为6～70bp的串联重复子组成的DNA序列，重复的数目少至数次，多至数千次，所以这种序列的长度变异很大，即有长度多态性。α-球蛋白基因附近的一个由17bp组成的DNA序列，它们在人类基因组中重复的数目可以少至70次，也可以多至450次，故这个区域的碱基对的总数变异在1190(17×70)至7650(17×450)bp的范围，说明VNTR的长度变异是很大的。VNTR多态性结构基础在于不同个体高变区所包含的串联重复序列拷贝的差异，高变区两侧内切酶识别切点的位置随高变区的大小而发生相对位移的结果，而限制酶识别切点本身的碱基未发生改变，限制酶也不切割VNTR区的内部。
这类串联重复DNA不仅出现在单一基因座上，也出现在多个基因座上。当不同基因座上的小卫星所有重复序列都含有一段相似的，约10～15bp长的保守顺序，即核心序列(core sequence)时，一个含有多拷贝核心序列的多基因座DNA探针，在低强度杂交条件下，可同时检出许多VNTR基因座，获得由一系列复杂的高度变异的DNA片段谱带组成的图像，即DNA 指纹图。
②短串联重复序列（微卫星DNA）多态性：短串联重复(short tandem repeats STR)的重复序列短，仅2～7bp，是一类简单重复DNA，也是一种VNTR。STR串联重复10～60次左右，所以又称为微卫星DNA。STR中最常见的是二聚核苷酸重复单位。STR与VNTR同样都是串联重复DNA序列，具有极高的多态性，亦按孟德尔定律遗传。STR分布广，散布在整个基因组中，平均每10kb就有一个STR基因座，在人类基因组中约存在着5万～10万个STR串联重复序列。
(三)线粒体DNA多态性
绝大部分(98％)DNA存在于细胞核内的染色质中，只有极少部分DNA存在于核外线粒体中。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)与核基因组DNA的构型不同，虽然都是双股结构，但却呈环形，不为组蛋白所结合而裸露，全长16569bp，每个细胞内有几百至几千个mtDNA 拷贝，均为单倍体。线粒体基因组约有5％～7％的D—环区(displacement loop)，D—环区表现极大的结构多态性，属于序列多态性。
四、DNA遗传标记的命名
DNA遗传标记的命名，国际上有统一的标准。对于是基因的一部分或位于基因内部的标记，用该基因的名字命名。例如STR标记，TH01是位于11号染色体上的酪氨酸羟化酶基因，TH01中的“01”意味着所涉及的重复区定位于酪氨酸羟化酶基因第1个内含子。有时在基因座名字前加一个前缀“HUM'’，这表示来自于人基因组，因此STR基因座TH01正确地表示为HUMTH01。对于基因区外的DNA标记，以他们所在的染色体位置命名。例如，D6S366和DYSl9。它们不在编码区。这里“D”代表DNA，D后的数字代表染色体的编号，6指6号染色体，Y 指Y染色体。“S”指的是DNA标记为单拷贝序列，最后的数字代表该标记发现的顺序和特定染色体的分类。用有序数目来命名每个DNA标记，使每个DNA标记独一无二，不会重复。例如，D18S51标记的每个符号表示：D：DNA，18：18号染色体，S：单拷贝序列，51：18号染色体第51个基因座。
五、核酸的限制性内切酶
限制性内切酶简称限制酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列的核酸水解酶，以内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3′端为-OH，这类酶都是从原核生物中发现的。原核生物自身的DNA并不受限制酶水解，因为宿主细胞内同时存在与相应限制酶识别序列相同的甲基化酶，使内源DNA中的识别序列以甲基化形式被修饰，不被原核生物内的限制酶消化。1970年，Smith等首次发现限制酶HindⅡ，到1985年已从350多种微生物中发现了498种限制酶，识别108种特定核苷酸序列。
制备DNA指纹图选择限制酶有3个基本条件：①限制酶识别点应位于VNTR位点的侧翼序列，要求尽可能靠近串联重复单位的5′端和3′端；②酶特异性和酶活性稳定，不易受酶切反应条件变化的影响；⑧不受基因组DNA中的甲基化修饰的影响，DNA指纹技术中最常用的限制酶有HaeⅢ、HinfI和Pst I。
六、探针
生物学意义的探针(probe)是指能与特定靶DNA分子发生特异性作用、并能被特定方法探知的分子。DNA指纹技术应用的核酸分子探针是指经示踪物(即标记物)标记的、能与互补靶核酸序列实现退火杂交的已知核苷酸片段。核酸分子探针可分为基因组DNA探针、eDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等。DNA指纹检测多用基因组DNA探针，另有一部分是参照VNTR位点的核心序列由人工合成。制备DNA指纹图时选择探针与选择限制酶同样重要，探针选择的基本原则是探针必须具备高度特异性，探针制备与标记容易，以及探针的杂交必须稳定等因素。最常用的探针是从基因组DNA中筛选的小卫星探针，它们应有共同的碱基组成，是小卫星DNA核心序列重复串联形成的多聚体。按分子杂交要求的条件以及检测的VNTR位点数不同，小卫星探针又可分为多位点探针和单位点探针分别用于DNA指纹与DNA纹印。
七、分子杂交
分子杂交(molecular hybridization)是指来源于不同DNA分子的两条非同源DNA单链，因部分碱基互补，在退火条件下，局部碱基配对，结合形成一条双链核酸的过程。分子杂交一词常与退火互换应用，但分子杂交主要用于鉴定两条来源不同的聚核苷酸链上碱基顺序的同一性问题，而退火则指两条互补的DNA链变性分离后，在适当的条件下又重新结合，或双股DNA 链变性分离成单链后，与人工合成的互补链(引物)结合，形成双股DNA新链。一般进行分子杂交时，在一定的温度和一定的盐浓度条件下，至少其中一个单股链(探针或靶序列)处于游离状态。在较低温度和较高盐浓度条件下进行杂交，谓之低强度杂交(lesser stringency)，常用在两股链紧密相关但又略有不同序列的分子杂交，两股链互补结合，形成稳定的双股链，低强度杂交多用于多基因座探针杂交。在较高温度(65℃)和较低盐浓度条件下进行分子杂交，谓之高强度杂交(higher stringency)，两股链完全互补，特异地、稳定地形成双股链，高强度杂交条件适用于单基因座探针杂交。用单基因座探针在低强度杂交条件下也可获得多条谱带图像。分子杂交也可在DNA与RNA之间，或RNA与RNA之间进行。
第五节DNA指纹和DNA纹印
DNA指纹和DNA纹印属于限制性片段长度多态性标记，利用限制性内切酶将人类基因组DNA切割成不同长度的限制性片段，经电泳分离后，用特异探针杂交，检测出不同片段长度的等位基因。图谱的个体特异性取决于所用的限制性内切酶和特异探针。技术核心是分子杂交。
一、DNA指纹图——多基因座VNTR
(一)DNA指纹——多基因座探针
人基因组DNA中一系列小卫星重复单位的核心序列有高度的同源性，因此，小卫星序列可以交互杂交，如采用核心序列多聚体作为探针，在低强度杂交条件下，只要与探针序列同源性达到能稳定杂交的所有小卫星片段均可同时被检出，一次可检出多个基因座，这类小卫星核心序列多聚体探针叫多基因座探针(multi locus probe)，如33．6、33．15、Myo、MZl3等。用多基因座探针检测得到的DNA图谱称为DNA指纹图。
(二)DNA指纹图谱特征
多位点DNA指纹图利用小卫星序列具有同源性的特征，在低强度杂交条件下，使DNA探针与不同染色体上VNTR基因座的靶片段杂交。因此DNA指纹图含有许多片段，在3-23kb范围内，有10-30条片段，图谱极其复杂且携带大量的遗传信息，具有人类遗传标记的各种特征。
1．孟德尔遗传通过大量的家系调查，发现DNA指纹图中大多数谱带，尤其是4kb以上的大片段以均等机会由亲代传递给子代，子代指纹图谱的所有谱带都可在双亲的指纹图谱中找到，片段的传递符合按孟德尔遗传规律，但子代的谱带不是简单的一半来自父亲，一半来自母亲。来自母亲的谱带数可能与来自父亲的谱带数不同。未发现任何一条谱带是特异地从父亲或母亲传递给子女的，排除性连锁遗传的可能性。此外，DNA指纹图中各谱带传递是独立的，谱带间没有连锁关系。只有当生殖细胞发生突变，才有可能导致子代个体DNA指纹图的改变，出现双亲不存在的陌生谱带。
2．组织同一性DNA指纹图无论在体细胞还是在生殖细胞中都是稳定的，同一个体的不同组织的DNA指纹图都是相同的，无组织间差异。同一个体的血液、精斑、毛发、肌肉、脑组织、骨等的DNA指纹图谱完全一致。离体细胞培养的细胞株仍保持与供体一致的DNA指纹图。但有两种情况例外：一种是不同组织之间甲基化程度不一样，当使用对甲基化敏感的限制酶如HinfI时，不能识别和切割甲基化的酶识别点，导致同一个体不同组织DNA指纹图不一致。但改用耐甲基化限制酶如HaeⅢ时，这种差异就会消失；再一种就是组织细胞的癌变。由于癌变细胞染色体丢失DNA或异常扩增，导致某一DNA谱带丢失或密度增强，或出现额外带，使癌变组织与正常组织DNA指纹图不同。
3．高度的个体特异性通过对DNA指纹图的统计计算表明，平均匹配概率在10-12以下，也就是说在100亿个人中，方可找到两个DNA指纹图谱完全相同的个体，足以说明DNA指纹图的高度个体特异性。惟一例外的是同卵双生子，他们的DNA指纹图完全一致。
4．突变率分析父、子、母的真三联DNA指纹图，发现子代DNA指纹图中出现父、母均没有的“陌生带”，这是突变形成的新片段。早期Jeffreys等用探针33．6和33．15分析一个亚洲印第安人真实家系4代54个个体时，发现平均每300条子代片段中出现1条陌生带。对1419例真实家系调查结果分析，33．6探针的突变率为0．5％；33．15探针的突变率为1.1％。在1419个真实家系子代中，出现1条陌生带的有82例(26.9％)，出现2条陌生带的有7例(1.2％)。Jeffreys以及Smith等人对真实家系的调查发现，子代DNA指纹图中含有1条或2条陌生带的情况较常见。因此，在应用DNA指纹图进行亲子鉴定时，遇到存在1条或2条陌生带时仍不能否定亲子关系，应参考其他方法如PCR、单基因座DNA纹印图的检验结果综合分析。在子代DNA指纹图出现3条或3条以上陌生带的案子中，可以排除亲子关系。．突变片段出现的主要原因是细胞在减数分裂过程中出现了基因交换与重组。VNTR基因座为高变区，多数小卫星序列本身就是基因组DNA内的重组热点。VNTR基因座的重组与交换同样也是形成等位基因片段的主要原因，突变率过高对个体识别影响较小，但对亲子鉴定不利。
(三)法医学应用的几种多座位DNA指纹图
1.α—珠蛋白—3′—HVR探针指纹图α—珠蛋白—3′—HVR探针/限制酶HinfⅠ对200名无关汉族个体进行DNA多基因指纹图分析在3.0-23kb范围内平均每个体片断数16.8条，片断平均概率0.198，两汉族无关个体的偶合率P＝0.19816.8＝1.5×10-12。
2. 3
3.6和33.15探针指纹图33.15探针检测HinfⅠ或HaeⅢ消化基因组DNA的产物，在4-20Kb范围内平均能检测到15条带，33.6平均能检测到11条带。33.15探针检测无关个体DNA指纹图完全相同的概率3.0×10-11，33.6探针检测无关个体DNA指纹图完全相同的概率3.0
×10-9，两者累积为5.0×10-19。
3. Myo 探针指纹图 Myo 探针检测Hinf Ⅰ或Hae Ⅲ消化基因组DNA 的产物，在2.3-23Kb 范围内平均个体片断数14条，片断平均概率0.215，无关个体DNA 指纹图完全相同的概率
4.0×10-9。
4. 寡核苷酸多基因座探针(CA C)5/(GTG)5指纹图 (CA C)5/(GTG)5探针检测Hinf Ⅰ为酶切基因组DNA 图谱，在4Kb 以上平均有13条，两个无关个体的偶合率3.8×10-10。
5.MZ1.3探针指纹图 在4.3-23Kb 范围内有18条带，两无关个体间同时出现同一条带的平均概率0.205，无关个体DNA 指纹图完全相同的概率
6.0×10-12 。
6. JL-02探针 是寡核苷酸探针核心序列为(NGG)5 (GAGGTG)3；JL-02探针检测Hinf Ⅰ为酶切基因组DNA 图谱，在4Kb 以上每个个体平均有16条，两无关个体的偶合率6.6×10-15。
(四)DNA 指纹的应用
DNA 指纹技术的建立被迅速应用到法医学的个人识别和亲子鉴定中，对生物物证的鉴定起到了巨大的推动作用。
1．个人识别 多基因座DNA 指纹图提供的信息量大，除同卵双生同胞外，任何两个无关个体的DNA 指纹图谱完全不同。在同一自显影照片中两份生物检材相互比对，如果两生物检材的谱带数目与位置不同，则可肯定两份检材不属于同一个体；当两份指纹图的谱带位置与数目均一致，称之为匹配(match)，可肯定两份检材来自同一个体。目前应用的数个多基因座探针在3.0-20kb 范围内均可检测出10—30条多态片段，群体中片段共有概率均在0．25以下。如一例强奸案的多基因座DNA 指纹图，现场精斑DNA 与嫌疑人血液DNA 经限制酶Hinf Ⅰ酶切，α—珠蛋白—3′—HVR 探针杂交，自显影图片中显示3kb 以上的有13条，按共有一个片段平
均概率X ：0.22计算，两者来源于同一个体的偶合概率为0.2213＝2.1×10-12，偶合概率接近0，
表明某无关的两个体被误认为同一个体的可能性几乎不存在，可以认定精斑为嫌疑人所留。
2．亲子鉴定
DNA 指纹图的谱带遵循孟德尔遗传定律传递给子代。子代指纹图中所有谱带均应出现在父亲或母亲的指纹图中。比较同一自显影片的孩子、假定父母的指纹图谱，分析三者间的关系，先在孩子指纹图中找出与母亲共有的谱带，剩下的谱带均为非母亲带(设有n 条)，如果没有突变带出现，所有n 条非母亲带均应在生父指纹图中找到。当孩子的n 条非母亲带中至少有3条以上不能在假定父中找到，则排除假定父与孩子的亲子关系；如果孩子的谱带均能在假设父母中找到，或只有1—2条不能在假定父母指纹图中找到，根据无关个体共有1条带概率，计算他们的相关机率。例如，子的非母带有m 条(n —2≤m ≤n)在假定父中找到，计算他们的相关机率X m
(X 为无关个体共有1条谱带的概率),认定是否有父子关系。DNA 指纹图的高突变率也是一个特点，亲子鉴定时发现有1—2条陌生带出现，下结论应慎重，要结合其他探针、DNA 纹印图或PCR 方法等检验作出结论。
(五)DNA 指纹的局限性与潜在的问题
多基因座DNA 指纹图一次检测获得最多遗传信息，其高度个体特异性是其他任何遗传标记系统无法比拟的，但在法医学应用中，也有其局限性和潜在问题。
1．灵敏度低，检材用量大：一次检测多基因座DNA 指纹图至少需要0.5—1.0μgDNA ，相当于50μl 的血液(痕)、5μl 精液、0.5—1.0μg 组织。一般案件的检材难以满足此条件。
2．对基因组DNA 的质量要求高：提取的检材DNA 分子至少在20kb 以上，腐败检材或降解DNA 无法进行多基因座DNA 指纹图检验；并且检材DNA 中不能含有抑制限制性内切酶活性的抑制剂。如果样品DNA 中含有色素等杂质，必须先进行DNA 纯化，否则抑制内切酶的消化作用，得不到DNA 指纹图。
3．多基因座DNA 探针没有种属特异性：实验证明，探针33．15和33．6不仅与人DNA 有同源性，而且对狗、猫、鸡、鸟甚至鱼类的DNA 也有同源性，可以发生杂交。同样,α—珠蛋白—3′—HVR 探针与牛、马、狗、鸡、鹿、鱼等DNA 也有同源性；MZl.3探针是用噬菌体DNA 筛选出来的，与常见野生和家养动物DNA 均有相当高的同源性。常用的多基因座探针均能杂交检测出动物DNA 。当物证检材中污染有动物DNA 时，可出现多余的额外带，严重干扰对物证检材的检验，导致错误的结论。
4．高突变率：在真实家系的子代存在1-2条陌生带(突变带)，陌生带的出现可能导致假排除。因此出现陌生带时，判断结果要慎重，必要时应同时检测2个多基因座DNA指纹图或进行其他系统的检验，避免误判。
5．检验操作繁琐，实验环节多，实验周期较长(5—7天)。
6．存在统计学问题，指纹图谱带数多，而且呈连续分布，测出的众多等位基因没有明确的基因定位，个体同一性概率、亲子关系概率及群体数据的统计学计算方法的理论尚待完善。
7．电泳凝胶的变形和谱带的漂移等将不可避免带来误差，因此不是同一块凝胶的分析结果不能比对。这也就造成在以往检验过的案件中，如果嫌疑人被排除，在以后重新找到嫌疑人，一旦原有检材已用完将不能再进行比对检验。
8．不能解决来自2个以上个体混合检材的个体识别问题。
二、DNA纹印图——单基因座VNTR
(一)单基因座探针的特点单基因座探针(sinsle locus probe)指在高强度条件下，只检测出单个基因座多态片段的探针，因此又称为基因座特异性探针(locus specific probe)，习惯称单位点探针。由单基因座探针检测得到的图谱称为DNA纹印图(单位点DNA指纹图)。单基因座探针检出的多态性片段在杂合子个体中可检出2条带，即该基因座的2个片段长度等位基因，纯合子为一条带。单基因座探针多从基因组DNA中筛选，属小卫星探针。筛选评估探针的指标除高特异性要求外，还包括：探针所检测基因座的染色体位置，多态片段的长度范围，等位基因数及在群体中频率分布，基因座杂合度、突变率及探针的交叉反应等。
(二) DNA纹印图谱的基本特征
1．高多态性与组织同一性对于VNTR基因座，理论上相差1个重复单位就构成1个片段长度等位基因，因此VNTR基因座上的等位基因数之多、杂合度之高是任何常规血型系统无法比拟的。一个高度多态性VNTR基因座上的等位基因少则十几个，多达数百个，尤其是高变区内的基因座，都呈高度杂合状态，有的杂合度几乎接近100％。例如D16S85基因座的重复单位为17bp，选用探针和限制性内切酶PstI检出多态性片段范围为0.5-6kb，该基因座理论等位基因数为(6 000÷17) ≈353个。根据中国北方汉族群体在D2S44、D17S70、D14S13、D14S1、DXYSl4和D18S27 6个基因座的基因频率分布计算这6个基因座的累积个体识别机率和累积非父排除率几乎达到了100％。单基因座DNA纹印图是法医学个人识别、亲子鉴定的有力工具。与多基因座DNA指纹一样，各种组织具有同一性，可以根据不同组织进行个体同—认定。
2．孟德尔遗传规律家系调查证明，单基因座DNA纹印图中片段的传递遵循孟德尔遗传规律，子代的2条带1条来自于母亲，另1条来自于父亲。
3．较高的突变率减数分裂中出现了不等交换和重组，使等位基因的重复单位数目增加或减少，形成新的等位基因，在家系分析时孩子DNA图谱中出现不能在生父和生母找到的谱带，即陌生带。高突变率是VNTR基因座的特点之一。DNA纹印图能直观地揭示某一基因座的突变情况，新的突变对个体的同一认定不会有太大的影响，但在亲子鉴定中新出现的突变片段可能会导致排除生父的错误。要求单基因座DNA纹印的突变率不得大于0.2％。对于个别突变率较高的探针，如D1S7突变率大于0.0380，不适合于亲子鉴定。
4．种属特异性单基因座探针均经过严格的筛选，在高强度杂交条件下，它不仅具有基因座特异性，而且也具有高度的种属特异性，与其他种属来源DNA(包括细菌DNA)不杂交，因此即使混有其他动物DNA的污染检材，其DNA纹印图谱亦不受干扰。
(三)几种DNA纹印图介绍国内从1988年开始有DNA纹印技术在法医学上的研究应用报道，如D2S44(PYNH24／HaeⅢ和PstⅠ) 、D14S1(pAC061／PstⅠ)、D17S79(pAC256／Pst Ⅰ)、D18S27(pAC404／PstⅠ)等。
1．D2S44(PYNH24探针／HaeⅢ或MspⅠ) PYNH24特异性探针，是Nakamura等用人工合成的HBV—2寡核苷酸(GGACTGGGAGGAGTTGGGGG)，从质粒CYNH24的人体基因组文库中分离出来长2.0kb的Msp I片段重组到pUCl8质粒中，可识别D2S44基因座的HaeⅢ或MspI 酶解基因组DNA产生的限制片段长度多态性。PYNH24探针／HaeⅢ酶解的RFLP图谱片段大小为1.02—6.26kb，分析146名北京地区无关汉族个体的杂合度为0.69，等位基因频率为0.003—0．152，相关机率为3.6×10-5—7.9×10-2。
2．D14S1基因座(pAWl01探针／EcoRI) pAWl01探针是人类14号染色体长臂端柱区域中的一个5.0kb的片段，它与免疫球蛋白基因紧密连锁，可识别D14S1基因座。pAWl01探针检测EcoRI酶解基因组DNA的消化产物。在106例广州地区无关汉族个体中，检出65条长度各异的片段，片段长度分布在9.4kb—30.2kb之间，两个无关个体相同的概率为0．00048。
3．D14S13(pCEl.2探针／HaeⅢ)基因座pC El.2(D14S13)探针是用一段人工合成的16mer 的寡核苷酸作为核心序列，筛选基因库，得到Cosmid PMLJl4后，再经MspI酶解，将其中一个600bp长的VNTR片段克隆到pUCl8的AccI基因座后扩增得到的，因此也称为PMLJl4探针。296名汉族无关个体的pCEl.2探针／HaeⅢ酶解的D14S13 RFLP片段长度范围为
1.08kb-18.8kb，杂合度为0.94，频率分布为0.002—0.051。
(四)DNA纹印图的法医学应用
1．个人识别单基因座纹印图只涉及一个VNTR基因座，当两份生物检材的纹印图不一致，就可以直接排除他们来源于同一个体，当两者图谱一致或匹配(match)，则不排除它们来自同一个体，需要加测其他基因座，最后进行无关个体DNA纹印一致的偶合概率计算。偶合概率计算可参照共显性等位基因控制系统的偶合概率计算方法。若独立的多个单基因座纹印图(或单基因座和其它的遗传标记)一致，可按乘法原则计算总偶合率。选用4—6个单基因座探针，累计达到很高的个人识别能力。需要注意的是由于片段长度测量误差、部分现场物证检材DNA 纹印存在正极漂移现象等原因，会使同一个体的现场遗留物证与新鲜血样出现差异，结果本该作同一性认定的却得出排除结论。
2．亲子鉴定单基因座DNA纹印的等位基因传递及基因型别类似共显性等位基因控制的血型系统，因此排除或认定亲生关系的原则，亲权指数(P1)及父子关系相对机会(RCP)计算与共显性等位基因控制的血型系统相同。Balazs计算D2S44、D14S1、D14S13、D17S79和DXYSl4五个单基因座DNA纹印图累计非父排除率为0．9996，几乎可以达到排除100％非亲生父亲的准确结论。
(五)单基因座VNTR—DNA纹印的优点及局限性
单基因座DNA纹印图技术与多基因座指纹图技术相比具有以下特点：
1．所得图谱带简单明了，纯合子只有1条带，杂合子有2条带，易于理解，这在法庭辩论中很重要。
2．灵敏度高，获得标准DNA纹印图谱的最小DNA量为50ng，相当于2ul血液、20ul唾液和lul的精液。
3. 能够有效鉴定混合样品，纹印图中出现3条或3条以上带时，说明可能有2个或2个以上样品存在。分析样品为混合样品，如确定强奸是否为轮奸等。
4．单基因座DNA探针在序列上具有高度的种属特异性，杂交条件为高强度杂交，人类单基因座探针不会与其他种属DNA杂交，细菌污染或污染有其他动物的标本，都不会影响结果的分析。
5．DNA纹印图中DNA片段长度相对小(<10kb)，可用于分析部分降解DNA样品，获取有关的信息。
6．检测结果重复性好，统计学评估容易理解，便于计算机管理与比对。
7．DNA纹印图技术的等位基因呈连续分布，无法获得准确的等位基因频率；一个探针只检测一个基因座，所得信息量低，无法一次达到个体同一认定水平，需4—6个不同单基因座探针联合检测，费时费力，这是DNA纹印图技术的缺点。
三、DNA指纹和DNA纹印的操作步骤①DNA的提取；②限制性内切酶酶切；③电泳分离；④印迹转移；⑤探针标记；⑥分子杂交；⑦DNA图谱的显现；⑧结果判读。
第六节聚合酶链式反应
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。体外扩增的思想早在1971年就由Khorana及同事提出，在1985年由Kary Mullis创立。此法操作简便，短时间内在试管中可获得数百万个特异DNA序列的拷贝。1993年Mullis因此获得了诺贝尔奖。PCR技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用，而且与PCR相关的技术不断被
开发应用。目前大多数法医DNA分析技术均以PCR技术为基础进行分型。
一、PCR技术的原理
PCR技术实际上是模拟生物体内的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的体外DNA酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物是PCR反应中最主要的成分。反应分三步：(1)变性(denaturation)：首先是双链DNA分子在95℃左右高温下加热，DNA双螺旋配对碱基间的氢键断裂，双链解离成单链DNA；(2)退火(annealing)：降低温度使引物和其互补的模板形成杂交链。由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，模板DNA双链之间互补复性的机会较少；(3)延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的5′—3′方向的DNA链延伸反应。
经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的序列不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的DNA以指数的形式堆积，数量可达2×105-7拷贝。在反应的最初阶段，原来的DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物引导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA 片段。
二、PCR反应
标准的PCR反应一般选用50-l00μl反应体系，其中含有：50mmol／L KCl，l0mmol／LTris —HCl(室温下pH 8.4)，1.5mmol／LMgCl2，0.001％明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2个引物，各0.25μmol／L，4种底物(dA TP+dCTP+dGTP+dTTP)各200μmol／L，模板DNA(人基因组DNA)0.1μg，TaqDNA聚合酶2.5u。反应条件一般为94℃变性30s，55℃退火30s，70-72℃延伸30-60s，30个循环。
三、PCR相关技术PCR—SSO技术在法医学主要用于HLADQα多态性检验，PM系统检验；PCR—RFLP技术主要用于ABO，HLA，线粒体DNA等序列多态性分析；SSP—PCR技术可用于MN基因型的分析；PCR—SSCP技术；MVR—PCR技术；APDR技术等。
第七节线粒体DNA分析简介
线粒体是存在于细胞质的一个含有双层膜的重要细胞器，是细胞的氧化中心和动力站。几乎人体所有细胞中均有线粒体，但不同组织细胞中线粒体的数目有所差异，如肝脏、心肌、骨骼肌等组织细胞中线粒体数目含量较多，每一个肝细胞中约有1 000—2 000个线粒体，可能与这些组织中的代谢率高有关。线粒体有自己的遗传系统，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是人类第二套基因组DNA，也是人类细胞中除核之外唯一含有DNA的细胞器。线粒体也有自己的蛋白质翻译系统和遗传密码。线粒体的基因组编码tRNA、rRNA及一些功能蛋白质，如电子传递链酶复合体中的亚基，这些均参与维持线粒体系统的功能。由于受精卵中的线粒体几乎全来自于卵细胞(因为精子细胞中含有极少量的线粒体，只有50个拷贝)，所以线粒体遗传系统往往表现为母系遗传，母亲所携带的mtDNA突变可传给她的子女。
一、人类线粒体基因组
mtDNA是裸露的，不与组蛋白结合，存在于线粒体的基质内或粘附于线粒体内膜。在一个线粒体内往往有一至数个mtDNA分子。mtDNA的自我复制也是以半保留复制方式进行的。线粒体基因组是人类基因组的重要组成部分，剑桥大学的Anderson等人于1980年完成了对线粒体基因组的全序列测定，该序列可在基因库中找到，称之为Anderson序列或桥序列。现都以Anderson序列作为标准，进行人线粒体DNA序列多态性比对。现代的线粒体是从古代的一个细菌祖先进化衍生而来。人类线粒体基因组的序列共含16569个碱基对(其中5122A，5180 C，2171 C，4096T)，为一条双链环状的DNA分子。双链中有一条为重链(H)，即富含嘌呤链；另一条为轻链(L)，即富含嘧啶链。这是根据它们的转录产物在CsCl中密度的不同而区分的。线粒体基因组共编码了37个基因，其中22种基因编码tRNA分子(用于线粒体mRNA的翻译)，2种编码rRNA分子(用于构成线粒体的核糖体12S和16SrRNAs)，另外还有13个编码氧化磷酸化电子传递链和A TP产生涉及的蛋白质和酶。线粒体基因组与核基因组相比要经济或紧凑，核基因组中编码功能的序列不足10％而在线粒体基因组中只有很少非编码序列。
mtDNA除编码区外，线粒体DNA还含有一个非编码区，叫控制区(control region，CR)，又叫D—环区(D—loop)，这个名字得自于电子显微镜观察到的线粒体DNA在复制过程中形成的一种结构形状。控制区大约1100bp或1125bp大小。在D—loop区中间，含有基因多顺反子RNA转录的启动子(promoters)和重链复制的起点。Anderson序列的碱基数字定位系统是从控制区中间附近开始的，因此控制区跨度为ntl6024—16519，然后ntl—576。相对于编码区，控制区在个体间存在较大差异，有许多单碱基取代与突变，mtDNA控制区每100bp有1—3个核苷酸发生变化，另外还存在二个串联重复序列长度多态性区，例如在第514—523位置的CA重复。碱基多态性主要集中在二个高变区(hypervariable region)：高变区Ⅰ和区Ⅱ，简称HVRI和HVR Ⅱ。高变区I范围为ntl6024-16365，高变区Ⅱ为nt73—340，高变区边界不是固定的，不同实验室或研究报道有所不同。1998年Lutu等人报道线粒体DNA还存在高变区Ⅲ(nt438—574)，二核苷酸CA重复位于这HVRⅢ。HVR I的多态性最好，重链的复制区起点在HVRⅡ。mtDNA 法医学价值就在于D—loop区的个体间的序列差异，主要是HVRI和HVRⅡ。
二、线粒体DNA遗传系统的特点
1．多拷贝在正常细胞中，一个细胞的细胞核中只有一套染色体或核基因组，一个基因座位上有两个等位基因，一个来自母亲，另一个来自父亲。然而，每个细胞内则含有多个线粒体，并且每个线粒体内含多个拷贝的线粒体基因组DNA(血小板和未受精的卵子例外，它们中的每个线粒体内只含有一个拷贝的mtDNA)，体细胞大约含有200—1700个mtDNA拷贝。组织类型不同，数目也不同。由于mtDNA含量相对丰富的，因此在核DNA已降解的样品中仍有较大可能地提取到mtDNA。
2．高突变率mtDNA具有比核DNA更高的突变率，mtDNA中某些区域的进化速度是核基因组的6-17倍。mtDNA的非编码区在个体间表现出高度的差异性，例如，高加索人在mtDNA 的高变区I和Ⅱ中平均有8个核苷酸不同。
3．异质性一个个体的mtDNA有两种或两种以上不同碱基序列差异的情况称之为异质性(heteroplasmy)或叫杂合性；一个个体的所有mtDNA分子都相同，则称之为同质性(homoplasmy)或同一性。个体mtDNA异质性的存在形式有三种：(1)个体的同一组织中含有一种以上的mtDNA序列；(2)同一个体不同组织的mtDNA序列不同，一种组织含有一种mtDNA序列，而在另一组织中存在着另一种mtDNA序列；(3)个体的一种组织中的mtDNA为同质性，而在另一种组织表现为异质性。在细胞发育过程中，mtDNA分子彼此独立复制，不涉及细胞减数分裂，因此本质上没有重组。而且mtDNA复制过程中存在比核基因组DNA更高的出错率。这些因素导致个体中mtDNA分子存在着差异，并且不同的变异体独立复制、分配。但是mtDNA 传递过程中的遗传瓶颈限制了mtDNA变异体在后代中的传递，使其在人群中分布没有那么广泛，只有2％—8％人群存在异质性。
4．母系遗传在精卵结合的受精过程中，受精卵中几乎所有的mtDNA来自于卵子，表现为母系遗传(maternal inheritance)。主要原因是简单的数量问题，因为精子头部不含或极少有mtDNA，而卵子则含有上百万个拷贝mtDNA，另外有学者认为还存在一个特异的识别机制，减少了进入到卵子的父方mtDNA。因此，mtDNA分子的传递与盂德尔遗传不同，表现为母系遗传。母亲将携带的突变mtDNA分子传给她所有的子女，再由她的女儿能把这种突变传给下代，四代内没有变异发生。
三、mtDNA遗传多态性分析方法概述
1.分析方法mtDNA的多态性主要表现为D—loop区域的碱基序列的差异性，除此还有另外2个串联重复单位的长度多态性。有多种方法检测D—loop区多态性，由于单个细胞中含有数10万个拷贝线粒体DNA，使之比核DNA更容易进行测序，且mtDNA单倍体的性质使之比二倍体核DNA更容易测序，加上直接测序可以获得更多的信息，因此目前最为常用的是mtDNA 的直接测序。
2.遗传统计分析mtDNAD—loop区域的碱基序列为连锁遗传，只能算作一个基因座，以单倍型表示，进行遗传群体分析按照单倍型频率统计计算。基因差异度(Gene diversity，GD)来表示mtDNA的个体识别能力。计算公式为：GD﹦[n(1—∑x2)]／(n—1)。式中n为群体的样品数，式中x为线粒体DNA单倍型在群体中的频率。
四、法医学应用
1．由于线粒体DNA的高突变率，线粒体D—loop区存在着三个高变区(HVRI、Ⅱ和Ⅲ)，具有高度个体差异性，尤其是高变区I，同一人群不同个体间存在差异，人群与人群也存在差异，比如在非洲裔美国人群个体间平均有14个核苷酸不同，高家索人群中只有8个核苷酸不同。通过对105名中国汉族无关个体的mtDNAD—loop区HVRI (15997-16401)测序分析，发现存在118个碱基突变点，不同个体平均突变碱基数为4.029个，最多可达9个碱基突变。序列分析两个高变区，排除率可达95.6％—98.1％，线粒体DNA具有高度序列多态性，可以用于个人识别。
2．线粒体呈母系遗传，兄弟姐妹、婊兄弟姐妹、姨的mtDNA序列一致，已有实验数据表明四代之内，所有母系亲属的线粒体序列相同，可以进行母子(女)鉴定、身源鉴定，如Holland(1993)用mtDNA测序法对越战身亡的美国士兵残骸进行了身源鉴定，尤其是那些无法得到父母DNA样品进行鉴定的情况下，利用身亡士兵兄弟的mtDNA序列进行比对，成功地确定了他们的身源。
3．每一细胞的线粒体DNA拷贝数比核DNA多许多倍，mtDNA分析的灵敏度高；线粒体基因组为闭环结构，存在于细胞内的线粒体中，具有较好的抵抗降解的能力。在核DNA已降解的情况下，大多仍能检测到mtDNA，因此可以进行陈旧、腐败检材的分析。
4．在一些角化的细胞，如毛干、指甲等含有角化的细胞，由于细胞核发生明显的转移，检测不到核染色体DNA，无法对核基因组DNA遗传标记进行分析，而存在于细胞质中的一些线粒体还没来得及转移，可以检测到mtDNA，因此应用mtDNA可以对毛干、指甲等只含角化细胞的检材进行个体遗传分析与亲子鉴定，这是线粒体DNA分析的最大优点。
第八节小卫星VNTR
一、VNTR概述
基因组DNA中存在一类串联重复序列，其串联重复单位(核心序列)数目在人群中存在较大差异，具有高度多态性，称此为可变串联重复序列(VNTR)，根据重复单位长度分为二类，重复单位长度为10～70bp，称为小卫星。长度为1—7bp的，称为微卫星或叫STR。
根据VNTR基因座侧翼序列，设计、合成与侧翼互补的寡核苷酸作为PCR引物，应用PCR 技术扩增包含VNTR基因座侧翼和重复单位序列，凝胶电泳分离片段长度不同的扩增产物，根据扩增片段长度差异确定其基因型。因此，称这种用PCR技术检测VNTR基因座多态性的分析为扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AMP—FLP)分析，它充分发挥了二个优势：一是基因组VNTR基因座具有高度多态性优势，二是PCR快速、高效扩增的优势。AMP—FLP分析是20世纪90年代法医DNA分析技术一项突破性进展，使DNA分型实现了高效、快速、灵敏的目标，被称为第二代DNA分型技术。
AMP—FLP图谱简单，纯合子个体只有一条带，含有二个长度相同的等位基因；杂合子个体有二条带，含有二个长度不同的等位基因。法医学鉴定应用AMP—FLP有以下几个特点。①高灵敏度。PCR技术理论上可以扩增出单个细胞基因组DNA，在日常物证鉴定中，灵敏度可以达到ng—pg级。②适用于陈旧、降解、腐败检材。小卫星VNTR基因座多态片段长度多在lkb以下，微卫星座位的靶片段一般不超过400bp，因此模板DNA只要含有引物结合序列及目的重复序列区就可以得到扩增产物。③可以进行多个基因座复合扩增检测。PCR检测的模板DNA用量少，可以进行多次或多个基因座检验，也可以将扩增条件近似的基因座安排在同一个反应体系中进行复合扩增，增加单次检测的信息量。④具有种属特异性。在引物设计上选择人类特异的序列，其它物种DNA一般不会得到扩增。⑤能够进行混合检材的个人识别。对于单一个体，PCR扩增产物只有一条或二条谱带。如果有二个或二个以上不同个体来源DNA混合在一起，扩增图谱中会出现三条或三条以上的谱带。由于PCR反应的高灵敏度，即使二个个体的DNA按1：10混合，也能分辨出来。⑥可获得不连续的等位基因频率。选用的VNTR座位的等位基因片段长度在lkb以下，等位基因片段间按重复单位数成等差数列，电泳分离后等位基因判定明确。等位基因分布呈不连续性，群体等位基因频率可以按显性基因统计方法计算。
⑦实验周期短，设备条件和操作相对简单。
二、小卫星VNTR基因座分型基本技术
1.模板DNA制备模板DNA制备见DNA提取部分。对于小卫星VNTR基因座采用酚—
氯仿法提取DNA较好。如果用Chelex—100方法提取，某些基因座扩增可能不太理想。2．PCR扩增反应标准PCR反应体系一般为50μl或25μl，在一个反应管中将PCR反应各组分混合后置热循环仪中，设定热循环参数进行扩增。①根据扩增仪型号选择0.5ml或0.2ml 离心管，标记好每一个离心管。②模板DNA用量1～100ng，对于有机溶剂提取、酒精沉淀的模板DNA，先稀释成1—l00 ng ／μl，后取1μl用于PCR反应；如果为Chelex—100提取液，一般取5～7μl用于PCR扩增。③确定反应管数，然后按表16—2各反应组分，计算10×缓冲液，dNTPs，引物，及TaqDNA聚合酶与灭菌超纯水等总量，表16—2是以D1S80基因座为例设定的浓度与用量，其他基因座可参照设定。④按下列顺序加样先加灭菌超纯水、缓冲液、dNTP，引物及Taq酶，然后旋涡振荡数秒混合均匀，快速离心数秒。⑤按每份(50﹣x)μ1分装到每一离心管，x为模板DNA用量。⑥最后加入模板DNA，混匀，加1-2滴无菌的石蜡油覆盖PCR反应液。如果扩增仪配有热盖，使用薄壁离心管则无须加石蜡油。⑦最后快速离心数秒，放人扩增仪内，设定PCR热循环参数，进行扩增。标准的循环参数为95℃变性5min后，94℃变性lmin，60℃退火lmin，72℃延伸3min，循环35次后退出，72℃延伸7min，最后4℃保温。
表16—2 D1S80基因座的50μl扩增体系各组分含量
PCR反应液组分贮液浓度需加的量
1×缓冲液10×缓冲液5μl
200gmol／L dNTP 2.5mmol／L 4μl
0.2μmol／L引物1 2μmo1／L 5μl
0.2μmol／L引物2 2μmol／L 5μl
模板DNA 1—100ng xμl
TaqDNA聚合酶1.25u 5u／μl 0.25μl
灭菌超纯水至50μl 3．PCR扩增产物的电泳分离与检测不同片段长度的PCR产物经电泳分离后按片段分子
大小彼此分离，通过谱带显现，可以确定等位基因基因型。PCR扩增产物电泳分离方法主要有：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。可根据扩增产物片段长度范围分别选用。
(1) 琼脂糖凝胶电泳与EB染色法①小卫星VNTR基因座扩增片段长度一般在300—1 000bp之间，配制1％-2％琼脂糖凝胶，凝胶缓冲液为1×TBE（pH8.0 0.09mol/L Tris 0.06mol/L 硼酸0.2mmol/L EDTA ），凝胶长度为14cm以上。②取10—15μl CR扩增产物与等量载样缓冲液(20％甘油0.02％溴血酚蓝0.02％二甲苯青)混合加样，1×TBE溶液为电极缓冲液，在100V或200V恒电压条件下电泳，电泳时间根据检测基因座片段长度确定，一般可根据载样缓冲液中染料溴酚蓝与二甲苯菁蓝的位置判断。③采用EB染色，紫外灯下观察电泳分离的DNA 片段，照相记录结果。
(2) 垂直非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离利用T5％的变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，银染显色方法检测扩增产物。在20世纪90年代初期，小卫星基因座的扩增产物大都采用微型聚丙烯酰胺凝胶(10×8cm左右)电泳，具有快速、灵敏、操作简便等特点，但分辨率低,目前都采用长距离(14-20cm)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。具体方法同STR基因座。结果的判读是以已知重复单位数的等位基因分型标准物(allelel adder)做为参照进行的，以等位基因重复数命名等位基因。如样品的谱带位置与邻近的等位基因分型标准物中等位基因6一致，则样品该谱带为等位基因6。
二、常用小卫星VNTR基因座
目前发现的小卫星VNTR基因座很多下表是法医学应用部分基因座（表16—3）。
表16—3 法医学应用部分小卫星VNTR基因座
基因座染色体定位等位基因数杂合度(H) 个人识别机率(DP) D1S80(PMC118) 1P 29 0.84 0.96
APOB(apolipoptein B) 2p24—p23 16 0.79 0.95
D1S118(p33.4) 1号染色体8 0.64 0.845
D17S30(PYNZ22) 17号染色体15 0.82 0.94
D1S111(p33.6) 1q21—1q31 12 0.72 0.916
COL2A1 12q14.3 7 0.697 0.845
IL-6 7p15—p21 5 0.592 0.791
第九节微卫星(STR)基因座概述及检验方法
一、STR基因座概述
(一) STR基因座特征
重复单位长度为2-6bp的重复序列称为微卫星序列，也叫短串联重复序列(short tandem repeat，STR)或简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)，统称STR。STR基因座重复序列串联排列，基因座扩增片段一般在400bp以下。因为在STR基因座杂合子个体的二个等位基因大小比较接近，所以STR基因座更适合于PCR扩增而没有优先扩增的问题。目前STR是法医DNA分析中最常用的一类遗传标记。STR在整个人基因组分布广泛，平均每10kb出现一个。多态STR序列绝大多数位于非编码区，极少数在编码区域。目前在人基因组DNA(23对染色体)发现的STR序列达8000多。STR基因座具有以下特点①STR基因座在人类基因组中分布广泛，多态性基因座数量多。②STR基因座等位基因片段长度一般小于400bp，易于扩增。对DNA 的质量要求低，适于陈旧、降解生物检材的DNA分析。③STR分型检测的灵敏度比小卫星VNTR 基因座高10倍，所需的检材DNA量更少，适用于微量、超微量检材的鉴定。④STR基因座等位基因片段长度差异较小，采用高分辨率PAGE可以获得不连续基因频率分布参数。⑤STR基因座等位基因之间长度差异较小，较小等位基因优先扩增现象不明显。虽然某些基因座可以观察到杂合子中二个等位基因信号强度差异，但二者强弱差异小于40％。⑥STR基因座的等位基因片段比较小，各个基因座扩增条件相似，因此多个STR基因座可以安排在同一个反应体系中进行复合扩增，简化操作程序，节省检材与试剂，提高工作效率。⑦STR基因座分析方法简便、判型准确，分型程序明确、规范，所得分型结果图形简单，有利于实现DNA分型标准化和自动化，有利于DNA分型数据的计算机存储、联网检索。
(二)STR基因座的分类与等位基因命名
1．STR基因座的分类STR基因座常根据重复单位的核苷酸数分类。二核苷酸序列(dinucleotide repeat)指有不间断重复的二个核苷酸重复，三核苷酸(trinucleotides)指的是重复单位为三个核苷酸，四核苷酸(tetranucleotide)、五核苷酸(pentanucleotide)和六核苷酸(hexanucleotide)分别指4、5和6个核苷酸为重复单位序列。理论上，单、二、三、四、五和六核苷酸重复有4、16、64、256、1024和4096种重复单位类型，又称主型(motif)。但由于微卫星是串联重复，实际的主型数要比理论的少许多，因为有些主型表面上看起来不同，实质上是相同的。比如，主型(GAAA)n相当于(AGAA)n或(AAGA)n、(AAAG)n或(TTTC) n、(TTCT)n、或(TCTT)n或(CTTT)n，这8个主型其实指的是同一个序列，只是表达的方式不同。因此实际上，单、二、三、四、五和六核苷酸重复只有2、4、10、33、102和350个主型。四核苷酸序列基因座是法医DNA分析最常用的基因座，其中AGAT或GATA为其最常见的主型。STR序列不仅在重复单位的长度和重复数目上有差异，而且重复单位排列方式不同。根据重复单位的碱基组成，Urquhart(1994)等将STR分成以下三类：(1)简单重复序列(simple repeats)：含有同一长度和序列的重复单位，如HumFES／FPS基因座只含有单一的(A TIT)n重复。HumCD4，TH01，F13B等基因座也是简单重复；(2)复合重复序列(compound repeats)：含有二个或二个以上简单重复序列，如HumGABRBl5基因座为(GATA)5-12(GA TC)2-4(TATC)l-2，HumVWA基因座为
(TCTA)n(TCTG)m(TCCA)p；(3)复杂重复序列(complex repeats)：同一基因座重复单位既有序列差异，又有长度差异，如HumACTB、D21S11基因座。
2．STR基因座等位基因命名为了保证实验室之间的数据重复性和可比性，国际法医血液遗传学会(Intemational Society of Forensic Haemogenetics，ISFH) 1997年提出的命名原则如下。
(1)链的选择①对于蛋白编码区域的STR基因座(包括基因的内含子)选用编码链作为重复单位命名链。如VWA、TPOX、CSFlPO基因座遵循此原则。②与蛋白质编码无关的如以DxSx x 命名的STR基因座，采用第一个进入公共数据库的原始序列作为标准进行命名。③命名已建立，但与原则不一致的命名仍按原先的命名，以免引起混淆，如TH01以“AATG'’为核心序列。
(2)主型的选定和等位基因命名①重复序列主型从离5′端最近的一个核苷酸开始定义。例如：5′—GGTCA TCATCATGG—3′序列可以看作有3×TCA的重复序列，也可以看作3×CA T的重复序列。但根据ISFH新原则，只有第一个(3×TC A)是正确的，因为是从离5′端最近的一个核苷酸开始。②根据等位基因内所含的重复单位数目命名等位基因，如某一等位基因含有10个重复序列，则该等位基因命名为10。③含有不完整重复序列主型的等位基因命名：在完整等位基因数后面加一小数点，小数点后面为不完整重复序列含有的碱基数。例如，TH01基因座中含有一个不完整重复主型的等位基因，等位基因9．3，表示含有9个完整的四核苷酸重复AATG和一个不完整的3个核苷酸的A TG重复。④经测序确定的并按ISFH建议命名的等位基因分型标准物(1adder)为分型标准，进行未知样品的等位基因分型。
3．等位基因分型标准物的制备等位基因分型标准物(allelic ladder)是人群中常见的已知等位基因分型的等位基因混合物，用来与未知样品比对确定基因型。通过大量群体调查，筛选、分离出这些等位基因，经DNA测序确定这些等位基因的片段长度与序列(重复序列重复次数)，明确等位基因分型。将这些等位基因混合起来再进行扩增，制成含有各种等位基因的分型标准物。也可以将等位基因克隆到质粒里进行制备。
(三)突变
STR基因座的任何DNA序列都可能发生突变。理论上，迄今存在的所有等位基因都是最早极少数个体的等位基因经过成千上万年的进化过程缓慢变化的结果。突变可以是单个碱基的变化，也可以是整个重复单位长度变化。STR突变的机制主要是复制滑动(replication slippage)或DNA复制的错误修复。据估计STR基因座平均突变率为0.1％—0.5％。
1．等位基因突变的发现根据孟德尔遗传定律，子代的遗传物质一半来自于母亲、一半来自于父亲，检查母、子、父三联体的基因型，如果孩子的等位基因与父母的有差异，表明有可能存在突变。由于大多数STR基因座的突变率比较低，必须调查大量的亲代—子代间等位基因的传递，才能发现突变。国际DNA委员会建议在新STR基因座调查中至少要观察500次减数分裂。一般来自父方的突变率高于母方5倍以上(17：3)。
2．突变基因的确定Brinkmann(1998)根据Weber(1993)报道的文献，归纳如何确定被突变的等位基因。如果存在有两种可能的等位基因发生突变，那么与突变成的新等位基因长度相差最小的等位基因就是发生突变的基因。例如，一个父方等位基因与子代等位基因差一个重复单位，而另一个差2个重复单位，则可以推断与子代等位基因只相差—个重复的那个等位基因发生了一步突变(one step mutation)。如果与子代等位基因比较，二个亲代等位基因的差别一样，就无法确定哪个等位基因发生了突变。
大多数STR基因座的突变涉及单个重复单位的增加或减少，即一步突变，大约占突变基因的90％。如VWA基因座，突变以一步突变为主，即单个重复单位的增加或减少为主，父方有14个重复单位的等位基因，由于突变，子代表现为13或15个重复单位。突变使重复单位增加与减少的比例为2：1，因此总体上突使链延长。在男性和女性之间，突变的发生有差异。父方等位基因的突变比母方的更频繁，Bdnkmann(1998)发现男性与女性的突变比例为17：3，男性精子分化经历的细胞分裂数比卵子的高10倍，Y—染色体的取代积累比常染色体快2倍。如果突变率与细胞分裂成正比，据估计，卵原细胞在减数分裂之前经历了约22次分裂，形成卵细胞。精原细胞靠继续的有丝分裂再生，在形成精子之前，它们经历了更多的分裂。对于一个29岁的男子，在进入减数分裂前，大约经历了350次分裂。所以对29岁的男性，突变率比女性的高16倍。而且，随着父亲年龄的增长，单个重复单位的突变发生率增加。而在女性中则没
有这种年龄效应。
3．突变对亲子鉴定的影响突变对亲子鉴定影响很大。因为孩子与假定父亲间关系确定是基于等位基因按孟德尔遗传方式传递的假设前提。如果不注意STR基因座突变，可能导致误排生父；对于群体进化研究而言，群体统计和群体历史必须减去突变过程才能正确研究群体遗传问题。一些群体性灾难事件中残骸的身份确定与一些尸源鉴定，要与嫌疑家庭人员进行比对，突变将是一个值得注意的重要问题，因为如有突变存在，将会出现不完全的匹配。
三、STR基因座PCR扩增
(一)多STR基因座复合扩增
1．复合扩增的特点STR基因座由于串联重复序列只有2-7bp，等位基因片段比较小，等位基因数目相对有限，片段长度范围小，较容易扩增，各基因座之间扩增条件基本相似，因此几个不同的基因座可以安排在同一个反应管中进行扩增，这种把二个或二个以上的基因座放在同一个反应管中同时扩增，叫复合扩增。单个STR基因座等位基因数少，信息量有限，实际案件鉴定常需联合检测8-12个基因座，才能达到类似DNA指纹的同一认定水平；多个STR基因座复合扩增，明显提高了单次检测信息量，一次检测可以达到个人同一认定，但灵敏度比单基因座扩增低。例如四基因座复合扩增体系，其灵敏度为100pgDNA，低于100pg基因组DNA 复合扩增时会出现一些等位基因丢失现象。
2．复合体系基因座数目的确定多少个基因座可以在一个复合体系中扩增，取决于扩增产物检测系统。目前常用检测系统有银染和荧光染料标记自动检测系统。
(1)银染系统银染法只根据各等位基因的片段大小区分，要求组成复合扩增的各个基因座等位基因片段长度范围没有重叠。复合体系中基因座数目不宜多，一般为3—4个。
(2)多色荧光标记检测系统该检测系统可以根据等位基因片段所带的荧光颜色不同加以鉴别，即使等位基因片段长度有重叠的基因座，也可采取不同的荧光染料标记，区分不同基因座的等位基因。因此这种复合体系可以有较多的基因座，如7个基因座、8或10个基因座复合扩增，甚至开发有16个基因座的复合扩增系统，明显提高了检测的信息量。
(二)STR复合扩增的影响因素
对于某一特定STR基因座，PCR反应参数是特定的，也是最适的，当二个或二个以上基因座在同一反应体系中进行复合扩增时，要兼顾各个基因座的特点，合理调整扩增体系成份、热循环参数等因素，才能提高复合体系扩增效率。
1．PCR缓冲液TaqDNA聚合酶的标准反应缓冲液成分为10mmol／L Tris—HCl(pH8.3)，50mmol／LKCl，1.5mmol／LMgCl2，1％TritonXl00或0．001％白明胶。1％Triton—X100和0.01％白明胶都具有缓解蛋白质对TaqDNA聚合酶的抑制作用，不同厂家PCR缓冲液没有明显差异。PCR反应缓冲液浓度改变会影响PCR扩增，例如当标准缓冲液浓度减少到一半时，复合扩增PCR产物会减少，不同基因座受影响程度不同；当浓度增加到两倍时，背景信号也明显增加。
2．引物浓度(1)复合体系中某基因座引物浓度发生改变，该基因座扩增产物信号强度会发生变化，但基本不影响复合体系中其他基因座。但有个别基因座引物浓度变化，如vWA，可能会引起其他基因座信号强度降低。(2)复合体系中所有基因座引物浓度同时发生变化，所有基因座扩增均受到影响。例如引物浓度减半，所有基因座信号均降低；引物浓度增加一倍，所有基因座信号增加，引物二聚体产生的杂带出现频率也增加。(3)从复合体系中减去任一基因座引物，对其他基因座扩增没有明显影响。
3．dNTP 在PCR反应中，dNTP与Mg2﹢定量结合，最适dNTP浓度与Mg2﹢浓度直接相关。在标准反应体系中，dNTP总浓度为800μmol／L(每一个dNTP浓度为200μmol／L)。dNTP浓度减少，聚合酶链反应底物不足，所有扩增产物减少，减少程度随基因座不同而不同，dNTP浓度超过反应最佳水平时，所有基因座扩增效率明显降低，这可能是由于游离的M g2﹢不断减少，聚合酶活性降低了。
4．Taq聚合酶浓度50μl反应体系中Taq酶用量为1.0—2.5u，当反应体系中Taq酶量大于2.5u，非特异带扩增就会增加；少于1.0u PCR特异产物较少或甚至没有。
5．模板DNA浓度模板DNA浓度减少，扩增产量降低，不同基因座减少程度不同。模
案例分析3 作业要求 1. 根据所提供的资料进行分析判断。上述资料中未提及或未做特别说明的均视为无异常。 2. 答案书写时分别出具法医病理学诊断、分析说明和鉴定意见，案情材料等不用在重复抄写。 3. 法医病理学诊断：资料中涉及的损伤或病变均应以法医病理学诊断方式列出。 4. 分析说明：要求依据所提供的材料对死亡原因进行论证。论述力求条理清楚，观点明确，层次分明。（提示：本案例涉及中毒与疾病分析，请查阅吗啡、海洛因中毒资料） 5. 鉴定意见：对死亡原因进行鉴定。（提示：包括死亡原因和死亡机制，要求简明、扼要）。 注意： 1.发现存在结果（分析说明）串通情况的，按“不通过”结果处理。 2．最后一次课结束时由各班班长将本班学生的名单及答案一并交给上课老师。未交答案者视为本课程考核不通过。 3．学生学号逐一写出，并记录应交人数、实交人数、未交人的原因，请留下班长的联系电话。所交的答案要按照学号从小到大顺序排列。 一、案情简介 死者李某，男，36岁。某日21:50许，被其朋友发现突然昏倒在某旅馆卫生间内，呼之不应，遂对其进行胸外按压并拨打“120”急救。约20分钟后“120”到达现场，医生检查发现：口唇发绀，脉搏触不到，呼吸、心跳停止，两侧瞳孔缩小，直径均为0.2cm，对光反射消失。予胸外按压、心内注射强心针，抢救无效后，宣布临床死亡。 据调查材料反映，李某既往有吸毒史3年，生前患有艾滋病。曾因犯罪服刑1年，于死亡前1月余刑满释放。死亡前7天因纠纷被他人用热水瓶砸伤右上肢及腰背部并致局部烫伤，伤后感局部疼痛，无其它不适。死亡当日8:30许与其朋友外出。现死者家属怀疑李某被伤害致死，故申请尸体解剖检验。
第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。 第一节PCR技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。 一、实验原理 PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。第一，按照欲检测的DNA的5＇和3＇端的碱基顺序各合成一段长约18～24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：①引物的长度保持在18～24bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；②GC含量应保持在45～60%之间；③5＇和3＇端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。
法医培训心得体会 【篇一：学法医学心得】 学法医学心得体会 作为一名医学生，大二的时候已经学习了《病例解剖学》，观察了 各种脏器的病变标本以及病例切片，并且在学期末一次偶然的机会 亲眼目睹了一次尸体解剖过程，是由我的代教老师完成的，当时我 就对法医学产生了极大地兴趣，为了进一步学习，期末选课是我选 修了《法医学》这门课程，通过一学期的学习收获了很多。 通过老师的讲解，初步认识了现代法医学，了解了法医学的发展历史、主要的研究内容以及司法鉴定程序和司法鉴定人必备的素质等。课堂上看了许多老师为我们搜集的图片，学习了死亡的定义、尸体 死后的变化以及死亡时间的大概推测等知识。 上完课后我对法医学有了初步的认识，法医学（forensic medicine）是应用医学、生物学、化学和其他自然科学理论和技能解决法律问 题的科学，用于侦察犯罪和审理民事或刑事案件提供证据。法医学 是应用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦查、审判实践中涉及的医学问题的一门科学。法医学是一门应用医学， 又相当于法学的一个分支。医学为制定法律提供依据，为侦查、审 判提供科学证据，因此法医学是联结医学与法学的一门交叉科学。 现代法医学分基础法医学和应用法医学两部分：前者研究法医学的 原理和基础：后者则运用法医学的理论和方法，解决司法、立法和 行政上的有关问题。这包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等 案件的鉴定，为侦查、审判提 供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术以及解 决由此带来的社会问题的法律提供依据；我国刑事诉讼法一贯坚持“必须以事实为根据，以法律为准绳”“重证据，重调查研究，不轻信 口供”的原则，从而保证准确、及时地查明犯罪事实，正确应用法律，惩罚犯罪分子，保障无罪的人不受刑事追究。法医学鉴定结论作为 各种诉讼活动中重要的科学证据，在刑事、民事和行政诉讼等案件 的侦查、审判过程中发挥着重要的作用。另外通过对非正常死亡的 尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾害事故的防治及行政处理。 法医学的研究对象包括人(活体、尸体)和物。法医学的研究方法有医 学的、生物学的、化学的和物理学的四类。而其涉及的内容有死亡 与尸体现象检验，各种机械性窒息的发生机制、征象、后果和检验
基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA， 然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个 相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种 因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以 芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对 表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空 间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在 细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一 特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因 产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的 运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几 种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分 析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查 基因表达的应用。8 f3 f- |2 L) K) b7 ]- ~- | RT-PCR检测基因表达的问题讨论
关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。 7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, { 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。
作为一位医学生，大二的时候已学习了《病例解剖学》，观察了各种脏器的病变标本和病例切片，并且在学期末一次偶然的机会亲眼目击了一次尸体解剖过程，是由我的代教老师完成的，当时我就对法医学产生了极大地爱好，为了进一步学习，期末选课是我选修了《法医学》这门课程，通过一学期的学习收获了很多。通过老师的讲授，初步熟悉了现代法医学，了解了法医学的发展历史、主要的研究内容和司法鉴定程序和司法鉴定人必备的素质等。课堂上看了很多老师为我们搜集的图片，学习了死亡的定义、尸体死后的变化和死亡时间的大概推测等知识。上完课后我对法医学有了初步的熟悉，法医学（forensicmedicine）是利用医学、生物学、化学和其他自然科学理论和技能解决法律题目的科学，用于侦察犯法和审理民事或刑事案件提供证据。法医学是利用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦察、审判实践中触及的医学题目的一门科学。法医学是一门利用医学，又相当于法学的一个分支。医学为制定法律提供根据，为侦察、审判提供科学证据，因此法医学是联结医学与法学的一门交叉科学。现代法医学分基础法医学和利用法医学两部份：前者研究法医学的原理和基础：后者则应用法医学的理论和方法，解决司法、立法和行政上的有关题目。这包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等案件的鉴定，为侦察、审判提供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术和解决由此带来的社会题目的法律提供根据；我国刑事诉讼法一向坚持必须以事实为根据，以法律为准绳重证据，重调查研究，不轻信口供的原则，从而保证正确、及时地查明犯法事实，正确利用法律，惩罚犯法份子，保障无罪的人不受刑事追究。法医学鉴定结论作为各种诉讼活动中重要的科学证据，在刑事、民事和行政诉讼等案件的侦察、审判过程当中发挥侧重要的作用。另外通过对非正常死亡的尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾难事故的防治及行政处理。法医学的研究对象包括人(活体、尸体)和物。法医学的研究方法有医学的、生物学的、化学的和物理学的四类。而其触及的内容有死亡与尸体现象检验，各种机械性窒息的发生机制、征象、后果和检验方法，机械性损伤的分类、构成机制，各种猝死与自杀、他杀引发的忽然死亡，医疗事故的鉴定、医疗工作中的刑事和民事责任，法医人类学的个人辨认等。12老师还讲到了猝死的定义和猝死的多种病发缘由，让我对猝死有了很深入的理解，通过老师的讲授，我知道了猝死的最直接的缘由是在血汗管系统发现病变,即使局部解剖病灶不在心脏或大血管。大量的脑出血、蛛网膜下腔出血、宫外孕破裂、咯血、呕血和肺动脉栓塞,比如,合并存在心脏病和动脉瘤而引发血管系统猝死。还给我们结合实例讲了不同机制下的猝死缘由，并谈到法医在检验死因的重要性，其中有关于各种血汗管疾病的猝死的诱因。虽然提到的死因众多,但大多数死因继发血汗管病,主要是冠状动脉粥样硬化。忽然的、出乎意料的死亡时间阶段的不同,解释了为何有些死因找不到,或没有代表性。肺炎、脑膜炎、败血症和休克经常死前症状延迟1小时以上。猝死的典型缘由,诸如主动脉瓣狭窄或冠状动脉起始部的异常,不常被发现。猝死通常发生在成年男性患者,在家里、休息时,剧烈活动时很少发生。最近的研究提示,习惯性的精力消耗能消除精力开释时发生猝死的危险。心肌肥大是忽然死于冠脉病的常见现象。
中毒 郭庆玲在医疗过程中死亡已构成医疗事故? 一、案情摘要 1988年5月31日零时许，郭庆玲（女，8岁），因?阵发性脐周疼痛?由其父亲郭泅光带到××省儿童医院就诊，由门诊主治医师孙××接诊，诊断为?肠虫症?，于零时45分收住内科三病区，医嘱：5％颠茄合剂l00ml，4.8％新诺明合剂100ml，vitC及APC片等，将处方给郭泅光外甥去药房取药，药房护士告知其服药方法。早7时许，孙×共医师查房时，见郭庆玲仍喊肚子疼，又见其服药不多，即嘱其?多喝点?后离去，郭泅光遵医嘱加大服药量。 早班护士发现夜班医师医嘱未补处方，即让实习医师补了一个处方，而下午又一护士将处方交与郭泅光取药，下午3时郭泅光去药房取药，取回后同房患者家属说和晚上所开药为同一药，郭泅光即将晚上所剩药物至6时左右全部给郭庆玲服完。早10时左右患儿颜面潮红。晚7时30分患儿开始出现烦燥，视物不清，问话不答，10分钟后出现抽风，两眼上翻，瞳孔约6mm大小，光反应迟钝，下午9时50分出现呼吸暂停，昏迷。6月1日晨5时50分测体温38．2℃，在使用呼吸机，抗阿托品等治疗下，患儿于6月2日神志转清，但双肺出现水泡音，6月4日右侧肢体软瘫，6月5日下午面色转灰，又陷昏迷，血压下降，体温仍高。6月7日病情恶化，呼吸困难加重，肺部×音增多，经抢救无效于6月9日下午9时许死亡。在抢救过程中，于6月1日、6日、8日三次胸透均报告有肺水肿，（6月1日有一次x一线检查报告无肺水肿）。（摘自西宁市中院案卷所附郭庆玲门诊及住院病历）。 1988年6月28日，青海省公安厅9处对郭庆玲尸体进行了解剖检验，解剖中发现：距回音部132cm处的回肠有一长9cm，周径13cm的，壁上有手术缝线的憩室，憨室内有食物残渣贮留；双肺呈暗红色，质地变实，浮扬试验阴性，支气管分支处有淡红色泡沫状液体，肺切面边缘外翻。组织学检查，肺包膜不增厚，大部分肺泡间隔增宽，有单核，中性白细胞浸润，肺泡腔内有大量白细胞浸润，并有嗜伊红液体渗出，部分肺泡有透明膜形成，部分支气管分支粘膜上皮脱落，管壁、管腔及其周边有上述炎细胞浸润。鉴定结论?郭庆玲系颠茄合剂中毒后并发肺炎死亡。? l988年9月24日经××省医疗事故鉴定委员会鉴定结论为：颠茄中毒后在抢救过程中并发了肺炎，导致死亡的直接原因是肺炎，不属医疗事故。 二、分析意见 受××市中级人民法院委托，我们审阅了全部的案卷材料，并复查了11张组织学切片，现将有关问题分析如下： （一）关于郭庆玲的死因问题 郭庆玲从5月31日晚零时45分入院至早7时孙××医师查房时，几乎未服颠茄合剂（见中级法院案卷，孙××谈话笔录），而到下午6时许，已将100mI颠茄合剂全部服完。即患儿于11小时内服完几乎100ml颠茄合剂（三日量），足以引起中毒。5月31日上午10时左右患儿额面潮红，下午7时30分出现烦燥，谵语，视物不清，10分钟后出现抽风，双瞳孔散大，光反应迟钝，血压115／95mmHg，心率l00次／分，符合典型颠茄合剂中毒症状和体征。在中毒后抢救过程中出现肺炎、肺水肿，这在胸透及尸体解剖时均已证实。患儿是以?阵发性脐周疼痛?为主诉就诊，病历中末发现患儿在服药前存在呼吸系统疾病的证据，正是因为中毒才使肺血循环紊乱而出现肺水肿，同时毒物（颠茄合剂）抑制呼吸道粘膜分泌，使肺局部抵抗力下降，肺泡中的蛋白液体的渗出，又为细菌的繁殖生长提供了良好的环境，加之在抢救过程中气管插管，增加了肺部感染的机会，终致肺炎。由此可见，没有中毒也就不会发生肺炎，肺炎是颠茄中毒后的并发症，中毒是患儿死亡的主要死因。
万方数据
万方数据
万方数据
基因表达系列分析技术及其应用 作者：党冬梅， 魏晓萍， 惠起源， 符兆英 作者单位：延安大学医学院,陕西,延安,716000 刊名： 延安大学学报（医学科学版） 英文刊名：JOURNAL OF YANAN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2005，3(1) 被引用次数：0次 参考文献(8条) 1.Velculescu E查看详情 1995 2.Menssen A.Hermeking H Characterization of the c-MYC regulated transcriptome by SAGE:Identification and analysis of target genes 2002(09) 3.Levens D Disentangling the MYC web 2002(09) 4.Matsumura H.Nirasawa S.Terachi R Transcript profiling in rice (Oryzn sation L.) seedlings using serial analysis of gene expression 1999(06) 5.Margulies E H.Kardia S L R.Innis J W查看详情 2001 6.Du Z.Scott A D.May G D Expression profiling of UV-and Gamma-irradiated Ambidopsis plantlets through serial analysis of gene expression 2001 7.Inadera H.Hashimot0 S.Dongi H Y WISP-2 as a novel estrogen-responsive gene in human breast cancer cell 2000(01) 8.Xu L L.Shanmugan N.Sesterhenn I A A novel androgen regulated gene,PMEPAI.Iocated on chromosome 20113 exhibit high level expression in protstate 2000(03) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/0710100242.html,/Periodical_yadxxb-yxkxb200501045.aspx 授权使用：西安交通大学(xajtdx)，授权号：fa53fce6-7ae2-4ac8-b779-9e9900a7d328 下载时间：2011年3月1日
2020智慧树，知到《法医病理学案例分析》章节测试【完整答案】 第一章单元测试 1、多选题： 以下哪些是法医师承担的责任? 选项： A:揭示死亡规律 B:帮助恢复健康 C:发现伤残规律 D:发现犯罪线索 答案: 【揭示死亡规律;发现伤残规律;发现犯罪线索】 2、多选题： 属于暴力性死亡的有? 选项： A:自杀死 B:病理性死亡 C:他杀死 D:意外死 答案: 【自杀死;他杀死;意外死】 3、多选题： 死亡时间推断具有哪些意义? 选项：
A:认定/排除嫌疑对象 B:确定案发时间 C:缩小侦察范围 D:阐明案件性质 答案: 【认定/排除嫌疑对象;确定案发时间;缩小侦察范围;阐明案件性质】 4、多选题： 开设本课程的目的在于： 选项： A:建立风险防范思维 B:提升学生的健康意识 C:帮助学生成为一名法医师 D:普及法医学常识 答案: 【建立风险防范思维;提升学生的健康意识;普及法医学常识】 5、多选题： 关于尸斑，以下说法正确的是? 选项： A:浸润期改变体位，能形成新的尸斑 B:扩散期尸斑指压褪色，移指复现 C:尸斑颜色可提示死因 D:沉降期尸斑下坠的血液局限于血管内
答案: 【尸斑颜色可提示死因;沉降期尸斑下坠的血液局限于血管内】 第二章单元测试 1、多选题： 法医因果关系学有哪些基本理论? 选项： A:论证 B:循证 C:确证 D:取证 答案: 【论证;循证;取证】 2、多选题： 关于法医因果关系学，以下说法正确的是? 选项： A:必须遵循普遍性原则和科学性原则 B:研究原因力分析方法 C:研究各种因素产生和造成人身伤亡后果的因果关系 D:构建唯一性因果关系证据链的理论体系 答案: 【必须遵循普遍性原则和科学性原则;研究原因力分析方法;研究各种因素产生和造成人身伤亡后果的因果关系;构建唯一性因果关系证据链的理论体系】 3、多选题：
基因差异表达技术 真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。 由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display，DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。 一、差别杂交与扣除杂交 差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。 （一）差别杂交 从本质上讲，差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达
法医学课程心得体会 Jenny was compiled in January 2021
法医学课程心得体会 这学期我们开了法医学这门选修课，之前由于经常看一些破案类的电视剧对法医学的课程十分的期待，终于迎来了开课，法医学老师在讲课时常常结合具体的事例给我们讲解，使得本应该枯燥或是严肃的课堂充满了轻松的气息，虽然有的图片比较血腥或是令普通人难以接受，但是作为法医学的例子，它们鲜活的向我们传达了法医的高超技能、智慧、与知识，令我对揭露犯罪真相的法医十分崇拜。 法医学是应用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦查、审判实践中涉及的医学问题的一门科学。法医学为制定法律提供依据，为侦查、审判提供科学证据，因此法医学是连接医学与法学的一门交叉科学。现代法医学分基础法医学和应用法医学两部分：前者研究法医学的原理和基础：后者则运用法医学的理论和方法，解决司法、立法和行政上的有关问题，包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等案件的鉴定，为侦查、审判提供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术以及解决由此带来的社会问题的法律提供依据；另外通过对非正常死亡的尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾害事故的防治及行政处理。 随着科技的进步，随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。目前法医基本需要做以下工作共五个部分。尸体：死亡时间、死亡原因、死亡方式、作案工具；活体：损伤程度、伤残等级；物证：如现场一堆血，判断血是谁的，是男的还是女的，怎么形成的；人类学：通过物件（如骨头）判定年龄、身高、性别；另外还有法医精神病学。 现举一例，说说我对法医学在医疗因素介入的亲子鉴定中的意义的看法。 DNA还傻女一个清白高科技让歹徒认罪伏法 一个因小患乙型脑炎留下发育迟滞后遗症的弱智傻女，竟被多人，多次强奸，致使她怀孕。在公安部门多次破案过程中，在证据不足，无法定案的情况下，有什么办法能还蒙受不白之冤者一个清白有什么办法能将案发时间过长，又毫无证据的罪犯送上法庭西安交通大学法医中心运用国际尖端
【案例1】 某市公安局一日按群众报告，称城郊小河中发现一具无名女尸。为查明身源及死因，法医检查尸体时见尸体已高度腐败呈巨人观状，全身皮肤呈污秽绿竭色，尸僵已全部缓解。上身穿一件短袖汗衫、下身穿一弹力三角裤，双脚穿尼龙短丝袜，不着鞋，衣服上无损伤。发长25cm，结结双辫，头部皮肤外表未检见损伤，头皮下无出血、颅顶骨无骨折，剖开见脑组织已腐败，未见明显出血征象。双眼结膜少许针头大小出血点，鼻腔有较多已发臭的暗红色液体流出。舌尖位于上下齿列之间，左侧口颊粘膜有一小破损，周围有1cm×1.5cm大小暗红色斑、牙齿无松脱。颈部喉结下方有一根麻绳缠绕在耳下15cm处打一死结，颈部皮肤未见明显出血，但右侧下颌下缘皮肤上有两处擦伤，分别大小 2cm×1cm和2.5cm×0.8cm，伴轻度皮下出血。颈部索沟边缘皮下有轻度出血征象，颈前肌肉和甲状软骨、舌骨未见骨折及出血。胸腹部皮肤外表未见明显损伤，右髋前上嵴皮肤有1.5cm×0.8cm大小轻度擦伤和出血，双手背皮肤小块不规则擦伤，出血不明显。剖验见肋骨及四肢无骨折。心腔血暗红色流动性，双肺肿胀明显，肺膜下有少数出血斑，切面淤血可见泡沫性液体流出，气管及主支气管内有泡沫性液体，胸腹腔内脏未检见损伤。胃内容物为半消化状食物，未见异物及异味。子宫大如鹅蛋磊小，腔内有一约2个多月的胎儿。阴道内无异物，处女膜残痕尚观。取肺、肝及肾做硅藻检查，查出与现场水样中同类硅藻少量，胃内容物血液常规毒物分析阴性。后查明死者是附近一酒店外来打工妹，已失踪一周。年龄23岁，未婚。生前接交男女朋友很多，但尚未恋爱。失踪前几天，见其较悲观，曾有人见她背地哭泣，不肯告其原因。 请分析死亡原因及死亡方式，并提出具体根据。 答：死亡原因为溺死（3分），死亡方式为自杀。（2分） ⑴死亡原因分析①死者颈部见一麻绳勒索，并打一死结，但颈部皮肤仅有少量擦伤，颈部肌肉未见出血，甲状软骨和舌骨未见骨折，可推断勒颈的暴力较轻，不符合他勒致死的特征，可排除他勒致死。②双眼结膜少许针头大小出血点，为窒息征象。③气管、主支气管内泡沫性液体为溺死征象。④
１例机械性窒息案例的法医学分析 【摘要】本文介绍一宗杀人抛尸案，该案例的死者是在昏迷状态下被勒颈致机械性窒息死亡，尸体现象明显，但索沟周围未见抵抗伤，这在勒死的他勒案件中较少见，提示他勒中索沟周围无抵抗伤时，应考虑勒颈前可能有致死者昏迷的作案过程，可望为今后的法医工作提供借鉴。 【关键词】机械性窒息;勒死 在机械性窒息中，勒死的案件虽然没有缢死和扼死多见，但因其案件性质较复杂，必须引起高度重视。勒死是以绳索类物缠绕颈项部，在绳索交叉的两端，由自身的体重以外的其他力量，使绳索类物勒紧并压迫颈项部而导致窒息死亡。勒死的机制，包括压迫呼吸道、压迫颈部血管和压迫迷走神经以及颈动脉窦引起的反射性心跳停止三方面。勒死的法医学鉴定主要根据颈部勒颈形成的有生活反应的索沟，相应的皮下组织以及喉头软骨的损伤和出血，全身（尤其索沟以上的颈部及头面部）比较明显的窒息现象等。根据现场勘查分析、系统尸体检验，结合案情调查并同时排除其他致死原因等，勒死一般不难确定。 1 尸体检验 1．1 一般情况死者头东脚西仰卧于地面上。上身赤裸；下身穿红色内裤，裆部织有白花，后部内卷至肛门处；赤脚。尸长163 cm，发棕黄色，长25 cm 不等，发根部呈黑色长4 cm。尸僵存在于全身各大关节，已开始缓解；尸斑分布于背部及胸部，背部指压不褪色，胸部指压稍褪色。 1．2 尸表检验头皮未见明显外伤，颅骨未触及骨擦感。右耳廓外上缘有一1．3×0．5 cm擦挫伤，耳廓可见血迹。颜面部淤血肿胀伴散在出血点，双眼闭合，角膜中度混浊，双瞳孔等大，直径0．5 cm，睑结膜点片状出血。口鼻腔少量血性液体，舌尖抵于两齿间，口唇及唇黏膜未见损伤。颈前有自甲状软骨下缘水平向两侧延伸的索沟，颈左侧至颈椎脊突左侧3 cm处中断，其中左乳突正下方处索沟方向可见改变，并有皮下出血；颈右侧至颈椎脊突右侧6 cm处中断，索沟总长26 cm，最宽处0．8 cm，深约0．2 cm，索沟处表皮剥脱，呈皮革样化。索沟内可见白色绒毛状物。左肩峰前有直径0．2 cm色素痣。左肩胛处有9．6×0．7 cm表皮擦伤，无生活反应，左肩胛内侧有1．5×0．6 cm小片状表皮擦伤，右肩胛内侧有3．0×2．4 cm条状表皮擦伤，右肩胛下有5．5×0．3 cm条状表皮擦伤，方向自左下向右上。左腕背侧腕纹上 3 cm处有两处等大直径为0．7×0．8 cm的陈旧疤痕。双手十指紫绀明显。胸腹部未见损伤，阴部未见损伤，处女膜5点处陈旧破裂达基底部。余未见异常。 1．3 解剖检验冠状切开头皮，见左颞顶部有13．5×10．0 cm头皮下出血；右颞部有6．3×5．5 cm头皮下出血，对应部位颞肌有6．0×5．5 cm出血。分离
SAGE 技术 MRNA 结合到微珠子上(Microscopic Bead and mRNA) mRNA 转录成DNA(mRNA binds to bait and is copied into DNA)
用酶切开DNA的一小段(An enzyme cuts the DNA) 另一个酶定在DNA末端以便切下一小段(An enzyme locks onto the DNA and cuts off a short tag),这一小段就被视为这个基因的标签 两个标签连在一起(Two tags are linked together)
在末端的定位分子被切掉(Enzymes cut off the "Docking Molecules") 都连成一条线(Di-Tags are combined into large concatemers)
DNA上所携带的遗传信息，需要通过RNA为中介体，合成出组织和正常生理功能所需要的蛋白质，这个过程被称为基因的表达。在生物体中不同的组织和器官所表达的基因群是不一样的，我们把基因群的表达状况称为基因表达谱。目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE）。基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。 SAGE技术为Genzyme公司所拥有的专利技术。其技术简介如下： SAGE技术得以建立的理论基础 首先，一段来自于任一转录本特定区域的"标签"（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个9碱基的序列能有49=262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。 第二，如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行
学习《法医学》感想 曾想通过选修课学点法律保护常识，所以我选择了《伤害案件及其鉴定》，当我怀着期盼的心情来上第一堂课时，发到我手中的书却写着《法医学》，我顿时只有一个感觉：我好像被欺骗了！我是理科生，怎么学这个法医，这好像对我没什么用处！可后来我却改变了这种想法，因为它至少让我学会了一种东西，那就是不再惧怕死亡和尸体！ 徐老师在讲课时常常结合具体的事例给我们讲解，使得本应该枯燥或是严肃的课堂充满了轻松的气息，虽然有的图片比较血腥或是令普通人难以接受，但是作为法医学的例子，它们鲜活的向我们传达了法医的高超技能，智慧，与知识，令我对揭露犯罪真相的法医十分崇拜。在视频学习中，法医的现场解剖，让我知道了人体是如何被解剖的，让我对人体的内部结构有了更深的了解，知道了人体内脏身前和死后的区别，这虽然比图片更加让人难以接受，但我慢慢适应了这样的视屏内容，好像觉得死也没那么可怕。同时我也在思考：虽然解剖在为生者找到死者死亡真相，但这对于死者来说这何不是一种残忍，如果有一天我身边的人也要被解剖，我会不会让他去被解剖，因为我我无法接受在为死者缝合时在肚子里填满卫生纸。另一方面我觉得法医应该比普通医师更具备一些高尚的医德，这样对于死者是尊重，对于生者是安慰！
当然学习这门课，让我对法医有了更深的了解，法医学是应用医学、生物学、化学和其他自然科学理论和技能解决法律问题的科学，用于侦察犯罪和审理民事或刑事案件提供证据。法医学是应用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦查、审判实践中涉及的医学问题的一门科学。法医学是一门应用医学，又相当于法学的一个分支。医学为制定法律提供依据，为侦查、审判提供科学证据，因此法医学是联结医学与法学的一门交叉科学。现代法医学分基础法医学和应用法医学两部分：前者研究法医学的原理和基础：后者则运用法医学的理论和方法，解决司法、立法和行政上的有关问题。这包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等案件的鉴定，为侦查、审判提供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术以及解决由此带来的社会问题的法律提供依据；我国刑事诉讼法一贯坚持“必须以事实为根据，以法律为准绳”“重证据，重调查研究，不轻信口供”的原则，从而保证准确、及时地查明犯罪事实，正确应用法律，惩罚犯罪分子，保障无罪的人不受刑事追究。法医学鉴定结论作为各种诉讼活动中重要的科学证据，在刑事、民事和行政诉讼等案件的侦查、审判过程中发挥着重要的作用。另外通过对非正常死亡的尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾害事故的防治及行政处理。法医学的研究对象包括人(活体、尸体)和物。法医学的研究方法有医学的、生物学的、化学的和物理学的四类。而其涉及的内容有死亡与尸体现象检验，各种机械性窒息的发生机制、征象、后果和检验方法，机械性损伤的分类、形成机制，各种猝死与自杀、他杀引起
一、案情摘要 1988年5月31日零时许，郭庆玲（女，8岁），因“阵发性脐周疼痛”由其父亲郭泅光带到××省儿童医院就诊，由门诊主治医师孙××接诊，诊断为“肠虫症”，于零时45分收住内科三病区，医嘱：5％颠茄合剂l00ml，4．8％新诺明合剂100ml，vitC及APC片等，将处方给郭泅光外甥去药房取药，药房护士告知其服药方法。早7时许，孙×共医师查房时，见郭庆玲仍喊肚子疼，又见其服药不多，即嘱其“多喝点”后离去，郭泅光遵医嘱加大服药量。 早班护士发现夜班医师医嘱未补处方，即让实习医师补了一个处方，而下午又一护士将处方交与郭泅光取药，下午3时郭泅光去药房取药，取回后同房患者家属说和晚上所开药为同一药，郭泅光即将晚上所剩药物至6时左右全部给郭庆玲服完。早10时左右患儿颜面潮红。晚7时30分患儿开始出现烦燥，视物不清，问话不答，10分钟后出现抽风，两眼上翻，瞳孔约6mm大小，光反应迟钝，下午9时50分出现呼吸暂停，昏迷。6月1日晨5时50分测体温38．2℃，在使用呼吸机，抗阿托品等治疗下，患儿于6月2日神志转清，但双肺出现水泡音，6月4日右侧肢体软瘫，6月5日下午面色转灰，又陷昏迷，血压下降，体温仍高。6月7日病情恶化，呼吸困难加重，肺部×音增多，经抢救无效于6月9日下午9时许死亡。在抢救过程中，于6月1日、6日、8日三次胸透均报告有肺水肿，（6月1日有一次x一线检查报告无肺水肿）。（摘自西宁市中院案卷所附郭庆玲门诊及住院病历）。 1988年6月28日，青海省公安厅9处对郭庆玲尸体进行了解剖检验，解剖中发现：距回音部132cm处的回肠有一长9cm，周径13cm的，壁上有手术缝线的憩室，憨室内有食物残渣贮留；双肺呈暗红色，质地变实，浮扬试验阴性，支气管分支处有淡红色泡沫状液体，肺切面边缘外翻。组织学检查，肺包膜不增厚，大部分肺泡间隔增宽，有单核，中性白细胞浸润，肺泡腔内有大量白细胞浸润，并有嗜伊红液体渗出，部分肺泡有透明膜形成，部分支气管分支粘膜上皮脱落，管壁、管腔及其周边有上述炎细胞浸润。鉴定结论“郭庆玲系颠茄合剂中毒后并发肺炎死亡。” l988年9月24日经××省医疗事故鉴定委员会鉴定结论为：颠茄中毒后在抢救过程中并发了肺炎，导致死亡的直接原因是肺炎，不属医疗事故。 二、分析意见 受××市中级人民法院委托，我们审阅了全部的案卷材料，并复查了11张组织学切片，现将有关问题分析如下： （一）关于郭庆玲的死因问题 郭庆玲从5月31日晚零时45分入院至早7时孙××医师查房时，几乎未服颠茄合剂（见中级法院案卷，孙××谈话笔录），而到下午6时许，已将100mI颠茄合剂全部服完。即患儿于11小时内服完几乎100ml颠茄合剂（三日量），足以引起中毒。5月31日上午10时左右患儿额面潮红，下午7时30分出现烦燥，谵语，视物不清，10分钟后出现抽风，双瞳孔散大，光反应迟钝，血压115／95mmHg，心率l00次／分，符合典型颠茄合剂中毒症状和体征。在中毒后抢救过程中出现肺炎、肺水肿，这在胸透及尸体解剖时均已证实。患儿是以“阵发性脐周疼痛”为主诉就诊，病历中末发现患儿在服药前存在呼吸系统疾病的证据，正是因为中毒才使肺血循环紊乱而出现肺水肿，同时毒物（颠茄合剂）抑制呼吸道粘膜分泌，使肺局部抵抗力下降，肺泡中的蛋白液体的渗出，又为细菌的繁殖生长提供了良好的环境，加之在抢救过程中气管插管，增加了肺部感染的机会，终致肺炎。由此可见，没有中毒也就不会发生肺炎，肺炎是颠茄中毒后的并发症，中毒是患儿死亡的主要死因。 （二）关于郭庆玲腹疼的原因 在解剖中发现：距回盲部132cm处的回肠有一长9cm，周径13cm的向肠壁一侧突出的带有手术缝线的憨室，其内有食物残渣存留，说明腹疼原因是因为回肠憨室，而非肠虫症。
法医学课程心得体会 这学期我们开了法医学这门选修课，之前由于经常看一些破案类的电视剧对法医学的课程十分的期待，终于迎来了开课，法医学老师在讲课时常常结合具体的事例给我们讲解，使得本应该枯燥或是严肃的课堂充满了轻松的气息，虽然有的图片比较血腥或是令普通人难以接受，但是作为法医学的例子，它们鲜活的向我们传达了法医的高超技能、智慧、与知识，令我对揭露犯罪真相的法医十分崇拜。 法医学是应用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦查、审判实践中涉及的医学问题的一门科学。法医学为制定法律提供依据，为侦查、审判提供科学证据，因此法医学是连接医学与法学的一门交叉科学。现代法医学分基础法医学和应用法医学两部分：前者研究法医学的原理和基础：后者则运用法医学的理论和方法，解决司法、立法和行政上的有关问题，包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等案件的鉴定，为侦查、审判提供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术以及解决由此带来的社会问题的法律提供依据；另外通过对非正常死亡的尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾害事故的防治及行政处理。 随着科技的进步，随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。目前法医基本需要做以下工作共五个部分。尸体：死亡时间、死亡原因、死亡方式、作案工具；活体：损伤程度、伤残等级；物证：如现场一堆血，判断血是谁的，是男的还是女的，怎么形成的；人类学：通过物件（如骨头）判定年龄、身高、性别；另外还有法医精神病学。 现举一例，说说我对法医学在医疗因素介入的亲子鉴定中的意义的看法。 DNA还傻女一个清白高科技让歹徒认罪伏法 一个因小患乙型脑炎留下发育迟滞后遗症的弱智傻女，竟被多人，多次强奸，致使她怀孕。在公安部门多次破案过程中，在证据不足，无法定案的情况下，有什么办法能还蒙受不白之冤者一个清白？有什么办法能将案发时间过长，又毫无证据的罪犯送上法庭？西安交通大学法医中心运用国际尖端的法医DNA技术，通过从犯罪嫌疑人身上提取DNA进行检测鉴定，确凿可信的高科技使案件真相大白。一例整整拖了一年零10个月的强奸案，耗费了公安干警大量的人力、财力、心血和时间，终于在西安交通大学法医中心的法科学技术鉴定书前，让罪犯受到了应有的法律制裁！ （一）
生命是永恒不断的创造，因为在它内部蕴含着过剩的精力，它不断流溢，越出时间和空间的界限，它不停地追求，以形形色色的自我表现的形式表现出来。 －－泰戈尔 学法医学心得体会 曾经看过《少年包青天》、《大宋提刑官》和《神探狄仁杰》，很喜欢里面主人公们的思维方式，他们聪明的脑袋总是可以找到案件的真相，他们通过检验尸体查找证据以及逻辑关系推理本领让我佩服不已。出于对剧情里的法医（主人公）的崇拜，当看见可以选修《法医学》这门课程时，我毫不犹豫的选择了它。这门课让我初步的认识了现代法医学，知道了法医学的发展历史、主要的研究内容等等。原以为法医只研究尸体，听了老师的讲课以后，才明白活人也在法医的研究对象范畴里面，而它的内容也不仅仅局限于验尸。看了许多的图片，懂得了许多死亡的定义与迹象。在看过的电视剧里面，警察局里新到的法医第一次看见现场时候都会恶心，以前很不明白为什么，至于吗？有那么恐怖吗？现在看了那些图片，才理解了他们的心情。同时也让我对法医们更是由衷地升起一股敬佩之情！ 上完课后我对法医学有了初步的认识，法医学（forensic medicine）是应用医学、生物学、化学和其他自然科学理论和技能解决法律问题的科学，用于侦察犯罪和审理民事或刑事案件提供证据。法医学是应用医学及其他自然科学的理论与方法，研究并解决立法、侦查、审判实践中涉及的医学问题的一门科学。法医学是一门应用医学，又相当于法学的一个分支。医学为制定法
律提供依据，为侦查、审判提供科学证据，因此法医学是联结医学与法学的一门交叉科学。现代法医学分基础法医学和应用法医学两部分：前者研究法医学的原理和基础：后者则运用法医学的理论和方法，解决司法、立法和行政上的有关问题。这包括受理杀人、伤害交通事故、亲子鉴定等案件的鉴定，为侦查、审判提供线索和证据，为制定死亡判定、脏器移植、现代生殖技术以及解决由此带来的社会问题的法律提供依据；我国刑事诉讼法一贯坚持“必须以事实为根据，以法律为准绳”“重证据，重调查研究，不轻信口供”的原则，从而保证准确、及时地查明犯罪事实，正确应用法律，惩罚犯罪分子，保障无罪的人不受刑事追究。法医学鉴定结论作为各种诉讼活动中重要的科学证据，在刑事、民事和行政诉讼等案件的侦查、审判过程中发挥着重要的作用。另外通过对非正常死亡的尸体检验来发现传染病，进行中毒和灾害事故的防治及行政处理。法医学的研究对象包括人(活体、尸体)和物。法医学的研究方法有医学的、生物学的、化学的和物理学的四类。而其涉及的内容有死亡与尸体现象检验，各种机械性窒息的发生机制、征象、后果和检验方法，机械性损伤的分类、形成机制，各种猝死与自杀、他杀引起的突然死亡，医疗事故的鉴定、医疗工作中的刑事和民事责任，法医人类学的个人识别等。 其中老师讲到对猝死的机制让我对猝死有了很深刻的理解，我查阅了些资料说到猝死的官方定义在与俗称差别很大,定义