Introduction (1 class hours）
1. Conception of molecular biology分子生物学的概念
A discipline for the study of law of living beings genetics and variationat molecular level. 就是肉眼能看到的生物体的特性characteristic、现象Phenomena 从分子水平上进行阐明。这个定义范围广，与生物化学概念不好区分。另外definition：the study of gene structure and function at themolecular level. Main research contents: DNA replication, transcription,translation, regulation.
2. Brief history of molecular biology分子生物学简史
~1847 年，Schleiden and Sckwan提出Theory of cell. 这是19 世纪三大发现之一。
~Mendel’s laws of inheritance, traits inheritance 性状遗传（性状3:1）。
~Morgan’s theory of gene, traits 和gene 联系起来。
~1953 年，Watson和Crick，determined the structure of DNA. 即提出thedouble-helix model of DNA。
~1954 年，Crick提出Central Dogma:transcription translation
DNA ―――→RNA ―――→Proteinreplication
~In 1958, Meselson和Stahl，复制是semiconservative replication of DNA.
~ In 1961, Yanofsky, 提出了triplet的设想，即3 base encodes a AA. 同年又discovered messenger RNA. 法国科学家Monod和Jacob提出了operontheory。
~In 1963, Nirenberg, 在无细胞系统中，用人工合成的polynucleotide 合成polypeptide.
~In 1966，Nirenberg 和Khoranak, Finished unraveling the genetic code.
~In 1970, Smith, discovered restriction enzymes that cut DNA at specificsites. DNA 是长链分子，要研究需切割成小片段，切割时需要enzymes.
~ In 1970,从致癌RNA virus 中发现了reverse transcriptase (RT)，RNA―――→cDNA
Application: cDNA library, DNA chip; gene expression level. DNA chip把成千上万的DNA 探针固化在支持物表面上，产生二维DNA 探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速检测。有两种类型，DNA chip 和oligonucleotide array；寡核苷酸阵列主要由ESTs(espressed sequence tag)制作，它是300一500bp cDNA 片段
~ In 1972, Berg, Made the first recombinant DNA in vitro. In 1980 获得Nobel 奖。
~In 1977, 在研究分子生物学中了解DNA 的核苷酸的序列是非常重要的。Sanger 及Gilbert 分别用不同的方法完成了DNA sequence 测定。Sanger采用的是method of enzyme，而Glibert 采用method of chemistry。他们都将DNA分子中碱基序列准确地测定出来，使我们对基因结构得到了解。
~In 2000, Determined the base sequence of the genome of Arabidopsis andfruit fly (drosophila). 这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列.
~In 2002, Determined the base sequence of rice genome. 参加的国家有美，日，中等10 国家，我国承担的是水稻基因组的第四号染色体的测序，测序结果发表在2002 年的nature 杂志上.
~In 2003, Repotted the finished sequence of human genome. 这一人类基因组计划也有我国的参与，承担了1％的测序工作。虽然承担的仅仅是1％，但意义还是挺大的，可以分享这一计划所建立的所有技术、资源和数据。~In 2006, poplar 杨树。~ In 2007, grape~ In 2008, working draft of maize and soybean.
目前已有300 多种生物基因组全序列完成了测定。随着这些结构基因组工作的完成，今后基因组研究的重点就要转入功能基因组的研究。
3. Prospects for molecular biology分子生物学展望
3.1 Functional genomics
The sequences of genomes is called structural genomics because of its focus on the structure of genomes. Now we need to ask this question; Ofwhat use is the sequence of a genome? There are many applications, buttwo of the most important are: 1) finding genes involved in genetic traits(diseases, adversity, quality); and 2) probing the pattern of gene expressionin a given cell type at a given time (functional genomics).
3.2 Proteomics
指一个基因组所表达的细胞内的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质
及其动态变化规律的科学, 是从整体上研究组织、细胞的器官在特定条件下的蛋白质。
Genome: all the genes in an organism;
Genomics: the study of the structure and function of whole genomes.
Transcriptome: all the transcripts an organism can make in its lifetime
Transcriptomics: the study of the gene expression at RNA level.
Proteome: all the proteins expressed in a cell in a genome
Proteomics: the study of the proteome
3.3 Bioinformatics
对DNA 和蛋白质序列资料中各种类型的信息进行识别、存储、分析、模拟和运输。常由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。
4. Relation between molecular biology and other Disciplines
分子生物学已经渗透到all fields of life science。
Genetics: Mol+遗传学----- Molecular Genetics
Biochemistry：核酸生物化学，蛋白质与DNA 的结合研究
Microbiology：密不可分，E.coli ，plasmid、restrictive enzyme
Cell Biology：分子细胞生物学。在分子水平上探讨构成细胞各种组分的基因及其表达。
Developmental Biology：发育分子生物学。
Chapter 1 Genetic materials遗传的物质基础（6 学时）
1. 1 DNA is main genetic materials
早在二十世纪20年代，人们就已经认识到染色体有两种主要的组成成分，即DNA (deoxyribonucleic acid)—4 nucleotides 和Histone---20 AA.
1.1.1 Transformation experiment of pneumococcus 肺炎链球菌的转化作用
1928年,英国微生物学家Griffith做了有名的Pneumococcus感染mice的实验。这种细菌有三种类型(I、II、III). Wild type (S): spherical cell surrounded by a capsule polysaccharide
coat, smooth colonies. The coat has protective role, so it can proliferate enough. The polysaccharide is virulent that is capable of killing the mice.
Mutant strain (R)：has lost the ability to form a capsule, rough colonies. No coat---no proliferate, avirulent---mice live.
1) S---mice, die. 2) S, heat at 65℃---mice, live.
3) R---mice, live. 4) Dead S + R ---mice, die.
从死鼠体内分离细菌，得到了S 型细菌。从实验4)可以作出这样的判断，在killed S 型细菌中，仍有某种active substance 存在，它可以使R 型细菌变为S型，从而使小白鼠染病而死．但是，这种活性物质是什么．当时并不清楚。
1944 年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery 等改进了上述实验。他们发现，1) Extract of S型(removed protein), RàS型细菌; 2) 那么，到这儿是不是就可以断定DNA就是遗传物质呢？还不能，因为虽然DNA经过了多次纯化，但仍不能排除少量蛋白质混有的可能性。为了排除DNA中可能混有的少量蛋白质的影响，确证是DNA 而不是蛋白质使细菌发生转化，他们用trypsin降解S型extract 的protein后，它仍具有转化作用; 3) Digested with RNase, RàS. These experiments ruled out protein or RNA as the transforming material. 4) Digested with RNase, losted the transforming ability. 这个实验令人信服地证明，细菌中genetic substance是DNA。
1.1.2 Infection experiment of phage
已经证明了细菌中的遗传物质是DNA，而不是蛋白质。在其他生物中是否也是这样呢？IN 1952, Hershey and Chase performed another experiment that phage T2 infects the bacterium E.coli. 我们知道，DNA 和蛋白质在元素组成上的突出差别是，DNA 含有P，而蛋白质含有S。利用这个不同点，他们进行了如下实验：
1) Label of E.coli: The E.coli was cultured on medium containing 32P and 35S.
2) Label of T2: T2 infected the labeled E.coli.
3) Infect unlabeled E.coli.
Infection---mixing vigorously--- centrifugation---measuring radioactivity.
The results showed that the content of 32P on phage 与time 长短无关，而35S decreased with the increase in time. 说明DNA goes into the cell,protein remains on surface of cell.
1.1.3 Genetic material in eukaryote
以上实验仅仅证明，原核生物中的遗传物质是DNA。真核生物是否也是这样呢? 在很长的时间里，认为真核生物中遗传物质也是DNA。但这只是一个推论而已．没有直接的证据。现在，人们有十分充足的证据证明这一点。例如，用胸苷激酶基因(tk 基因)来转化没有这种基因的细胞系(这种细胞不能合成胸苷，因而在无胸苷的培养基中台死去)，其中有些细胞因获得了这个基因而能够正常生长，并形成一个细胞团。现在发现，有些病毒中没有DNA存在，而只有RNA。在这些生物中，遗传物质是RNA。由此，我们得出结论，G.M is nucleic acid，but mostly is DNA。
遗传物质必须具有以下feature：
1) Storage and expression of genetic information
2) Transmission of G.I to daughter cells
3) Physically and chemically stable
4) capable to change
1.2 Chemical compose of nucleic acids 核酸的化学组成
Nucleic acids divid into two types: DNA(deoxyribonucleic acid) and RNA.
A nucleic acid is a polynucleotide chain nucleotides linked together by 3’,5’-phosphodiester bond. A nucleotide consist of a nitrogenous base, a pentose, and a phosphate.
1.2.1 bases:
The bases fall into two types: pyrimidines and purines
DNA: A, G, C, T; RNA: A, G, C, U.
Chargaff 等在50 年代对各种生物DNA的碱基组成进行了定量测定，发现所有DNA 中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等(A＝T)；鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔含量相等(G＝C)。因此，嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等，即A＋G＝C＋T。这一规律提示A与T，G 与c之间碱基互补的可能性．为DNA 双螺旋结构模型的建立提供了重要依据，称为Chargaff’s rule。
1.2.2 nucleoside:
Base linked to pentose，并以glucosidic bond 相连接。
RNA 链中的戊糖是ribose(核糖)，DNA 链中的戊糖是deoxyribose。因此核苷可分为ribonucleoside、deoxyribonucleoside。
For RNA：adenosine、guanosine、cytidine、uridine.
For DNA：deoxyadenosine、deoxy~、deoxy~、deoxythymidine.
B a s e,N u c l e o s i d e,N u c l e o t i d e,R N A,D N A
A d e n i n e,A d e n o s i n e,A d e n y l i c a c i d,A M P,d A M P
G u a n i n e,G u a n o s i n e,G u a n y l i c a c i d,G M P,d G M P
C y t o s i n e,C y t i d i n e,C y t i d y l i c a c i d,C M P,d C M P
T h y m i n e,T h y m i d i n e,T h y m i d y l i c a c i d,,d T M P
U r a c i l,U r i d i n e,U r i d y l i c a c i d,U M P,,
1.2.3 nucleotide:
Nucleoside-P，ex) deoxyadenosine-5′-triphosphate(dATP). 分成核糖核苷酸和脱氧核糖核昔酸两大类，分别构成DNA和RNA的基本结构单位。所有的核苷酸都可在其5’位置连接一个以上的磷酸基团。从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依次称为α,β,γ.α和β及β和γ之间的能键是高能键，为许多细胞活动提供能量来源。核苷三磷酸缩写为NTP，核苷二磷酸缩写为NDP。5’核苷三磷酸是核酸合成的前体。
1.3 The primary and secondary structure of DNA
1.3.1 The primary structure of DNA
A polynucleotide chain nucleotides linked together by3’,5’-phosphodiester bond. 糖和磷酸残基连接起来形成骨架，碱基突出于骨架上。
Writing: ---5’pGpApTpCOH 3’---5’GATC 3’
多聚核苷酸链一端的核苷酸具有自由的5’磷酸基团；而另—端的核苷酸又有自由的3’羧基基团。传统上按照5’到3’的方向书写核酸顺序，即左边为5’末端，右边为3’末端。
Orientation: 5′---3′(合成新链时的方向):
backbone: sugar-phosphate;
expression method:
5′end --- 3′end；
N terminal --- C terminal for a.a
Nonreducing end --- Reducing end for sugar
1.3.2 The secondary structure of DNA
1) The right-handed double helix structure
1953 年．Watson和Crick提出了DNA double helix mode1．实际上在这之前他们早就设想过DNA 结构的多种可能的模型，但他们缺乏高质量的X-ray 衍射照片。当1952 年，wilkins 发表了非常漂亮的DNA 结构的X-ray diffraction picture 时，Watson 和Crick 很快就发表了他们的right-handed double helix model. 这个模型不仅解释了当时所知道的DNA 的一切理化性质，还将结构和功能联系起来，极大地推动了分子生物学的发展，具有划时代的意义。当时提出双螺旋结构的依据主要有三方面：
①利用X-ray diffraction结果表明，DNA has regular helix structure。3.4 nm/helical turn，邻近的核苷酸之间的距离为0.34 nm/base pairs，所以,每圈有10 nuleotides/ helical turn。
②Chargaff 等发现的DNA 中碱基含量A＝T，G＝C的定律。
③DNA 的density indicated that the helix is composed of two strands, its diameter is constant 20 A 。
根据Watson和Crick所提出的模型．DNA double helix feature：
①main chain: backbone: deoxyribose-phosphate; two strands are antiparallel, the left strand runs 5′--- 3′, the right strand runs 3′à 5′; theDNA double helix twist around central axis to form double helix;Right-handed helix; the backbone is on the outside and carries negative charges on the phosphate groups; the bases lie on the inside; the base plane is perpendicular to the axis of the helix。
②base pairs 要保持螺旋的直径不变，就必须是嘌呤和嘧啶相配。否则两个嘌呤尺寸太大，超过了20 A而两个嘧啶的尺寸太小，又不足20 A,而A和C，G 和T 又不能形成适合的氢键，因此只有A 和T 相配，G bond with C 才能满足正常螺旋形式的要求，而且也只有这样才能满足Chargaff的当量规律。这样的碱基配对规律，叫做base complement。嘌呤环和嘧啶环上的氨基和酮基是亲水的，因而配对碱基之间能够形成hydrogen bond 氢键；而嘌呤环和嘧啶环本身却是疏水的，因而同一条链中的相邻碱基能够形成一种堆积力。这两种力的协同作用就维持了双螺旋结构的稳定性。
③Distance of helix 双螺旋链中的任意一条链绕轴一周(360°)所升降的距离叫做螺距。A turn is 34 , the distance between adjacent nucleotides is 3.4 A , there must be 10 nucleotides per turn。
④Major groove and Minor groove 配对的碱基并不充满双螺旋空间，双螺旋的表面形成两条沟，a wide groove叫major groove; a narrow groove叫做minor groove；大沟中碱基的差异很易被识别，对于蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特异信息非常重要。The major groove is important to recognize specific information.
2) The factors determining stability of the double helix structure
①Hydrogen bond. It is premise condition to form double helix structure.双螺旋的互补碱基对之间存在hydrogen bond.
Base pairing:T-A C-G
有3 H/G.C pair，有2 H/A.T pair, 这是双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多性质与此有关。由于G、C对比A、T 对更稳定，DNA双螺旋结构的stability 与(G+C)%含量成正比。
②Base stacking forces. 即相邻碱基之间存在非特异性作用力.It’s main factor
Hydrophobic forces: 是不溶于水的两个分子在水中具有相互聚集在一起的趋势。由于嘌呤与嘧啶碱呈疏水
性分布于双螺旋结构内侧。大量邻近碱基对的堆积，使双螺旋结构内部形成一个强大的疏大作用。这是形成碱基堆积力的重要因素之一。
Van der waals forces: 虽然两个碱基之间的范德瓦力比较小，是没有什么实际意义的，但DNA 链含有大量的漂吟环和密院环，其累积的范德瓦力是相当可观的，是构成碱基堆积力的另一个重要因素。
③Repulsive force of negative charge on the phosphate groups. 每一个核苷酸的磷酸基上都带有一个负电荷。如果这些负电荷没有被中和，这种强大的静电排斥作用将驱使两条链分开但是当有盐类加入时, 这些带负电荷的磷酸基团可以被正离子,如)Na 所中和，失去了磷酸基的静电斥力。
由此可见，在决定DNA双螺旋结构状态的3点因素中，前二者[氢键和碱基堆集力)有利于DNA 双螺旋结构的稳定，而后者(磷酸基的静电斥力)则不利于DNA双螺旋结构的稳定。
1.3.3 Structure and function of RNA
1) Structure
①1°structure the same as that of DNA
②2°structure RNA 虽然是单链的．但是，如果在某一长度的核苷酸序列后面某一地方存在着一个与之互补的序列的话，则它们可以折回来，形成一段配对的双链结构和一个环。
2) Function
①Transmission of G. I
②Involving in RNA synthesis
③参与protein synthesis，如）tRNA、ribosome
④Regulation of gene expression, 如）RNAi
⑤与organism evolution有关
1.4 Chemical and physical properties of nucleic acids and its application
1.4.1 Respiration
In DNA double helix, 配对base 之间的H bond 不断处于breaking 和regeneration的动态平衡之中，这个过程称为~。
1.4.2 Denaturation
1) Conception Double strand DNAàSingle strand DNA 的过程。
2）Factors of denaturation
天然存在的DNA 都是双螺旋结构，那么什么条件下能够DNA变性呢？
①heating(95℃), 高温使分子的热运动加快，破坏H 键。
②加OH- , 改变base构型，使H 键不能形成。
③加denaturant, 插入到碱基之间，破坏H 键。
NH2C=ONH2 Urea
HC=ONH2 formamide 甲酰胺
HCHO
3）Properties change: decrease in viscosity; increase in optical density.
DsDNA---ssDNA: OD 增加，~Hyperchromic effect
SsDNA---dsDNA: OD 减少，~Hypochromic effect
ex) when conc. of DNA sol’n=50ug/ml, the OD260:
dsDNA, OD260=1.00
ssDNA, 1.37
single nucleotide 1.60
4) Melting curve and Tm
但DNA 溶液的温度逐渐升高时，测定不同温度下的OD 值，就可得到一组数据，并可以绘制出一条曲线，此曲线称为DNA的melting curve.
The temperature at which dsDNAs are half denatured is called the Tm.
Tm =85~95℃, 所以，在细胞里，DNA结构非常稳定。
Tm =81.5 + 16.6 log〔M+〕+0.41〔%(G + C)〕- 500/L -0.66% FA
Ex) 〔NaCl〕= 1M, %(G + C) = 50时，Tm = 81.5 + 20.5 –500/L
L = 10, Tm = 52℃L = 1000, Tm = 101.5℃所以，链越长，越稳定。
1.4.3 Renaturation
1) Conception: ssDNA---dsDNA 的过程。
2) Factors:
①Temperature, 既要消除链内H 键，又要促使两条链间形成H bond.the best T for renaturation of a DNA is about 25℃below its Tm. The rapid cooling following denaturation would prevent renaturation. A common procedure to ensure that denatured DNA stays denatured is to plunge the hot DNA solution into ice. This is called quenching.
②Salt conc. , 用以消除磷酸基的静电斥力，常用0.15~0.5 M Nacl。
③DNA Concentration，the higher the conc., the more the encounter. In other words, the higher the conc., the faster the renaturation.
④Renaturation Time, the longer the time allowed for annealing, the more will occur.
1.4.4 Hybridization
so far, we have dealt only with two separated DNA strands simply getting back together again, but other possibilities exist. For example, a strand of DNA and a strand of RNA getting together to form a double helix.We would call it hybridization because of a hybrid of two different nucleic acids. If we put together two different strands of DNA having complementary sequences we could still call it hybridization.
1.4.5 Application. Southern blot, Northern blot.
1) electrophoresis 分离不同大小DNA片段；
2) denaturation
3) Transfer of ssDNA to membrane
4) Hybridization
5) measure
1.5 A variety of DNA secondary structure 二级结构的多形性
1953 年watson和Crick提出的DNA 右手双螺旋模型相当于B form。B form 是用生理盐浓度的DNA 溶液抽成纤维，然后在92％的相对湿度下进行X 光衍射测定出来的。大量的工作证明了在溶液中的DNA确实是采取
B 构象；细胞中含有大量的水分，细胞DNA也是主要采取B 构象。除了B 构象外，人们还发现了A 构象、
C 构象、
D 构象和
E 构象等右手双螺旋构象以及左手双螺旋的Z构象。A form 是在以Na＋、K＋作为反离子时将DNA 纤维在75％的相对湿度下进行X—光衍射测定出来的。DNA—RNA 杂交分子，RNA—RNA 双链结构均采取A构象。
1979 年，Rich等人用X 光衍射技术对六聚体d(CpGpCpGpCpGp)单晶的结构进行研究。出人预料地发现，这种六聚体的构象既不是B型，也不是A 型，而是一种全新的左手双螺旋构象，叫做Z构象，之所以命名为Z 型，是因为其骨架像之字形(zigzag)。
1.6 DNA supercoil and topoisomer 超螺旋和拓扑异构现象
1.6.1 Concept of supercoil
上面谈到DNA 分子是一种双螺旋，当它自身进一步缠绕（twist）时就形成超螺旋结构（supercoil）。现已知道绝大多数原核生物DNA都是共价闭环(covalently closed circle)简称CCC 分子。它们在生活周期的某一阶段，必须将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线性分子，但其DNA 均与蛋质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个噜噗（loop）结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。
Positive supercoil：沿着双螺旋缠绕方向same direction缠绕wind 而形成的超螺旋。正超螺旋的引入导致双螺旋的张力torsional pressure 更大，使结构更加紧张tighten structure, overwinding。
Negative supercoil：与右手双螺旋缠绕方向opposite direction缠绕而形成的超螺旋。减轻了扭曲张力reduce torsional pressure，loosening the structure of double helix, 解旋Unwinding。但如果过度扭转，将会导致部分碱
基对的破坏。
DNA Unwinding Causes Topological Problems
1.6.2 Topology
下面利用一些拓扑学的概念说明超螺旋的结构：
(1) linking number(L): 连接数是指双螺旋DNA 中，两条链互相交叉的次数。它是一个整数。—个闭合环状DNA 分子，只要其主链的共价键不发生断裂，连接数是不会改变的。
(2) twisting number(T): 扭转数代表DNA分子一条链绕另一条链的扭转数，即DNA 分子中双螺旋的数目。
(3) writhing number(W) : 缠绕数指双螺旋分子在空间上相对于双螺旋轴的扭曲，也等于超螺旋数目。
(4) L＝T ＋W。T与W值可以是小数，但L值必须是整数。对于松弛的分子，W＝0，而L与T 相等。
L=36, 若T 保持42,那么，W=-6
1.6.3 How to form?
DNA 超螺旋是如何产生的呢？所有的DNA 超螺旋都是由DNA topoisomerase 催化产生的。
DNA 拓扑异构酶可以分两类：topoisomeraseI(topoI) and topoisomeraseII (topoII)。
1) topoI
~feature: ①催化DNA单链的断裂和重新连接，即催化单链断裂的同时，再进行连接，它们不需要能量辅因子如A TP 或NAD;②消除DNA 的负超螺旋而不引起DNA 发生其它改变。
~mechanism: topoI linked ①to ssDNA; ②cutting one strand, forming enzyme-DNA complex;③another strand goes through rift;④two ends of enzyme relinks;⑤enzyme releases。
2) topoII
又称为DNA 旋转酶(gyrase)，它由两个α亚基和两个β亚基组成。αis 105KDa, has phosphodiesterase; βis 95KDa, has ATPase。topoII can bring (-)supercoil以抵销复制叉移动所产生的(+)supercoil。旋转酶使DNA超螺旋化的步骤为：(1) gyrase linked to DNA，并使长约105—140bp 的片段按正方向包裹自身；(2)cutting, linked to α在包裹片段的中心附近切割，每一断口的5’端与α共价结合；(3) goes through rift位于包裹片段内的DNA 区域，通过亚基β与ATP的结合而穿越断口；〔4)relinks 重新闭合。
Chapter 2 Gene and genome 基因及基因组（3 学时）
2.1 Development of gene conception基因概念的发展
2.1.1 conception
Gene:是指a length of nucleotide sequence in DNA。除了gene概念外，我们还要学习相关的概念。phenotype表现型是指有机体可见的表观apparent；
genotype基因型是genetic element controlling these apparents.
mutation基因突变: 发生variation of heredity.
Mutant突变体:organism carrying mutated gene.
wild type: organism carrying normal gene.
有些遗传性状是由单基因决定的，而有些是由多基因决定的。
2.1.2 development
对于基因的研究最早是从二十世纪初开始的。1865 年，孟德尔发现并发表了基因传递规律。遗憾的是，他的贡献被历史埋没了35 年。后来，人们在研究红色面包酶氨基酸突变型时发现，这些营养缺陷型突变体缺少与某种氨基酸合成有关的酶，于是就产生了one gene encodes one enzyme的结论。后来知道，许多酶都是由一条以上的多肽链组成；还知道，有些多肽如核糖体蛋白等又都不具有酶的催化活性。因此，后来就把一个基因一种酶的理论修改成“one gene encodes one polypeptide chain”。但是这种提法也并不完全正确，因为有些基因并不指导蛋白质或多肤链合成，如编码rRNA 和tRNA 的基因以及其他一些不翻译成多肽链的RNA 基因等。进一步在分子水平上说明基因的是Benzer。他用cistron 的概念来表示gene，当两个突变具有相同的表型效应而且其遗传图距很接近时，它们既可能属于一个基因，也可能位于不同的基因上。顺反互补测验(cis trans test)可精确确定两个突变间的关系，即两个突变是位于一个基因还是位于不同的基因上。
cistron顺反子：a indivisibility genetic unit 一个不可分割的遗传单位。所以，a cistron is essentially the same as”一个基因编码一条多肽链”，也是功能单位。现在普遍用顺反子概念，一个顺反子就是一个基因，多顺反子
就是多个基因。
摩尔根在基因论中提出遗传粒子理论，他认为基因像粒子，一个一个粒子连接成直线，这些粒子彼此独立，互不重叠。但是，分子生物学的发展证明了基因不仅可以overlap 重叠，而且可被compart 分隔。这在基因概念上是个突破。它不仅使摩尔根的基因概念过时，也使风行一时的“基因是功能单位”的顺反子概念不能成立。为此，Gilbert 在1978 年提出了“gene is a transcription unit”的新概念。这个概念也不能令人满意，因为有的基因(如启动基因或操纵基因)并不转录或不完全转录，而作为一个单位转录下来的mRNA 也往往不是一个基因。
基因及基因型的稳定性一直是传统遗传学的重要概念。但目前已认识到在某些情况下，某些DNA 序列可以重新编组，以用于调节基因表达或构建新的基因。自1952年McClintock在玉米中发现转座子以来，在细菌、酵母及果蝇中也相继发现了转座子。这使人们相信可移动DNA 序列的存在是生物界的普遍现象。1983 年, McClintock获得了诺贝尔奖金。总之，基因概念是处于不断的变化和发展之中，随着分子生物学的发展．必将会有新的基因概念出现，而基因概念的演变也必将促进分子生物学的发展。
2.1.3 gene naming 命名目前没有严格的统一。
General rule: gene: lowercase, italic;
protein: uppercase, roman. Ex)gfp, GFP.
Exception:①plasmid. Natural plasmid: first lette require uppercace, ex)ColE1.Recombinant plasmid: 前面加一个p, ex) pSC101.
②Human and brewing yeast: uppercase, italic. Ex), MYC, GAL4.
2.2 General structure of gene基因的一般结构
2.2.1 Typical prokaryotic gene
2.2.2 Typical eukaryotic gene
1) Promoter
A nucleotide sequence RNA polymerase binds and begins transcription.RNA聚合酶所识别并结合，起始转录的一段特异的核苷酸序列。Ex) GC box、CAAT box 、TATA bos、+1.
2) Ribosome binding site
Between +1~ATG, around A TG has ribosome binding site. 在细菌基因中，这段短的核育酸序列叫做SD 序列(Shine-Dalgarno sequence)，序列为AGGAGG，它与16srRNA3’端CCUCCU 结合.
3) AUG……TAA\TAG\TGA
4) Tail-adding signal
真核生物mRNA 的3’端都有一段po1y A tail，这种尾巴不由基因编码，而是在转录后加到mRNA 上的。加尾过程受位于终止密码3’端的加尾信号序列所控制。现在知道，动、植物基因都有一个以上加尾信号序列，animal 基因的同感序列为AA TAAA，plant基因的加尾信号变化较大，为ATAATAAApu。
5)terminator: a sequence terminating transcription。
6）enhancer or silencer.
~5’-UTR (5’-untranslating region): +1~ATG
~3’-UTR (3’-untranslating region): TAA~terminator
~CDS (coding sequence) = ORF (open reading frame): ATG~TAA.
~Codon consist of 3 bp, 一个gene 始终从AUG 开始到UAA 、UGA、UAG结束。有一个问题，就是first AUG 的不同确定，可以有多个ORF。Ex) AUG CAU GCU UCU AAU UAA UUA GUA;
A UGC AUGCUU CUA AUU AAU UAG UA. 所以，一个基因有多个ORF的话，how to determine the ORF? 由于通常最长的碱基序列有意义，所以，一旦先从最先出现的AUG开始定ORF。
~In GenBank, ①Definition;②Accession;③Source;④CDS; DNA ⑤seq.
~Application
2.3 Split genes隔裂基因
1977, Broker and Sharp 等人发现，现已知道绝大多数eukaryotic gene 都有隔裂基因。基因的编码蛋白质的序列被不编码的序列所隔开，这样的基因叫隔裂基因(split gene)。不编码的序列叫做内含子(intron)，编码的部分叫做外显子(exon)。
~Discovery. 隔裂基因是通过比较DNA 和mRNAA 的分子杂交而发现。杂交后，可以用电镜进行观察，看到较粗的杂交双链，还有不能配对的单链环，这就是内含子。
~Measure the length of exon, intron, and gene
Principle: S1 enzyme cuts single strand within DNA molecule;
Exo VII: remove residues from the end of single strand
Alkali: degrade RNA.
隔裂基因中内含子的数目因物种和基因不同而有差别、有些基因只有一个内含子，有些则有多个内含子。隔裂基因是外显子和内含子交替构成，基因两端是外显子。如果一个基因具有n个内含子，则相应地含有n ＋1个外显子。隔裂基因在转录过程中，内含子和外显子一起转录，成为原初转录物(primary transcript)。这样的前体mRNA 不能翻译蛋白质；这样的前体rRNA 或tRNA 人也不能执行其功能。所以必须从原初RNA 转录物中去除内含子以后，将外含子连接起来，才能产生有功能的mRNA、rRNA、tRNA，这个过程叫做RNA 的拼接(RNA splicing)。
2.4 Transposon转座子
1）Transposon：指可在DNA分子间进行转移的genetic element, 也
称为跳跃基因(jumping gene). 转座子的转移过程叫transposition转座.Transposon 可从染色体的一个位置跳跃到另一个位置、甚至从一条染色体跳跃到另一条染色体，能把G.I 横向传递。
2) Effect转座作用的遗传学效应:
①转座引起插入突变mutation
②转座产生新的基因new genes
③转座产生的染色体畸变chromosome aberrance
④转座引起的生物进化evolution
2.5 Genome size and the C-value paradox
1) Genome: all the DNA molecules in an (haploid) organism.
Meanings：①contain all the G.I ②DNA molecules are same in all cells.
2) Relation among gene, DNA and genome
Gene is in DNA; the total amount of DNA is genome
3) The number of genes
=genome size/gene average size. The genome size is known by seq. gene
average size is known from the known data of gene。不是准确数值。
The genome sizes and gene numbers of some living species
Species Genome sizes Gene numbers
T4 phage 1.6 x 105 200
Mycoplasma 支原体 1.0 x 106 750
E.coli 4.2 x 106 2350
Yeast 1.3 x 107 6100
Fruit fly 1.4 x 108 8750
Human 3.3 x 109 65.000~80.000
4) C-value: the total of DNA in the haploid genome is a characteristic.
通常称为该物种的C-value。
随着生物的evolution, 生物体的structure 与function 越来越complexity，其C 值就越大，例如higher plants 的C 值比真菌就大得多。这—点是不难理解的，因为结构和功能越复杂．需要的protein 的种类越多，也就是说需要的基因越多，因而C值越大。但是，有些在结构、功能很similar 的identical species 生物中，C 值也相差很大。突出的例子是两栖动物amphibians，C 值小的可以低至<109bp，大的可以>1011bp。而mammals 的C 值均为109 bp 的数量级。难道两栖动物的结构和功能会比哺乳动物更复杂？不太可能。那么，两栖动物的很多DNA 功能是什么？人们无法解释，这就出现了C value paradox。
2.6 Eukaryotic DNA sequence components
2.6.1 Unique sequence 单一序列和repetitive sequence 重复序列
根据DNA复性动力学的研究，真核生物的DNA序列可以分为4 种类型：
1) Unique sequence又称nonrepetitive seq.，only has 1 copy in a genome，大多数低等真核生物的基因是单拷贝的。
2) Slightly repetitive sequence 在—个基因组中有2~10 copy(但2—3 个拷贝常常被视为非重复序列)，如组蛋白基因和酵母tRNA 基因。
3) Moderately repetitive sequence 10~几百个。中度重复序列一般是nonencoding seq.，它们可能在gene regulation中起important role．这些重复序列的平均长度大约300bp。与Unique sequence 相间排列。其中最使人感兴趣的就是Alu family。A1u家族成员众多，大约有几十万个，平均每6kb 就有一个，在其第170 位置附近都有AGCT 这样的序列，可被限制性内切酶AluI所切割(AGCT)，故此得名。无论从Alu序列的长度还是从其重复频率上来看，A1u族序列都更像高度重复序列；然而它们不同于高度重复序列的串联集中分布，而是广泛散布在单一序列之间。
4) Highly repetitive sequence 有几百个到几百万个。如rRNA基因和某些tRNA 基因，重复数百次。特点是串联集中distribution在高度重复序列中，常有一些A．T 含量很高的简单高度重复序列，例如螃蟹crab DNA 含有AT 简单重复序列，含量达到97％。由于A．T段浮力密度较小，因而在将DNA 切断成数百个碱基对的片断进行超离心时，常会在DNA 主带(A T 含量为58％)的上面有一个次要的DNA 带相伴随，这就是satellite DNA。也有重的卫星DNA。
satellite DNA 位于着丝点附近的heterochromatin 区。人们很早就知道异染色质区的DNA是不表达的，不产生RNA 和蛋白质产物。但是，1980年varley 等在蝾源(Triturus)中，卫星DNA 有转录作用。这个发现打破了过去认为卫星DNA 不能转录的看法。
2.6.2 基因家族gene family 与基因簇gene cluster
Gene family: a set of genes whose source is identical, structure is similar,function is related. 是真核生物基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因。
Gene cluster：a group of genes that are identical or related.基因家族的各成员紧密排列成串联重复单位。
2.7 Organelle genes细胞器基因
在真核生物中，只有两类细胞器能够携带遗传物质、即mitochondrion和chloroplast。大多数动物细胞只有线粒体，植物细胞既有线粒体又有叶绿体。
1)Protein and enzyme. Some are encoded by genes in organelle. Some bynuclear genes. RNA polymerase, aminoacyl-tRNA synthetase, and ribosome protein in mitochondrion are encoded by nuclear genes, but usedonly in organelle.
细胞器膜不允许核酸分子通过，因此二者基因表达所需的RNA 均由自身提供。RNAs are encoded by organelle genes. However, except an example, in布氏锥虫Trypanosoma brucei, no gene for tRNA can be found in the mitochondria, and it seems likely that the tRNAs are imported.
2) Form Most are circular, a few is linear
3) Copy Usually there are many copies. Since there are multiple organells per cell, there is a large number of genomes per organell. In higher plant, 20-40 organells/cell, 20-40 genome/organell; in yeast, 22 mitochondria/cell, 4 genomes/organelle.
4) Size
Chloroplast genomes are relatively large, usually ~140 kb in higher
plants, and <200 kb in lower eukaryotes.
Mitochondrial genomes are relatively small, ~16.5 kb in man, mouse,cow; ~84 kb in yeast.
Chapter 3 DNA replication 复制（8 class hours）
DNA is a carrier of G.I，生物体要保持物种的延续，子代daughter 必须从亲代parent 继承G.I。生物体通过cell division来实现species 的传递和个体数目的proliferation，在此过程中细胞chromosome numbers 加倍,作为遗传物质的DNA分子的数目也加倍(replication)，并伴随染色体平均分配到two daughter cells 中。所以，G.I is transferred to daughter through the replication of the parental DNA.无论是原核生物还是真核生物，每次发生有丝分裂，细胞内的基因组都精确地复制一次。How is the relation of replication with cell cycle?复制与细胞周期是什么关系呢? Replication 是cell division 的决定因素Replication determines cell division，直到DNA 复制完成前，细胞都不会发生分裂，而DNA 复制的完成恰恰是细胞分裂的触发点，复制后的基因组伴随细胞分裂被平均分配到每个子细胞中If replication proceeds, the division cannot be permitted to occur until the replication has been completed. Indeed, the completion of replication may provide a trigger for cell division. Then the duplicate genomes are segregated one to each daughter cell。
细胞周期调控基因控制DNA 的复制并触发细胞分裂。在原核生物中，DNA 复制是由细菌染色体上一个特殊位点开始的，新细胞膜的生长意味着细胞分裂过程的完成。在真核细胞中，复制起始于前S 期，DNA 的合成发生于S期，一系列的调控事件控制细胞进行随后的有丝分裂过程。
Cell cycle regulator genes control the DNA replication and trigger division. In prokaryotes, replication started from a unique site, and the process of division is accomplished by the development of a septum. In eukaryotes, the replication is started from S phase.
3.1 Replication: an overview复制概况
3.1.1 Semiconservative replication
根据Watson-Crick的DNA 复制假说，当DNA 复制时，两条亲链分离并分别作为模板，合成新链。该假说曾推测，子代dsDNA 中，一条链来自old strand，另一条链来自new strand，这种方式称为半保留复制。
1）Materials: ①template DNA, ②enzyme: DNA polymerase, ligase, ③dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
2) 步骤step: ①Helix separate. DNA 复制时，首先从一个起点将氢键打开，使双链DNA 分开成两条单链，
②primer synthesis;③replication5’à3’. DNA 聚合酶都不能从头起始合成一条新的DNA 链，必须要有primer, primer 大多为一段RNA：length: 1-10 nucleotide; 与template 配对；具有3’-OH. Primer 由primase 合成。
3）DNA replication假说:
①conservative replication
②semiconservative rep.
③dispersive rep(分散复制)
真实情况究竞如何呢?1958 年，Meselson 和Stahl 设计了一个很巧妙的实验证明了DNA 复制是采取半保留机制。他们首先让大肠杆菌在15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长．经过多代培养所有的DNA 分子都被标记上15N—heavy strand(H)。将有15N 标记的大肠杆菌转移到普通的培养基(含14N 的氮源)中培养，一代、两代、多代。
3.1.2 Origin, direction, mode of replication
1) Replication origin
复制是从DNA分子上的特定位置开始的，这一位置叫origin at which replication is initiated，常用ori或o。Prokaryote: 只有1 origin，复制从ori--terminus at which replication
stops 结束，完成整个染色体DNA分子的复制，called 复制单位replicon.原核生物的染色体只有1 replicon。Eukaryote: 复制也从ori 开始，以bidirectional elongation 的方式进行，直到terminus 为止，但其复制是从multiple sites 开始的．所以真核生物的DNA 分子上有多个replicon。replicon是genome 中能独立进行复制的unit。在一个cell division cycle 中，each replicon starts only once。
2) Direction
May be unidirectional or bidirectional. The type event is determined
by whether one or two replication forks set out from the origin. In unidirectional replication, one fork leaves the origin and proceeds along the DNA. In bidirectional replication, two forks are formed and they proceed away from the origin in opposite directions.
3) Mode
Most eukaryotic DNA 的复制都以双向same speed进行。但也有例外情况。例如枯草杆菌Bacillus subtilis，复制是从起点开始双向进行的，但两个复制叉的移动是asymmetrical 的，在—个方向上移动染色体1／5 的距离，然后另一个复制叉走完4／5 的distance。根据DNA合成的起始方式initiation manner，复制可以分为2 types: replicating fork and rolling circle replication。
①Replicating fork (包括θreplication)
Linear DNA Circular DNA
复制正在发生的分叉部位叫做replicating fork
②Rolling circle replication
这种复制模型适合许多病毒DNA、细菌F 因子。在这种复制模型中．
~首先切断正链的复制起点，
~5’端脱离双链分子，与特殊protein结合；
~3’-OH + dNTP
~5’端不断甩出来；
~SSB + ssDNA;
~Synthesis of Okazaki fragments。由于3’端不断延长，而5’端则不断地甩出。好像中间的一个环在不断地滚动一样，因而叫做滚环复制。
3.1.3 DNA polymerase and DNA polymerization
复制是DNA 聚合酶负责完成的。在镁离子存在下，DNA聚合酶催化4 种脱氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA 的3’-OH 末端加入一个核苷酸使DNA链由5’向3’方向延长．同时释放无机焦磷酸。反应式：Poly(nucleotide)n-3’-OH + dNTP ----> Poly(nucleotide)n+1-3’-OH + 2Pi 这里Pi 是从焦磷酸分解而成的无机磷酸。
3.1.4 Semidiscontinuous replication
DNA 分子的两条链是antiparallel，这种结构产生了复制上的问题。
当复制时，在一条链上复制叉以5’一3’方向移动，在另一条链上则以3’一5’方向移动。但是所有已知的
DNA 聚合酶只能沿5’一3’方向合成DNA，即新生链的生长方向只能是5’一3’，而不能相反。这就很难解释DNA 在复制时两条链如何能够同时作为模板合成其互补链。为了解决这个矛盾，冈崎等人提出了DNA 的不连续复制模型，认为3’一5’走向的DNA实际上是由许多5’一3’方向合成的小的DNA 片段连接起来的。这些small DNA fragment 称为冈崎片段(0kazaki fragment)。
1968 年，冈崎等用3H—T 标记噬菌体T4 DNA，然后通过碱性密度梯度离心法gradient 分离标记的DNA 产物，发现在短时间内首先合成的是较短的DNA 片段，接着出现较大的放射性标记的分子。最初出现的DNA 片段长度为1000 一2000 个0kazaki fragment。用DNA 连接酶的温度敏感突变体T4 ligase mutant进行实验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量的DNA片段的积累。这些实验说明在DNA复制过程中首先合成short DNA pieces，然后再由连接酶连接成long DNA pieces。
预期结果应该是大片段和小片段各占一半，但why is the continuous strand short?后来发现这是由于U 取代T 掺入DNA 所造成的。
dUTP:dTTP=1:300, 1U/1200 bp,。错误掺入的U 可被U-N-glycosylase 切除，产生无尿嘧啶的phosphodiester bond，这种phosphodiester bond 很容易被碱水解而break，从而形成一些较短的片段。这种情况下的冈崎片段应该称为尿嘧啶片段，它并不能反映不连续合成的真实情况。
Mutant experiment:
①dut-: no dUTPase activity. dUTPase degrades dUTP to dUMP. So,
dUTP accumulation, 有更多的U掺入，产生的Okazaki fragment 更小.
②ung-: no U-N-glycosylase activity. So, this mutant 的DNA 上虽有U掺入，但不再被切除。此时，新合成的DNA 大约有—半放射性标记出现于冈崎片段中，另一半直接进入大的片段。由此可见，当DNA 复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为semidiscontinuous replication。
以复制叉向前移动的方向为标准，与复制叉移动方向相同的新生链是连续的，而与复制叉移动方向相反的另一条新生链是不连续的。总体来说，两条新生链的合成进度大体相同，但是在复制叉处，连续合成的链总是领先于不连续合成的链，因此前者称为先导链leading strand，后者称为后随链lagging strand。
3.2 Enzymology of DNA replication复制的酶学
3.2.1 DNA polymerase from E.coli
1957 年，Arthur Kornberg 首次发现DNA polymerase I，后来又相继发现了DNA polymerase II、DNA polymerase III。分别简写为Pol I，Pol II，Pol III。
1) Pol I has 3 different activity
①5’一3’polymerase activity，need base paired 3’-OH and template.
②5’一3’exonuclease activity，at base paired 5’-○P end, remove RNA
③3’一5’exonuclease activity，at non-base paired ends. 这种酶活性是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，这种功能称为proof-reading 功能，可以remove the mispaired nucleotide, allowing replication to continue.这对于DNA 作为遗传物质所必需的稳定性和极高的保真度是至关重要的。
下面讲几个与Pol I的5'- 3' exo活性和polymerase 活性有关的现象，
~切口平移(nick translation): 在切口的5’P 末端由5’—3’外切酶活性进行水解反应，而同时在切口的3’—OH 末端由聚合酶活性进行聚合反应。由于pol I 不能连接相邻的3’-0H end 和5’-P end，仍保留原有的切口，就好像原来的切口由5’端向3‘端转移一样，这种现象叫做nick translation。
~链的置换strand displacement: 在实验条件下，可以让切口的3’-OH 末端进行聚合反应而不让切口的5’-P 末端发生外切酶的水解反应。这样，生长的链就置换了亲本链。
DNA Pol I(M=103kDa). Pol I can be cleaved by proteolytic treatment into two polypeptides.
2）Pol III
Pol III全酶consist of 10 different subunits.
①5’一3’polymerase activity
②3’一5’exonuclease activity
In vivo, Pol I: repair and remove primer；PolIII: replication.
In vitro, same role。
3) DNA Pol II 是一条分子量120 kDa 的多肽链。这个酶的activity low，只有5％of pol I。具有3’一5’exonuclease activity。它在DNA 的修复中起一定作用。
3.2.2 DNA ligase
DNA 聚合酶虽能充填缺口，甚至聚合了很长的DNA 互补链，但都无法切口接合。只有DNA连接酶可以完成这一项任务。只有当切口的3’—0H和5’－P相邻并且各自的碱基处于配对状态时，DNA 连接酶才能起作用。由于连接反应是在3’—OH 和5’—P 之间进行。因此必须由ATP 或NAD的水解来供应能量，在真核生物中使用A TP，而E.coli 连接酶使用NAD。
3.2.3 Primase=DnaG encoded by dnaG. It is a single peptide, Mw=60KD,50-100 个/cell. DnaG’activity low, DnaG + DnaB = primosome has activity.
3.2.4 螺旋酶(helicase)，separate two parental DNA strands. 在解链过程中都需要水解ATP 供应能量，它们具有依赖于DNA的ATPase activity。Helicase fall into 2 types：one 是解链后bind to ssDNA，ex) helicase I、II.another 是only separate，SSB bind to ssDNA.
3.2.5 DNA gyrase旋转酶：bring (-) supercoil.
3.2.6 Single-strand DNA-binding protein (SSB)
~Function：
①Protection. Protect ssDNA from degrading 保护单链DNA部分不被核酸酶降解.
②Preventing ssDNAs from reforming dsDNA
③Cooperative effect. The binding of one protein makes it much easier for another to bind.
④Stimulates the DNA helicase activity.
原核细胞中的SSB 主要有T4 phage SSB: gp32 encoded by gene and E.coli SSB 等。gp32 is monomer，每个细胞含有1 万个copies。
E.coli SSB is a polypeptide consisted of 177 aa，tetramers，800 copies/cell.
3.3 Initiation of DNA replication复制的起始
~DNA replication是由多种enzymes 和多种Pr.高度协同完成的
~All the DNA molecule 都在Ori 处开始replication的
~ Initiation: 在ori 处打开double strands, to form replisome；
Elongation: 5’à3’synthesis, in leading strand, synthesize only one primer, but in lagging strand, synthesize a series of primers;
Termination：到terminus 发生终止。
~Once initiation of replication，就会进行到底，直到whole genome 都复制
~Initiation frequency controlled by the interaction between ori and regulating protein.
~In one cell cycle，start only once a replicon.
~Formation of complex requires: DnaA, DnaB, DnaC, HU(dimmer, bend DNA), Gyrase, SSB.
以E.coli initiation为例说明原核生物复制起始的情况.
~Initiation process:
3.3.1 Preprimosome formation
1)DnaA binds to four 9 bp repeats;
2)20-40 monomers formed a central core by cooperative role;
3)DnaA acts at three 13 bp repeats;
4)DNA strands are separated to form an open complex;
5)Forming DnaB/DnaC complex.
DnaB 是helicase。DnaB is hexamer, DnaC is monomer, 6 DnaC binds 1 DnaB to form DnaB/DnaC complex. 这个复合物与oriC 结合形成Preprimosome, 从而形成了一个双向复制叉。DnaC 是DnaB 的装载因子loader，keep the DnaB inactive。
3.3.2 Change of complex configuration
In oriC, it needs to keep stability when assembling initiation complex，but it needs to move when replication，以完
成它们的function。因此，在复制起始过程中，通过这些复合物改型, 使stable à move。在大肠杆菌的DNA 复制中，通过改变ATP 的binding 状态来改型，例如，DnaC 必须结合ATP 才能与DnaB 相互作用，当ATP 水解hydrolyze 时，DnaC 会离开复合物, 导致了helicase activityàrecognize ssDNAàreplacement of DnaAàDnaA-gyrase interaction highly unwind dsDNA à同时SSB stabilize ssDNA.
3.3.3 Formation of primosome
高度unwinding template 与complex 促进primase adding, form primosome, synthesize RNA primer。
In bacterium，已知有两种合成RNA 的酶，一种是RNA polymerase，这是转录时所使用的酶。另—种是primase，是dnaG 基因的产物，它是—个单亚基的多肽。这两种酶可以通过对利福霉素rifamycin的sensitivity下同而区分：RNA polymerase is sensitive to rifamycin，而primase is nonsensitive。
引发酶不同于DNA 聚合酶，它能重新起始—个新核苷酸链的合成。它的起始位点对应于简并的3 nucleotide seq，so has many sites that synthesize primer. Different primase recognizes different sequence.
3.3.4 Assembly of replisome
引物合成后，DNA polymeraseIII 组装到引发的DNA 上，完成replisome 的组装，开始synthesize DNA。
Pol III由17 个polypeptide 组成：α2ε2θ2τ2γ1δ1δ1φ1χ1β4.
In vitro, pol III holoenzyme assembly:
3.4 Elongation of DNA replication 延伸过程
Once a primer is synthesized, the elongation can begin. The pol III holoenzyme is the replication enzyme in E.coli, and DNA polymerase δis the enzyme in eukaryotes.
3.4.1 Elongation of leading strand
1）Linear DNA
~Primer 3’-OH + dNTP，从而开始新生链的elongation合成过程.
~在复制叉前进过程中，必须有helicase unwind dsDNA. Helicase: DnaB,Rep.
~复制叉前进所造成的DNA overwinding，必须由topoisomerase 来解决.
~ SSB+DNA，保持两条亲代链分离，使它们发挥模板的功能。
~In vivo，unwinding、包被wraping、replication反应是串联进行的。
2）Circular DNA
~In circular DNA 合成过程中，两条链的合成并不是同时进行的，先导链的合成先于后随链的合成。先导链的合成形成了一个单链DNA 的环，当解旋点前进时这个环会变大。这种结构也称q structure。在第一个冈崎片段合成开始前，这种q structure 存在着—个replication bubble，它是由a double strands(一条亲链与先导链配对而成)和a single strand 所组成。
因为leading strand displaced parental strand．所以这个结构称为D(displacement) loop，这通常是—个瞬间构型，置换的单链上随即进行后随链的合成。
~ unidirection or bidirection? The q structure contains two replicating forks.若lagging strand 是另一方向的leading strand 的话，所有的环形DNA 复制都是bidirection, but 也有单向。另实验证明，确实是双向。
3.4.2 Initiation of lagging strand 后随链合成的起始
关于后随链冈崎片段的引发机制，人们是利用ssDNA phage 的复制作为模型来研究的。因为这些噬菌体在复制的过程中，大部或全部使用宿主的复制酶系和蛋白质，因而研究这些噬菌体DNA 的复制对于了解大肠杆菌DNA 的复制机制是十分有用的。研究较多的有M13、G4、ФX174 三个噬菌体。
1) SSB binds to ssDNA (+strand)
2) Primer synthesis:
M13: primer is synthesized by host RNA polymerase
G4 : host primase ФX174: primosome (n, n’, n’’, i, DnaB, DnaC, primase)
3) Pol III synthesizes (-) strand to primer site
4) Pol I degrades primer, and nick translation
5) The nick is linked by ligase
M13 DNA有6407 bp。从其第5480-5820 bp之间有five hairpins结构，其中以third 最为重要。这一hairpin 有59
个bp。而RNA polymerase 能识别发夹结构，从第5756碱基开始转录出20一30 bp 的RNA primer。G4 DNA有5577 个base。G4的合成起始与M13很相似。ФX174DNA 的复制体系是相当复杂的，其复制所用的enzyme and protein全部来自寄主host。ФX 174 的DNA有5386 bp。当它进入寄主细胞后，其ssDNA上全部结合有SSB蛋白。约55个碱基，有一小段hairpin struture，primosome 中n’能recognizes this sequence, 在此处由primase synthesizes primer 后，n’hydrolyzes ATP，使DnaB configuration change，reduced appetency with ssDNA 的亲和力，使引发体向前move。
InM13、G4，only synthesize a primer，然后DNA 合成到底; but in ФX174，synthesize many primers。
3.4.3 Coordinating synthesis of the leading and lagging strands
Pol III consistes of two core polymerases, linked through t subunit into dimer. 由于dimer的存在，leading strand和lagging strand得以同时复制。The two core polymerases fits very nicely with the fact that two DNA strands need to be replicated. The leading strand 的合成方向与fork移动的方向identical，因此只需要合成1 primer，Pol III holoenzyme 就能连续elongation。而lagging strand合成方向与fork的运动方向opposite，因此后随链的延伸是—个不连续的过程, 在后随链上周期性地合成primers，进而合成Okazaki fragments.
在复制叉处先导链和后随链协同复制的mechanism。两个催化核心分别与DNA的一条模板链结合。当holoenzyme 向前移动时，lagging strand的模板被甩出来。由于lagging strand template 在DNA pol III 全酶上绕转了180°而形成一个loop，因此lagging strand 的合成方向能够与leading strand 的合成方向是一致的。随着冈崎片断的elongation，这一loop 不断扩大。当冈崎片断合成到前一个片断的5’-end 时，这一大loop 就释放出来。在此之前，leading strand 的合成又将另一部分lagging strand 的template 置换出来，并在适于引发的位点上由primosome 合成了new primer，然后再形成一个小的loop，进行new Okazaki frag.的synthesis。
3.4.4 冈崎片段片断的连接
当pol III 将一段DNA 链延伸到前一个Okazaki fragment 的primer时，它既不能继续合成DNA，也cannot hydrolyze RNA primer。这时，必须由polI的5’一3’exonuclease activity来excise RNA primer (RNAaseH也参与这一切除过程)，同时polI 以其5’-3’polymerase activity 将适当的dNTP 聚合上来，也就是说进行了nick translation, then ligated by ligase。当前进到前一个片断的dNTP时，有时也能将切口再向前推进几个nt，但由于DNA ligase 的竞争，很快封合了nick。
3.5 Termination of DNA replication复制终止
3.5.1 Termination of circular DNA replication
1）Unidirection replication，terminus=ori.
2) Bidirection replication. How to terminate? 是通过两个方向的forks 相遇而终止呢还是有其他机制？不是简单相遇而终止，而是在与oriC 相对的region有termination regions, 终止区有many terminus, 终止就发生在终点上。Ex) E.coli chromosome DNA replication,
~在复制叉相遇点两边有2 termination regions，各含有multi terminus，分别为terE, terD, terA, terF, terC, terB。region1: terE, terD, terA; region2:terF, terC, terB.
~每个终止region只对one方向的fork有作用。region1: terminate only for fork1 (逆时针方向)；region2: for fork2（顺时针）。
One question: 如果两个forks 等速移动，到了中部相遇点后，是停止复制呢还是继续运动到各自的终止位点处停止复制呢？二者都不是，第一种情况没有利用终点；第二种情况下，两个终止信号之间的区域将被复制twice。Experiment indicate：
~Terminate at only one terminus. 显然两个复制叉移动的速度不一致，其中one fork先到达its terminus 后，stop moving，等another fork的到了，another fork到后也stop replication，并不继续前进到its terminus。
~Decatenation: 复制结束后，the two daughter DNAs exist as a catenane（环连体），它们在topo IV 的作用下实现解离decatenated by topo IV.
~Mechanism:
All terminuses contain a region of 22 bp, which specifically binds with Tus protein (terminus utiligation substance)，to form ter-Tus complex，引起fork stop。This complex非常stable，its half life is 550 min。In vitro，ter-Tus complex stops fork to move at oriC；In vivo，只有当复制叉以正确的方向进人terminus 时，才能发生
复制stop。除了Tus protein外，终止不需要other protein，Replication stops at the first nt of the ter sequence。3.5.2 Termination of linear DNA replication
With circular DNAs, there is no problem filling the gaps left when RNA primers are removed because another DNA 3’-end is always upstream to serve as primer. But in linear DNAs, once the first primer on each strand is removed, there is no way to fill in the gaps because DNA cannot be extended in the 3’à5’direction, and no 3’-end is upstream. 如果这个问题得不到解决，the DNA strand would get shorter every time they replicated，造成遗传信息的丢失。所以必然存在一个特殊的mechanism来synthesize linear DNA 的end，可能有5 种解决ways：
1) Telomere maintenance
Eukaryotic telomerase 能够avoid 5’-end 因primer 的excision而发生DNA shorten 的现象。Telomere(end of eukaryotic chromosome) are composed of GC-rich repeat sequences which is added by telomerase (端粒酶). The repeat sequence in telomere is species-specific. In Tetrahymena(四膜虫)，it is TTGGGG; in vertebrates including human, it is TTAGGG.
How does telomerase solve the problem?
①Telomerase: RNA serves as template for telomere synthesis Proteins
②Telomerase adds many repeated copies at 3’-end
③Primer synthesis
④Replication, filling the gap
⑤Primer removal
There is no problem when terminal primers are removed and not replace, because only telomere sequences are lost.
2)Taking cyclation at the beginning. Ex) λDNA.
3) Taking concatemer (连环分子)。Many linear molecules contain repeated sequence at each end, called terminal redundancy (末端冗余)。它意味着two daughter DNAs 的ends of ss are complementary，so ligated by ligase into dimer, called concatemer。生成的二聚体还可通过复制产生4mer、8mer 连环分子。再通过切、合成、连接成完整分子.Ex) T4 phage
4) Forming hairpin at each end．草履虫(Paramecium)的线性mtDNA.
5) Replication is initiated directly from the end by binding a protein at 5’-end. 5’末端共价连接蛋白质，借助蛋白质的介入来解决线性分子末端复制问题。Ex) adenovirus 腺病毒、29、Poliovirus (脊髓灰质炎病毒，一种ssRNA病毒)就采用这种方式。以adenovirus 为例：
~In mature AdDNA, 5’-end + TP(terminal protein, 55 KD)
~In replication, 5’-end + pTP(80 KD)
~Proteins: pTP, Adpol, DBP encoded by its genes
NF1, NF2 encoded by host genes
~Process:
①Formation of initiation complex: ⅰ）NF1 binding; ⅱ) In the presence of DBP and ATP, TP opens the dsDNA; ⅲ) Adpol catalyzes that pTP binds to C; ⅳ) pTP displaces TP;ⅴ) C pairs G at 3’-end on the template
②Elongation. C-OH + Dntp; NF2 relaxes supercoil
③Displacing strand to form a dsDNA and a ssDNA
④ssDNA forms hairpin and replicates by the same way.
DNA replication:
~Dna A binds to Ori. -----> bubble
~Helicase open up ds DNA
~SSB binds to ssDNA and prevent ds formation
~Primer synthesis by Dna G (primase)
~leading strand synthesis by DNA pol III
~Primer synthesis -----> lagging strand synthesis
~Remove primer by DNA Pol I à gap ----> gap fillingà nick
~DNA ligase seal nick
Chapter 4 DNA damage and repair损伤、修复（3 学时）
4.1 DNA damage损伤
复制中虽然有校对机制，以保持其高度的真实性，把遗传信息稳定地传给后代。但是，由于内在因素和外部条件的影响，仍会对DNA 造成damage。DNA damage is a chemical alteration. Mutation is a change in a base pair. Some damage can be repaired, and this damage can lead to mutations if left unrepaired.最普遍的DNA damage 有以下几种types：
1)Base lose：在physiological temperature 下，purine 中的glycosidic bond也会发生break，lead to lose purine，这个过程称depurine 作用。In E.coli．在pH7.0和37℃下，脱嘌呤的rate 约为1／300 one day; 随着pH值降低和温度升高．这个rate 会增大. Alkylating agents 能在A的N-7 site上加进alkyl，使N-glycosidic bond 变弱．从而enhanced depurine 作用。
2) Base distortion：在化学(烷化剂alkylating agent)或物理因素(如UV、X-Ray、ionizing radiation)作用下，base 可能发生巨大的change，造成purine or pyrimidine ring 的break。经常受影响的是嘧啶环，two adjacent thymines cross-link to form thymine dimer。
3) Strand break：许多agents 可以造成phosphodiester bond 的break，如peroxide，-SH compound，,Fe＋2, Cu ＋2等metal ion。
4)Cross-links action:有些abtibiotics，如丝裂霉素(Mitomycin C)和某些chemical agent亚硝酸盐nitrite能够form covalent bond between two DNA strands，这就block two strands to open，因此对DNA replication 具有block作用。
4.2 DNA repair
显然，为了保证G.I的high stability，生物cell在evolution过程中形成了一系列的repair mechanism。生物体不仅演化出能修复偶然的复制错误的系统replication repair，如DNA pol 的3’-5’的proofreading function、U-N-glycosylase repair system、mismatch repair system；而且还存在着能repair 损伤的系统demage repair，如light repair system、excision repair system、recombination repair system、SOS repair system。为了对付foreign DNA 的入侵，有些生物还演化出restriction\modify system。从广义上来说，DNA pol 的校对功能也可以算作修复系统，然而它是DNA 聚合酶所具备的性质，在DNA 聚合过程中发生，wrong base 并不存在于DNA 链的内部，而只是瞬时存在于链的生长点上，因而仍然belong to replication的范畴。而U-N-glycosidase repair and mismatch repair system 所要修复的wrong base 已经存在于new DNA strand 的内部，因而本质上是属于repair 范畴的；然而这两种修复系统主要作用于复制过程中和复制完成后的较短时间之内，因此也称之为复制修复(replication repair)。
4.2.1 Replication repair 复制修复
1）U-N-glycosylase repair system
前面我们已经讲过，生物体内虽然有dUTPase，但仍然会有few dUTP分子还是能渗入DNA 链中。另一方面，在细胞内由于C 的自发的deamination(deaminize)氧化而生成U。由于U can bind to A，PolIII 的proofreading 功能无法recognize it。这时，通过U-N-glycosylase system 来repair 的。This system consists of U-N-glycosylase，AP endonuclease，PolI，DNA ligase。
2）mismatch repair system 错配修复系统
DNA replication时，偶尔也能发生wrong bases 渗入的情况，这时通常由DNA pol 发动它的3’-5’的proofreading 功能立即进行revise，然后再开始下一个nt 的polymerization reaction。但在some special condition 下，DNA pol 对极少数wrong bases 不能进行proofreading。这种error 发生的rate 为10 一10或一11。由于DNA 的完整性和精确性是生命的根本所在，因而细胞中演化出另一个修复系统，叫做mismatch repair system，给予第二次纠正错误的机会。那么，This system 是how to recognize nonpairing的wrong base 而进行纠正呢? 原来cell 中的methylation 与这种recognization 有关。在DNA 中，天然的methylated bases fall into two types，一种是N6-methyladenine，一种是5-methylcytosine。胞嘧啶的甲基化与此无关，不在这里介绍。
~ methyladenine(A*): identification tags that distinguish parental strand from progeny strand.
~Parental strand: degree of methylation is high and even;
Progeny strand: methylated gradient. The nearer to replication fork, the smaller degree of methylation。根据这些特征，mismatch repair system 就可以recognize which strand is parental or progeny strand，从而对new strand 上的wrong bases 进行revise。
~GA*TC: 这一标志具有base sequence specificity，N6- methylated adenine一般都包含在GA＊TC 这样的顺序中.
~A* is created by a methylating enzyme that recognizes the sequence GA TC and places a methyl group on the A.
~ methylating enzyme：encoded by dam gene. The donor of methyl is S-adenyl L-methionine. 迄今未见其他甲基供体能满足这一反应的要求。
~mismatch repair system contains：
①mismatch correction enzyme: identify wrong bases on newly strand and unmethylated sequence GATC. This enzymes are encoded by mutH,mutL and mutS; ②DNA pol I ; ③DNA ligase.
~This process must occur fairly soon after mismatch is created, or both strands will be methylated and no distinction between them will be possible
~This system is also important to remove 渗入DNA的base analogue。有些碱基类似物能够与template 上的base pairing 生成H bond 而不能被DNA pol 的校对功能所识别；但是这种碱基类似物常有烯醇式enol form和酮式keto form 的conversion，因而在下一轮复制时则会引起mutation。错配修复能够在before next replicaton 将base analogue 去除。
4.2.2 Damage repair
生物体内外许多factors（如alkylating agent、UV、ionizing radiation
等）都能造成DNA 分子的damage。DNA 分子的损伤类型很多，其中以密淀二聚体，特别是thymine dimer 的formation和repair mechanism 研究得最为清楚，也是本节阐述的重点。
1) Formation of T dimer
UV: 目前能引起mutant 的重复性最好的方法，而且在Nature 中存在概率比较高的mutagen.在UV 照射时，base 可能发生巨大的change，两个碱基平面被distortion，使，two adjacent thymines cross-link to form T dimmer(BasesàdistortionàT dimmer)。由于duplex conformation发生change，H bond binding power也显著减弱。这样，当有dimer的DNA作为template进行replication时，Pol III 将2 A adding，但由于cannot form H bond，由3’-5’proofreading function使之hydrolyze。然后，再adding，再excision，这样反复发生，就会consume 大量的dATP，而replication则毫无进展。由于protein仍在不断synthesis，而DNA 不能replication，cell 也就不能division。If 得不到修复，最后导致cell die。
2)Biological evidence of DNA repair
3) Repir mechanism
对于T dimer，主要有4 repair ways，可以fall into two types，light repair and dark repair。Dark repair: excision repair, recombination repair,SOS repair。
（1）Light R：在visible light (400-800nm) action下，photoreactivatingenzyme 光复活酶(PR enzyme)被activation，break C -C bond of T dimmer,回复正常。在bacteria和animal cell中都分离到这种酶，这种酶并不absorb light．But when it binds to DNA, it can absorb light，利用light energy，break dimer 中的C-C bond，使DNA 得到repair。
（2）Excision R：enzyme can recognize T dimer 所引起的abnormal form.A)Some phages: cutting—filling—excision—sealing.
~Cutting: in front of dimer by endonuclease
~Filling: Pol I synthesizes 20 nts，displace the ssDNA with dimmer
~Excision: the displaced ssDNA
~Sealing: the nick is ligated by ligase
B)E.coli: 是由所谓Uvr系统来完成的．It consists of UvrA, UvrB和UvrC.具有endonuclease. UvrABC 沿着DNA 链滑动，当它触摸到nonnormal form 时，立即触发endonuclease activity。
~Cutting strand on two sides of the dimer
~Excise 12 nts
~Synthesis by pol I and ligation by ligase
（3）recombination repair：in uvrA—mutant，切除修复机制被破坏，受UV 照射后，产生许多pyrimidine dimer，但仍然可以survival，这说明一定有另一种repair mechanism 存在。recA gene 是E.coli 中进行R. R所必需的gene，在recA—mutant中不会发生R.R。由于excision repair 系统在recA—中能正常发挥function，所以recA gene 所引起的repair role 显然与excision repair 不同, 这就是所谓recombination repair 系统。对uvrA—recA—double mutant 的定量分析进一步证实了这两个修复系统的existence。R.R 系统修复efficiency 比E.R 系统更高，因为recA—比uvrA—对UV的sensitivity 更高。前面我们已经讲过，T dimer 会引起PolIII 在dimer 上进行反复的adding 和excision，使cell 消耗了huge amount of dATP 而没有DNA 的合成，如果得不到修复，最终导致cell 的死亡。How do it?
A) DNA Pol III 能跳过dimer 部位，post-dimer synthesis，~
B) 大概adding 去，越过dimer 继续进行, 使replication 不会停止,trans-dimer synthesis, ~
RecA binds to ssDNA Hybrid. Fill gap using Enzyme opens hybrid Excision R
B strand as template
Except RecA，R.R also needs other many enzymes，exact mechanism尚不清楚，这里提供的只是一个模型而已。（4）SOS repair：SOS R 系统是一种应急system，其feature:
~RecA; ~Error prone(易造成错误); ~inducible.
①λ+ UV--àinfection of E.coli
②λ+ UV ---------àinfection of E.coli
E.coli + UV
Conclution：λhas no repair system, but E.coli 受UV irradiation时，SOS R 就被turn on，E.coli 在repair itself 的同时，也repaired λ。
~SOS R mainly controlled by RecA and LexA two protein
~LexA 是SOS 修复基因的repressor，binding to operator; but RecA has recombination activity and proteolytic activity
~RecA binds to ssDNA
~Proteolytic activity
~LexA hydrolysis
~Expression of repair gene (15 种，寿命life 短)
~Turn on SOS R
~DNA repair complete---no ssDNA---RecA inactive---LexA binds to
O---Turn off SOS system。
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
分子标志物：指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。 DNA结构： DNA的二级结构是双螺旋结构：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove) 及小沟(minor groove)相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G=C）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。 DNA的三级结构是超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positive super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negative super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。 原核生物DNA的是环状超螺旋结构 核小体(nucleosome) 是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 RNA结构： 一级结构：核苷酸连接方式同DNA。RNA的一级结构即指核苷酸的连接方式、数量和排列 方式。 主要结构特征：①含有稀有碱基（修饰碱基）；②不遵守Char gaff原则；③多数为单链分子，形成链内双链二级结构（发夹结构）；④碱基配对：A-U，G-C。 t RNA二级结构：DHU环反密码环额外环 TΨC环氨基酸臂 t RNA的三级结构是倒L型 t RNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。 m RNA的结构与功能: 1）基本特点：含量低（约占总RNA的1%～5%）；种类多（上万种）；分子大小差异大（几百～约2万个核苷酸）；半衰期短。 2）结构特点：编码区——决定蛋白质的一级结构，包括起始密码子、终止密码子、外显子。非编码区——与蛋白质生物合成的调控有关，包括5′非编码区（帽结构、核蛋白体识别结合位点等）、3′非编码区（多聚腺苷酸尾）、间隔序列（内含子）。大多数真核m RNA 的5′末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C′2甲基化，形成帽子结构m7GpppN-。大多数真核m RNA的3′末端有一个多聚腺苷酸(poly A)结构，称为多聚A尾3）功能：作为蛋白质合成的模板。 帽子结构和多聚A尾的功能：m RNA核内向胞质的转位、m RNA的稳定性维系、翻译起始的调控 增色效应：核酸分子在变性过程中，其溶液的A260会增大，此现象称为增色效应。 融解温度（Tm）：DNA分子热变性程度达到50%时所对应的温度，称为融解温度或解链温度。 Tm的影响因素： ①DNA分子的碱基组成Tm与DNA分子碱基组成的关系 AT富集区先解链，GC富集区后解链。 ②溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度溶液中，DNA的Tm较低， 且解链温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm较高，解链温度范围较窄。 ③ pH 一般情况下，核酸溶液的pH在5~9范围内，DNA的Tm变化不明显；当溶液的pH<4或>11时，DNA的Tm会降低。
分子生物学试题及答案 一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。 3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。 9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA 及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。 14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。 17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’→3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、 （mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。 10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（ S2）开始，无G时转录从（ S1）开
1. 半保留复制（semiconservative replication）：DNA复制时，以亲代DNA的每一股做模板，以碱基互补配对原则，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为半保留复制。 2.复制子replicon：由一个复制起始点构成的DNA复制单位。 57. 复制起始点(Ori C)DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸序列顺序的片段，即复制起始点。 24.（35）复制叉（replication fork）是DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。 3. Klenow 片段klenow fragment：DNApol I（DNA聚合酶I）被酶蛋白切开得到的大片段。 4. 外显子exon、extron：真核细胞基因DNA中的编码序列，这部分可转录为RNA，并翻译成蛋白质，也称表达序列。 5.（56）核心启动子core promoter：指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区。（Hogness区） 6. 转录（transcription）：是在DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。 7. 核酶（ribozyme）：是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。 8.（59）信号肽signal peptide：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。 9.顺式作用元件（cis-acting element）：真核生物DNA中与转录调控有关的核苷酸序列，包括增强子、沉默子等。 10.错配修复（mismatch repair，MMR）：在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式；主要用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还能修复一些因复制打滑而产生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶III和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。 直接修复direct repair：是将被损伤碱基恢复到正常状态的修复。有三种修复方式：1光复活修复2、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶修复3单链断裂修复。
分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面？ 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度)：DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成：由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱
Northern blot：是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA 通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因表达的有效手段。与Southern blot 相比，它的条件更严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。实验步骤：1.用具的准备2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染3．制胶4. RNA样品的制备5.电泳6.转膜7.探针的制备8.探针的纯化及比活性测定9．预杂交10．探针变性11．杂交12．洗膜13．曝光14．去除膜上的探针15．杂交结果 半定量PCR要求比普通PCR更严格一些，另外往往通过转膜后的同位素杂交检测或凝胶成像后的灰度测定比较样品间的差异。 半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如β-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个β-actin的内参照对照。 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1．实时荧光定量PCR无需内标 2．内标对实时荧光定量PCR的影响 Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法） 检测两种蛋白质相互作用方法 1共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析 2蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。 3免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高4 Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 1.酵母双杂交 2.GSTpull-down实验 3.免疫共沉淀 4.蛋白质细胞内定位 RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法 1.此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有 利用价值的信息 2.节约了实验所花费的经费和时间。 3.只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长 基因特异性引物（GSPs）应该是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 注意事项 1.cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高
分子生物学与基因工程 绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代” 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用。 核酸概述 1、核酸的化学组成 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖；
（2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链； （4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。
分子生物学总结完整版 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、 DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、 Tm(熔链温度)： DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分
9、 DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为 3、4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0、34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列1 1、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复
绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了?脱氧核糖核苷酸的结构?的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分
分子生物学 1．DNA的一级结构：指DNA分子中核苷酸的排列顺序。 2．DNA的二级结构：指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构以及四股螺旋结构。3．DNA的三级结构：双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。 4．DNA的甲基化：DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。甲基化修饰在原核生物DNA中多为对一些酶切位点的修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物中的DNA甲基化则在基因表达调控中有重要作用。真核生物DNA中，几乎所有的甲基化都发生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’. 5．CG岛：基因组DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的,但有些成簇的、稳定的非甲基化的CG小片段,称为CG岛,存在于整个基因组中。“CG”岛特点是G+C含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。 6．DNA双螺旋结构模型要点： （1）DNA是反向平行的互补双链结构。 （2）DNA双链是右手螺旋结构。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，螺距为3.4nm. DNA 双链说形成的螺旋直径为2 nm。每个碱基旋转角度为36度。DNA双螺旋分子表面 存在一个大沟和一个小沟，目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。（3）疏水力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定。DNA双链结构的稳定横向依靠两条链互补碱基间的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。 7．核小体的组成： 染色质的基本组成单位被称为核小体，由DNA和5种组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4共同构成。各两分子的H2A,H2B,H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样结构。 8．顺反子（Cistron）：由结构基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。 9．单顺反子（monocistron）：真核生物的一个结构基因与相应的调控区组成一个完整的基因，即一个表达单位，转录物为一个单顺反子。从一条mRNA只能翻译出一条多肽链。10．多顺反子(polycistron): 原核生物具有操纵子结构，几个结构基因转录在一条mRNA 链上，因而转录物为多顺反子。每个顺反子分别翻译出各自的蛋白质。 11．原核生物mRNA结构的特点: (1) 原核生物mRNA往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息。 （2）mRNA 5‘端无帽子结构，3‘端无多聚A尾。 （3）mRNA一般没有修饰碱基。 12．真核生物mRNA结构的特点： （1）5‘端有帽子结构。即7－甲基鸟嘌呤－三磷酸鸟苷m7GpppN。 （2）3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。 （3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。 （4）分子中有编码区和非编码区。 14．tRNA的结构特点 （1）tRNA是单链小分子。 （2）tRNA含有很多稀有碱基。 （3）tRNA的5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG. （4）tRNA的3‘端是CCA－OH序列。是氨基酸的结合部位。 （5）tRNA的二级结构形状类似于三叶草，含二氢尿嘧啶环（D环）、T环和反密码子环。
第0章绪论 一、名词解释 1.分子生物学 2.单克隆抗体 二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。 三、是非题 1、20世纪60年代，Nirenberg建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果发现poly(U)指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly(G)指导甘氨酸的合成。（×） 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21世纪是生命科学的世纪。20世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？ 答案： 一、名词解释 1.分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。
2.单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1.结构分子生物学，基因表达与调控，DNA重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 答案： 有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用：从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 3. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来
基础分子生物学 三、选择题 1、RNA 合成的底物是------ ---------。 A dATP, dTTP , dGTP , d CTP BATP, TTP , GTP , CTP C ATP ,GTP, CTP,UTP D 、GTP, CTP,UTP，TTP 2．模板DNA的碱基序列是3′—TGCAGT—5′，其转录出RNA碱基序列是：A．5′—AGGUCA—3′ B．5′—ACGUCA—3′ C．5′—UCGUCU—3′ D．5′—ACGTCA—3′ E．5′—ACGUGT—3′ 3、转录终止必需。 A、终止子 B、ρ因子 C、DNA和RNA的弱相互作用 D上述三种 4、在转录的终止过程中，有时依赖于蛋白辅因子才能实现终止作用，这种蛋白辅因子称为---- -----。 A σ因子 B ρ因子 C θ因子 D IF因子 5．识别RNA转转录终止的因子是： A．α因子 B．β因子 C．σ因子 D．ρ因子 E．γ因子 6．DNA复制和转录过程有许多异同点,下列DNA复制和转录的描述中错误的是： A．在体内以一条DNA链为模板转录，而以两条DNA链为模板复制 B．在这两个过程中合成方向都为5′→3′ C．复制的产物通常情况下大于转录的产物 D．两过程均需RNA引物 E．DNA聚合酶和RNA聚合酶都需要Mg2+ 7、核基因mRNA 的内元拼接点序列为。 A、AG……GU B、GA……UG C、GU……AG D、UG……GA 8、真核生物mRNA分子转录后必须经过加工，切除---------，将分隔开的编码序列连接在一起，使其成为蛋白质翻译的模板，这个过程叫做RNA的拼接。 A 外显子 B 启动子 C 起始因子 D 内含子 9、在真核生物RNA polⅡ的羧基端含有一段7个氨基酸的序列，这个7肽序列为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser ,被称作。 A C末端结构域 B 帽子结构 C Poly(A)尾巴 D 终止子 10．真核生物RNA的拼接需要多种snRNP的协助，其中能识别左端（5’）拼接点共有序列的snRNP 是： A．U1 snRNP B．U2 snRNP C．U5 snRNP E．U2 snRNP+ U5 snRNP 四、是非题 1、所有的启动子都位于转录起始位点的上游。（ X ） 2、RNA分子也能像蛋白酶一样，以其分子的空间构型产生链的断裂和和合成所必须的微环境。（对） 3、真核生物的mRNA中的poly A 尾巴是由DNA编码，经过转录形成的。（ X ） 4、在大肠杆菌RNA聚合酶中，β亚基的主要功能是识别启动子。（ X ） 5、所有起催化作用的酶都是蛋白质。（ X ） 五、问答题
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学作业 第一次 1、Promoter：（启动子）一段位于结构基因5…端上游、能活化RNA聚合酶的DNA序列，是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系转录的特异性与效率。 2、Cis-acting element：（顺式作用元件）影响自身基因表达活性的非编码DNA序列，组成基因转录的调控区包括：启动子、增强子、沉默子等 一、简述基因转录的基本特征。（作业）P35 二、简述蛋白质生物合成的延长过程。P58 肽链的延伸由于核糖体沿mRNA5 ′端向3′端移动，开始了从N端向C端的多肽合成。 起始复合物，延伸AA-tRNA，延伸因子，GTP,Mg 2+，肽基转移酶 每加一个氨基酸完成一个循环，包括: 进位：后续AA-tRNA与核糖体A位点的结合 起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA在EF-Tu作用下，结合到核糖体A位上。 通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-Tu?GTP复合物，参与下一轮循环。 需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子。 转位：P位tRNA的AA转给A位的tRNA,生成肽键； 移位：tRNA和mRNA相对核糖体的移动； 核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子，二肽酰－tRNA2进入P位，去氨酰-tRNA 被挤入E位，空出A位给下一个氨酰-tRNA。移位需EF-G并消耗GTP。 三、真核细胞mRNA分子的加工过程有哪些？P40 1、5’端加帽 加帽指在mRNA前体刚转录出来或转录尚未完成时，mRNA前体5’端在鸟苷酸转移酶催化下加G,然后在甲基转移酶的作用下进行甲基化。 帽子的类型 0号帽子(cap1) 1号帽子(cap1) 2号帽子(cap2) 2、3’端的产生和多聚腺苷酸花 除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3?末端都有poly(A)序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个A 。 大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，1/3没有。 带有poly(A)的mRNA称为poly(A)+， 不带poly(A)的mRNA称为poly(A)－。 加尾信号： 3?末端转录终止位点上游15～30bp处的一段保守序列AAUAAA。 过程： ①内切酶切开mRNA3?端的特定部位； ②多聚A合成酶催化加poly(A)。 3、RNA的剪接
分子生物学实验基础 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transforma tion）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（p lasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。
分子生物学知识点Last revision on 21 December 2020
一、名词解释： 1. 基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位，是负载特定遗传信息的DNA片段，编码具有生物功能的产物包括RNA和多肽链。 2. 基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程，包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程。 3.管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因，其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响。如GAPDH、β-肌动蛋白基因。 4. 启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段。 5.操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。 6.反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子（转录因子）。 7.顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列。是转录因子的结合位点，通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控。 8. Ct值：即循环阈值（cycle threshold，Ct），是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。（它与PCR扩增的起始模板量存在线性对数关系，由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。） 9.核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互不配对的核酸单链（包括DNA和DNA，DNA和RNA，RNA和RNA）相互结合形成杂合双链的特