生物材料与细胞相互作用及表面修饰
葛泉波 何淑兰 毛津淑 姚康德＊
(天津大学材料学院高分子材料研究所 天津 300072)
摘 要 生物材料用作人工细胞外基质(EC M s)在组织工程中起重要作用。生物材料表面的拓扑结构、亲水/疏水平衡、自由能、电荷状况、化学基团和生物特异性识别对材料/细胞相互作用有较大影响。生物材料表面与细胞的相互作用主要是细胞膜表面受体与生物材料表面配体间的相互分子识别,
因此采用仿生修饰生物材料表面以提高细胞亲和性和特异性识别。本文对生物材料与细胞相互作用及表面修饰的技术方法进行了介绍。
关键词 组织工程,生物材料,细胞,表面修饰
The Interaction between Biomaterials and Cells and Surface
Modification of Biomaterials
Ge Quanbo,He Shulan,Ma o Jinshu,Yao Kangde＊
(Research Institute of Polymeric Materials,Tianjin University,Tianjin300072,China)
A bstract Biomaterials as artificial extracellular matrices(EC M s)have played a crucial role in tissue
engineerin g.Topological structure,hydrophilic hydrophobic balance,free energy,charges,functional groups and biologic specificity recognition of biomaterials surface greatl y affect the interaction between biomaterials and cells.
Biomaterials-cells interaction is mainl y the molecule recognition between receptors of cells and ligands of biomaterials s urface.For the purpose of enhancing cells affinity and specificity recognition,biomimetic modification of biomaterials s urface is essential.This paper introduces the interaction between biomaterials and cells and several surface modification methods for biomaterials.
Key words Tissue engineering,Biomaterials,Cell,Surface modification
组织工程是运用工程科学与生命科学的基本原理和方法研究与开发生物替代物,从而恢复、维持和改进人体组织功能的一门新兴交叉学科[1]。其基本策略是在体外模拟生理环境,将组织细胞黏附在生物相容性良好且可降解吸收的多孔支架材料上,并提供营养使之扩增,形成细胞与支架复合物,然后将复合物植入机体内。随着支架材料逐步降解,细胞不断增殖并分泌细胞外基质,最终形成与原来功能、形态相对应的组织,达到修复创伤和重建功能的目的。
随着分子细胞生物学的发展,第三代生物材料(细胞和/或基因活化生物材料)的设计理念已逐渐清晰,即从分子水平上控制生物材料与细胞间的相互作用,引发特异性细胞反应,抑制非特异性反应,实现细胞黏附、增殖、分化、凋亡及细胞外基质的重建[2]。细胞与生物材料间的反应和材料表面性能有密切关系,所以深入研究仿生工程化生物材料表面与细胞间的相互作用是设计和改进第三代生物材料的关键[3]。表面修饰生物材料,使其具备良好的生物相容性及能使细胞和分子产生
葛泉波 男,24岁,硕士生,现从事组织工程材料研究。 ＊联系人
国家重点基础研究发展规划资助项目(G1999054305)
2003-12-30收稿,2004-05-18接受
响应的特异性识别位点,是当前研究的热点。本文介绍了生物材料表面与细胞的相互作用,并总结了生物材料表面修饰的技术方法。
1 生物材料表面性质的仿生化
1.1 生物材料表面的拓扑结构
从材料学的角度讲,材料结构决定材料性能,所以表面微观结构对表面性能有重大影响。生物材料表面的拓扑结构(表面的粗糙度、孔洞的大小及分布、沟槽的尺寸和取向等)对细胞的黏附、铺展、增殖、分化、功能表达有很大影响。Chung等先将聚乙二醇(PEG)接枝到聚氨酯(PU)表面,生成接枝产物PU-PE G,再将N-琥珀酰亚胺/6-(4-叠氮-2-硝基苯胺)/己酸酯(SANPAH)和多肽Gly-Ar g-Gly-Asp(GR GD)分别溶于乙醇和蒸馏水中,室温暗室共混反应2h,生成苯基叠氮衍生多肽,最后通过紫外光照射将其固定在PU-PE G表面,在纳米尺度上提高了表面粗糙度,MTT检测表明体外培养的人脐静脉内皮细胞生长速率有所提高[4]。细胞在识别材料表面特征时,可响应微米和纳米尺度的表面拓扑结构,产生接触引导,所以人们可利用材料表面拓扑结构来调控细胞行为。Dalby等利用聚苯乙烯(PS)和聚(4-溴代苯乙烯)(PBr S)共混浇铸成膜,表面形成岛状拓扑结构,种植入成纤维细胞后发现,细胞对岛状结构非常敏感,黏附后迅速产生丝状伪足,细胞骨架迅速形成[5]。生物材料表面的微结构域可以调控细胞与基质的信号传导,从而影响细胞黏附结构域的形成和细胞骨架的发育,最终形成具有高度取向的细胞图案。研究发现,条纹几何形状的表面有利于细胞的取向和运动[6]。Matsuzaka等将鼠骨髓细胞种植在具有细微纹沟的聚乳酸表面,培养8d后,发现细胞呈扁平状,与表面纹沟平行排列分布;培养16d后,发现矿化基质沉积在表面,且与表面纹沟平行排列分布。表面微纹结构基体上的细胞碱性磷酸酶(ALP)活性明显高于表面光滑基体上的细胞,这表明表面微纹拓扑结构对细胞生长有一定促进作用[7]。生物材料表面的微图案化,有望促进且调控特异细胞的生长和空间分布。
1.2 生物材料表面的亲水/疏水平衡
一般讲,亲水性表面对细胞黏附有促进作用,疏水性表面对蛋白质的吸附功能较强。蛋白质与生物材料表面接触和吸附过程中,常伴随水/蛋白质的吸附交换,而异种蛋白质间的吸附交换常有Vroman效应产生[8]。细胞与材料间的黏附是以蛋白质为介导而发生的,过于良好的亲水性表面不利于蛋白质的吸附,因此适宜细胞黏附、生长的表面有一最佳的亲水/疏水平衡值,此值因不同种类细胞而异。
1.3 生物材料的表面能
实验发现,生物材料的表面能量影响细胞的黏附,表面能较高的表面比能量较低的表面有利于细胞的黏附[9]。Satriano等采用52keV氩离子束照射聚羟基甲基硅氧烷和聚对苯二甲酸乙二酯,优化了基体材料的表面自由能参数,促进了人真皮成纤维细胞在改性材料上的黏附和增殖[10]。
1.4 生物材料的表面电荷
哺乳动物细胞膜表面荷负电,一般讲,荷正电的材料表面与荷负电的细胞由于静电吸附而利于细胞黏附,荷负电的材料表面与荷负电的细胞由于静电排斥,不利于细胞黏附[11]。研究发现,通过固定含有丰富带正电基团的氨基酸(如赖氨酸)在材料表面,可以提高材料的表面电荷浓度,增加黏附细胞的数量和增强细胞的黏附力[12]。
1.5 生物材料表面的化学基团
材料表面的化学结构是影响细胞的黏附生长的重要因素。一般而言,砜基、硫醚、醚键等对细胞生长影响不大,芳香聚醚类等刚性结构不利于细胞黏附,羧基、磺酸基、氨基、亚氨基及酰胺基等
基团有利于细胞的黏附和增殖。含氮基团不仅能使材料表面带一定的正电荷,调节表面的亲水/疏水平衡,可以与蛋白质肽链发生官能团间的相互作用,能促进细胞黏附[13,14]。材料表面如果具有可供反应的化学基团,可与配基共价连接,固定一些生物活性分子在材料表面,如细胞黏附因子等,从而促进细胞的黏附。
1.6 生物材料表面的生物特异性识别
生物材料植入体内后一般会产生非特异性和特异性相互作用,根据组织工程学对生物材料的基本要求,需要抑制非特异性相互作用而构建特异性识别位点,以诱发细胞和组织响应。一种策略是通过表面改性,提高生物材料表面性能,创造惰性表面,如材料表面接枝聚氧化乙烯(PE O);另一种策略是优化提升生物材料与细胞的特异性相互作用,可在材料表面引入化学信使(message),使其和细胞膜表面的相应受体形成配合物,实现分子的特异性识别[15]。组织工程中将多肽固定在生物材料表面,制成受体专门性材料,可促进受体介导的细胞对材料的黏附来提高其生物相容性,促进细胞黏附、扩展和细胞骨架的形成,实验证明RGD多肽修饰的材料能显著增加细胞运动的持续时间[16]。
2 生物材料表面与细胞的相互作用
从细胞和分子水平看,细胞与生物材料表面间的相互作用可用细胞膜与材料表面结合位点间的相互作用来描述,细胞膜受体与材料表面配体的结合方式主要有配位结合、疏水性结合、静电结合、氢键结合等,在生理环境中,贴壁细胞与植入材料的相互作用实际上是细胞膜表面受体与生物材料表面配体间的相互间分子识别,产生生物特异性与非特异性相互作用。当材料植入体内,细胞膜表面的受体积极寻找与之接触的材料表面所能提供的信号,以区别所接触材料为自体或异体,因此深入理解生物材料表面与细胞相互作用并进行表面修饰是临床应用材料设计的关键[17]。
细胞和细胞外基质间粘连不仅使其保持形态,还起着细胞间信息传送和功能调节的重要作用。细胞表面和基质表面分子间特异性相互作用,调节细胞黏附、增殖、分化和凋亡,维持细胞生长和凋亡的动态平衡。细胞和基材的黏附很大程度上由吸附的血清蛋白层决定,血清中200种以上的蛋白质经过竞争吸附过程后形成吸附层,其中有少量的蛋白质(如纤连蛋白、层连蛋白及玻连蛋白等)有助于细胞黏附,但是吸附层中不促进细胞黏附作用的蛋白质(如白蛋白)却占多数,因此消除非特异性吸附非常重要。当植入材料生物体系统的非特异性吸附作用被完全抑制,同时又具备细胞识别的相应位点,则会被细胞认为是自体,实现材料和细胞的融合作用,积极诱导组织再生。从仿生的角度出发,组织工程支架可视为人工细胞外基质(EC Ms),表面修饰旨在抑制非特异性相互作用,引入特异性相互作用位点,使人工E CMs在体内生理环境中发挥其功能。设计处理具有特定理化特性与其生物可识别能力相结合的医用高分子材料,通过计算机辅助设计,将研制出新型的人工识别材料系统,使功能团在聚合物骨架、交联结构及大分子网络中精确定位,是未来分子生物学和材料学的发展趋势[18]。
在组织工程中,组织工程用支架植入体内后,生体内的细胞受体积极在支架表面搜寻配体,以期得到响应。细胞首先要在支架表面黏附上,才能够增殖和分泌细胞外基质。黏着斑黏附(focal adhesion)是细胞与基质黏附接触的常见形式。黏着斑由整连蛋白作为主要黏附受体和相关细胞质斑蛋白包括踝蛋白、纽蛋白、α-肌动蛋白、张力蛋白、桩蛋白和大量蛋白激酶组成[19]。整联蛋白(integrin)是细胞表面受体的一个主要家族,主要参与调节细胞与EC Ms选择性黏附及细胞间的相互作用,直接影响到细胞的生长、增殖、凋亡等生理活动,包含由14种α及8种β两大类亚单元构成的20多种不同杂二聚体跨膜蛋白。细胞识别主要基于整联蛋白与EC Ms中配体的相互识别,实
现信号传递[20]。黏着斑是接触表面与肌动蛋白微纤接触的主要位点,它的形成与细胞延展过程有关,所以黏着斑是细胞黏附和运动协同作用的位点。整联蛋白与黏附分子配体和细胞骨架蛋白及一些细胞内信号分子相连,有效地传导由E CMs到细胞内的信号,从而影响细胞的生物学行为[21]。
3 生物材料的表面修饰
表面修饰是指在不改变材料本体性能的前提下,赋予其表面新的性能。组织工程用生物材料作为植入材料,使用时主要考虑其生物相容性,即材料表面与宿主间界面上的相互作用,因此对植入材料的改性主要是对其表面的修饰。
3.1 物理包被法
通过一个能连续循环浸渍的装置,将溶液中的化学成分通过物理吸附力(范德华力、静电作用、亲/疏水相互作用等)的作用引入生物材料最外层表面。该法简易可行。吸附不牢固、易脱落,是其一大缺点。在对吸附质量要求不高的领域,仍有其一定的应用价值。Yang等物理包被R GD多肽修饰聚乳酸-赖氨酸(PLA-PLL)三维支架材料,体外培养骨细胞,发现骨细胞迁移、扩增和分化良好[22]。
3.2 物理截留法(entrapment)
溶胀是高聚物特有的现象。控制溶剂相和非溶剂相(如水)比例,可以使高聚物表面溶胀而不溶解,原本紧密缠绕着的分子链处于相对松弛状态。加入改性组分(常溶解在非溶剂相中),其链段通过分子运动可进入高聚物表面链段之间。然后用非溶剂相浸泡,使高聚物表面链段收缩,溶胀现象消失。改性组分分子链段与高聚物分子链相互缠结,形成表面互穿网络结构,从而达到固定的目的[23]。与其它方法相比,截留法具有独特的优势,它几乎在所有基本化学实验室就可进行,工艺简单,效果颇佳。Zhu等先将聚乳酸(PDL-L A)膜浸泡在溶解了海藻酸钠和氨基酸衍生物接枝产物的水/丙酮(V(水)/V(丙酮)=70/30)溶液中,再转移到CaCl2溶液中,在PDL-L A表面形成不溶于水的凝胶网络结构。培养软骨细胞后发现,细胞的黏附、增殖和活性明显提高[24]。
3.3 表面化学接枝法
表面化学接枝一般仅限于材料表面发生的非均相反应。为达到只在表面层进行选择性接枝,必须控制自由基的数量和浓度及单体的扩散与渗透仅限于表面层发生。偶合接枝是一种简单可行的方法,化学键共价固定生物分子通常以双官能团交联剂为中介,交联剂的一端通过—COOH、—OH、—NH2等官能团连接在基体材料表面,另一端有一可变的悬吊基团用于结合单体分子。要求材料表面及要偶合接枝上去的单体两者都有可能发生偶合的官能团,否则要设法引入活性官能团。Klee等将单体4-氨基二聚对二甲苯邻甲酸650℃减压条件下化学蒸气沉积,18℃下浓缩在聚偏二氟乙烯(PVDF)表面,环己二异氰酸酯(HDI)活化表面氨基,接枝上纤连蛋白(FN),培养成骨细胞,发现细胞的增殖能力大大提高[25]。Cui等采用氢氧化钠溶液表面水解聚乳酸(PLLA),水溶性碳二亚胺(E DC/NHS)活化表面羧基,共价键合壳聚糖(C S)分子,提高了材料表面的亲和性,在其表面培养牛软骨细胞,发现细胞活性和增殖率均比未改性PLLA显著提高[26]。
3.4 高能辐射法
高分子材料表面辐射改性的放射线源有γ射线(60Co)、β射线(85Kr)、α射线(210Po)及X射线和电子射线等。由于放射线能量比化学键能高,利用它照射材料表面后,聚合物表面经离子化,激发产生自由基,自由基与单体接枝聚合,达到改性目的。辐射接枝是由射线引发,不需要向体系添加引发剂,与化学接枝相比,可得到非常纯的接枝聚合物,是改性医用高分子的有效方法。Kwon等采用预辐射接枝技术,将甲基丙烯酸环氧丙酯(E PMA)接枝到聚丙烯(PP)表面,引入磷酸官能团并且
在表面固定肝磷脂,实验表明黏附血小板数量减少,血栓形成降低,提高了材料的血液相容性[27]。高能辐照会改变材料表面微观结构,导致拓扑形貌、湿润性和生物相容性的变化。Mirzadeh等采用CO2和KrF受激准分子脉冲激光束照射聚对苯二甲酸乙二酯(PE T)表面,发现表面形貌变化较大,体外培养L929成纤维细胞,细胞黏附和扩展能力有所提高[28]。
3.5 光化学法
光化学法利用紫外线或可见光照射产生一系列光化学反应而固定生物分子,其中紫外线辐照是研究的热点。紫外光的波长范围在200～400nm,能量达300～600kJ/mol,大多数共价键能均处于这一范围内,故紫外光可激发生成自由基,在材料表面引发自由基接枝共聚反应。紫外光接枝是适合表面改性的有效方法,它具有以下优点:(1)紫外光比高能辐射对材料的穿透力差,故接技聚合可严格地限定在材料的表面或亚表面进行,改性反应仅发生在表面50～100nm深度内,不会损坏材料的本体性能;(2)反应程度易控制。使用光敏剂进行表面活化,则更容易在聚合物表面引发接枝聚合反应,将特定的官能团引入到聚合物表面,以改变聚合物的表面性质。Zhu等采用紫外光氧化接枝的方法将亲水性聚甲基丙烯酸(PMAA)接枝到聚己内酯(PCL)表面,用水溶性碳二亚胺(E DC)作为偶联剂在接枝膜表面固定了明胶,经过改性后的PCL膜表面的亲水性显著提高,内皮细胞在改性PCL膜表面上培养96h后的细胞增殖率和活性均有明显提高[29]。
3.6 低温等离子体技术
低温等离子体是以低气压放电产生的电离气体,其中含有丰富的活性粒子,可引发多种化学反应,其反应温度低,适于改性热敏性高分子材料。等离子体表面接枝共聚改性是通过四步基元反应实现:(1)等离子体的产生与维持;(2)聚合物分子链上激发产生自由基;(3)材料表面的接枝反应;
(4)由分子链间交联、自由基间的偶合、歧化反应等方式终止反应。与其它方法相比,低温等离子体接枝共聚具有自身的优势:(1)引发自由基不需要另外加入引发剂;(2)不需向反应体系提供能量用于激发产生自由基。在等离子体环境下共聚,其体系温度接近室温,这有利于聚合反应的正向进程。Wang等用低温等离子体技术与胶原涂覆的方法对聚乳酸(PDLL A)膜进行了表面改性,有效改善了PDLLA与3T3成纤维细胞间亲和性,在膜上粘附细胞的数量及增长速率均明显提高[30]。Ding 等先用氩(Ar)等离子处理聚乳酸(PLLA)膜,然后暴露在空气中使之表面形成过氧化物和氢过氧化物,然后滴加壳聚糖醋酸溶液,共价固定壳聚糖分子。体外培养L929成纤维细胞,发现细胞增殖能力不错并且改性基质膜可以控制细胞的形态[31]。
3.7 离子注入技术
离子注入是将带电离子高能射入到固体表面,与固体内原子核及核外电子云发生相互作用,同时在以离子经过的轨迹外层一定半径范围内使得固体中原有分子和原子发生激发、电离等复杂行为,引起表面化学成分和结构的变化。离子注入法有其自身的优点:(1)在表面特定深度注入预定计量的高能离子,可定量控制,仅仅影响材料表层性能,不会破坏材料本体性能;(2)注入的离子渗入材料表层,与基体原子相混合,不会发生脱落现象。Kim等采用硼和氮离子注入法对聚酰亚胺膜表面改性,发现随着离子剂量的增大,膜表面水接触角下降[32]。Chen等使用40keV碳正离子注入对聚羟基链烷酸酯膜改性,亲水性得到改善,培养成纤维细胞,发现基体膜的细胞相容性明显提高,细胞黏附形态的变化估计和表面改性时发生的物理化学过程有关[33]。
4 展望
生物材料的表面修饰在组织工程的发展中起着至关重要的作用,它是一个融合交叉了材料科学和生物科学的复杂系统工程。表面修饰旨在介导材料表面与细胞的相互作用,调控细胞在材料
表面生长和凋亡这一双向的动态平衡,给细胞创造良好的人工EC Ms环境。如何控制生物材料的生物响应,抑制其非特异性响应,赋予其特异性,是组织工程用生物材料表面修饰的出发点[34]。只有深入理解生物材料与宿主的相互作用,如以锁匙学为基础的生物特异分子识别,才能使仿生表面修饰更为有效。
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