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荧光光度法

荧光光度法
荧光光度法

荧光分析法测定维生素B2药片含量

一实验目的

1.掌握荧光分析法测定维生素B2含量的原理及方法。

2.熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。

二基本原理

维生素B2(即核黄素)的溶液在430~440nm蓝光照射下,会发黄绿色荧光,荧光峰值波长为535nm。在pH6~7的溶液中荧光最强,在pH>11时荧光消失。醋酸溶液中荧光强度将会增强。其它条件一定时,维生素B2的稀溶液(0.5~5μg/ml)的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

本实验采用标准曲线法。利用维生素B2可被还原剂(连二亚硫酸钠)还原为非荧光性物质,通过测定加还原剂前后样品液的荧光强度,来消除可能的样品基体干扰,基于上述原理来测定药片的维生素B2含量。

三仪器与试剂

(一)仪器

荧光分光光度计,样品池(石英),10ml刻度吸管,10ml具塞比色管

(二)试剂

维生素B2贮备液(100μg/ml)

避光操作,精确称取100mg维生素B2(生物试剂,避光干燥保存)置于250ml烧杯中加冰醋酸10ml及蒸馏水90ml在水浴上加热溶解后,放冷,转入1000ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,移入棕色瓶中放暗处保存。

维生素B2标准应用液(1.0μg/ml)

实验当天用移液管准确吸取标准贮备液5.0ml于500ml棕色容量瓶中,用1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀。

1%醋酸溶液

取1ml冰醋酸用去离子水稀释至100ml。

连二亚硫酸钠(AR,保险粉)

四操作步骤

1.样品药液制备

1)取核黄素药片10片,研细,称出适量(约相当于维生素B210mg)置于250ml烧瓶中加冰醋酸10ml,加蒸馏水90ml,置水浴上加热约1小时,并时时振摇使其溶解澄清后放冷,转入1000ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,移入棕色瓶中避光保存。该样品药液含维生素B2 10μg/ml。

2)用移液管准确吸取维生素B2药液10ml于100ml容量瓶中,用1%醋酸液稀释至刻度,摇匀,取此溶液10ml于比色管中,按与标准系列同样步骤测定此溶液的荧光强度。

2.标准系列的配制

取10ml比色管6支,按下表配制标准系列管:

0 1 2 3 4 5

维生素B2标准应

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

用液(1.0μg/ml)

3.仪器调试

1)接通仪器及电源开关,再打开电脑及工作站。

2)取标准系列浓度最高管(5号管),固定荧光波长535nm,在350~500nm的波长范围内,扫描不同激发波长下的荧光强度,得到以激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标的激发光谱,确定激发光波长λex。

3)固定激发光波长λex,在450~600nm的波长范围内,扫描不同荧光波长下的荧光强度,得到以荧光的波长为横坐标,荧光强度为纵坐标的荧光光谱,确定荧光波长λem。

4.测定

1)在λex和λem固定的条件下,将摇匀后的标准系列管,按浓度由低到高依次倒入样品池中,分别测出荧光强度并记录填入下表中。以荧光强度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线。

管号0 1 2 3 4 5

维生素B2浓度

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

(μg/ml)

F n

F n-F0

2)相同条件下测定样品液荧光强度,记为F样。再在测定过的样品液中加入保险粉约10~20mg,轻轻摇动后迅速倒入样品池中,测定荧光强度,记为F空白(30秒钟之内测完)。

以F样-F空白值在标准曲线上查出相应的维生素B2浓度。

3)测试完毕后,关闭电脑及工作站,再关闭仪器及电源开关。

五注意事项

1.连二亚硫酸钠能将荧光型维生素B2还原为非荧光型维生素B2,但不可多加,否则

将其它还原性物质还原使测定结果偏高。同时,加入保险粉后应立即测定荧光强度,否则维生素B2又被氧化为荧光性,且多加或长时间后溶液会出现沉淀。

2.为防止维生素B2见光分解,实验应注意避光。

3.荧光测定中的样品池为四面皆光面的方形石英玻璃池,为防止污染,应手持不在光

路的边棱。

六思考题

1.为什么要选用标准系列浓度最高管调试仪器?

2.是否能用荧光计代替荧光分光光度计测定荧光光谱和激发光谱,为什么?

分子荧光光谱法实验报告

分子荧光光谱法实验报告 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱:激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后,由基态跃迁到激发态,再回到较低能级或者基态时,发射出一定波长的辐射,称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光,平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后,价电子跃迁产生荧光,是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长,纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低;也表示用不同波长的光激发材料时,使材料发出某一波长光的效

率。荧光为光致发光,合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下,测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法:先把第二单色器的波长固定,使测定的λem不变,改变第一单色器波长,让不同波长的光照在荧光物质上,测定它的荧光强度,以I为纵坐标,λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱,从曲线上找出λex,,实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中,横坐标为波长,纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱,有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法:先把第一单色器的波长固定,使激发的λex不变,改变第二单色器波长,让不同波长的光扫描,测定它的发光强度,以I为纵坐标,λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光,照射到液池内的荧光物质时,产生荧光,荧光强度If用仪器测得,在荧光浓度很稀(A 三、实验试剂和仪器试剂:罗丹明B乙醇溶液;1-萘酚乙醇溶液;3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide:标准溶液,10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度;蒸馏水;乙 醇。 仪器:Fluoromax-4荧光分光光度计;1cm比色皿;

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要是三种电子: (1)形成单键的c电子;(2)形成双键的n电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致是: (c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c,冗是成键轨道,n是非键轨道, c* , n *是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含 有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。

紫外光谱的表示方法

紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的 横坐标表示吸收光的波长,用nm (纳米)为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用 A (吸光度)、T (透射比或透光率或透过率)、 1-T (吸收率)、?(吸收系数)中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。 250 A /nm 翠腔的紫外光谨图 四、紫外光 谱中常用的几个术语 1. 发色基团和助色基团 发色基团:是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基团,不论是否显示颜色 都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团( C=C C=O N=N 、三键、苯环等) 200 300

荧光光度分析法测定维生素B2的含量

荧光光度分析法测定维生素B 2的含量 引言 荧光分光光度法简介 有些物质,当用紫外光照射时,它吸收某种波长之后还会发射出各种颜色和强度不同的光;而当紫外光停止照射后,这种光线也随之消失,这种光线称为荧光。荧光的波长比吸收的紫外光波长要长。 由于物质分子结构不同,所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。利用物质的这个特性,可以对物质进行定性分析。同一种分子结构的物质,用同一种波长的紫外光照射,可发射相同波长的荧光;若该物质的浓度不同,所发射的荧光强度也不同,利用这个性质可以对物质进行定量分析。这种定量方法称为荧光分析法,简称荧光法。测量荧光的仪器有滤光片荧光计,滤光片—单色器荧光计和荧光分光光度计。荧光法的选择性好,灵敏度比紫外-可见分光光度法高2~3数量级,检出限低,可以达到10~12g /m1,线性范围宽。现在主要应用的是荧光分光光度计。 【实验目的】 1. 学习荧光光度法测定维生素B 2的含量的基本原理和方法。 2. 熟悉荧光光度计的结构及使用方法。 【实验原理】 在经过紫外光或波长较短的可见光照射后,一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。在稀溶液中,荧光强度IF 与物质的浓度c 有以下关系: bc I 303.2I 0F εφ= 当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系: Kc I F = 这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。荧光强度与激发光强度成正比,提高激发光强度,可成倍提高荧光强度。同时,提高仪器灵敏度,可提高荧光光度法的灵敏度。而吸收光度法,无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度,入射光和出射光同时增大,其灵敏度不变。因此,荧光光度法比吸收光度法灵敏度高。

荧光光度法

荧光分析法测定维生素B2药片含量 一实验目的 1.掌握荧光分析法测定维生素B2含量的原理及方法。 2.熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。 二基本原理 维生素B2(即核黄素)的溶液在430~440nm蓝光照射下,会发黄绿色荧光,荧光峰值波长为535nm。在pH6~7的溶液中荧光最强,在pH>11时荧光消失。醋酸溶液中荧光强度将会增强。其它条件一定时,维生素B2的稀溶液(0.5~5μg/ml)的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。 本实验采用标准曲线法。利用维生素B2可被还原剂(连二亚硫酸钠)还原为非荧光性物质,通过测定加还原剂前后样品液的荧光强度,来消除可能的样品基体干扰,基于上述原理来测定药片的维生素B2含量。 三仪器与试剂 (一)仪器 荧光分光光度计,样品池(石英),10ml刻度吸管,10ml具塞比色管 (二)试剂 维生素B2贮备液(100μg/ml) 避光操作,精确称取100mg维生素B2(生物试剂,避光干燥保存)置于250ml烧杯中加冰醋酸10ml及蒸馏水90ml在水浴上加热溶解后,放冷,转入1000ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,移入棕色瓶中放暗处保存。 维生素B2标准应用液(1.0μg/ml) 实验当天用移液管准确吸取标准贮备液5.0ml于500ml棕色容量瓶中,用1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀。 1%醋酸溶液 取1ml冰醋酸用去离子水稀释至100ml。 连二亚硫酸钠(AR,保险粉) 四操作步骤 1.样品药液制备 1)取核黄素药片10片,研细,称出适量(约相当于维生素B210mg)置于250ml烧瓶中加冰醋酸10ml,加蒸馏水90ml,置水浴上加热约1小时,并时时振摇使其溶解澄清后放冷,转入1000ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,移入棕色瓶中避光保存。该样品药液含维生素B2 10μg/ml。 2)用移液管准确吸取维生素B2药液10ml于100ml容量瓶中,用1%醋酸液稀释至刻度,摇匀,取此溶液10ml于比色管中,按与标准系列同样步骤测定此溶液的荧光强度。 2.标准系列的配制 取10ml比色管6支,按下表配制标准系列管: 0 1 2 3 4 5 维生素B2标准应 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 用液(1.0μg/ml)

分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 (一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=?+(-?)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”; 图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C) 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即 ?S=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”; 如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1: S=1/2+1/2=1 其多重性: M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”; “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 (二)分子去活化过程及荧光的发生: (一个分子的外层电子能级包括S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级) 处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为: 1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫。

荧光光度分析法及药物分析

荧光光度分析法与药物分析 化材院化工3班姚依弟10081224 前言 当紫外光照射到某些物质的时候,这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光,而当紫外光停止照射时,这种光线也随之很快地消失,这种光线称为荧光。利用这种能够反映物质特性的荧光对该物质进行定性和定量分析的方法称为荧光分析法。 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光,激发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关,因为吸收必须先于荧光发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失,剩余荧光的能量比吸收的能量小,因此荧光在更长的波长发射。 【一】荧光分光光度法的分析方法 荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几;而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几,甚至有千亿分之几的。荧光分析法的另一优点是选择性高。荧光分析法还有方法快捷,重现性好,取样容易,试样需要少等优点。荧光分析法也有它的不足之处,主要是指它比起其它方法来说应用X围还不够广泛,因为有许多物质本身不会产生荧光。 为使荧光分析法的应用更加广泛,发展了各类荧光分析方法,如

对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质,对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法。荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。直接测定法是利用物质自身发射的荧光进行定量测定。但是自身发荧光的药物寥寥无几,所以一般采用间接法测定。 1、直接荧光分析法 直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。因荧光性质与溶液的EF值有关,故荧光强度的测定需在适宜的EF缓冲溶液中进行。对于成分复杂的生物供试品,为了防止干扰,有时需利用萃取、沉淀、色谱分离等方法除去干扰物,以降低荧光空白本底,提高分析灵敏度。已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等。 本身能发荧光的物质,可用荧光分光光度法直接测定。鲍霞认为可用荧光分光光度法直接测定氧氟沙星胶囊的含量。取氧氟沙星胶囊药粉用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配溶液,2h后,室温,用试剂作空白,在RF-5301 型荧光分光光度(日本岛津) 上,以427nm 为激发长,500nm 为发射波长测定荧光强度,计算其标示量的百分含量。本法操作简单,快捷,灵敏度高,结果满意。 2、间接荧光分析法 本身荧光很弱的物质,常采用氧化还原反应、配位反应等化学反应将其变为能发荧光的物质,用荧光分光光度法间接测定。

荧光分光光度法

荧光分光光度法测定维生素B6的含量

荧光分光光度法测定维生素B6的含量 荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm,发射波长扫描范围是200-800nm。可用于液体、固体样品(如凝胶条)的光谱扫描。 荧光分光光度计的工作原理:物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出,从而产生荧光. 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的 特征,这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;,因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 荧光分光光度计基本结构:①光源:为高压汞蒸气灯或氙弧灯,后者能发射出强度较大的连续光谱,且在300nm~400nm 范围内强度几乎相等,故较常用。

②激发单色器:置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光谱。③发射单色器:置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器,常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。④样品室:通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时,光源与检测器成直角安排;测量固体时,光源与检测器成锐角安排。⑤检测器:一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。 荧光分光光度计是用于电子扫描液相荧光标志物所拍发的荧光光谱的一种摄谱仪。应用于科学研究、化工、医疗药品、生化、环保和临床检验、食物检验、讲授实验等领域。 本次实验所用样品维生素B 6(vitamin B 6 ),又称吡哆素。是一种水溶性维 生素,遇光或碱易破坏,不耐高温。一种含吡哆醇或吡哆醛或吡哆胺的B族维生 素。1936年定名为维生素B 6。维生素B 6 为无色晶体,易溶于水及乙醇,在酸液 中稳定,在碱液中易破坏,吡哆醇耐热,吡哆醛和吡哆胺不耐高温。维生素B 6 在酵母菌、肝脏、谷粒、肉、鱼、蛋、豆类及花生中含量较多。维生素B 6 为人体内某些辅酶的组成成分,参与多种代谢反应,尤其是和氨基酸代谢有密切关系。 临床上应用维生素B 6 制剂防治妊娠呕吐和放射病呕吐。 维生素B 6 及其辅酶的结构式 1 实验仪器与试剂 1.1 仪器 荧光分光光度计(RF-5301PC,日本岛津)、电子天平(AL204,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司METTLER TOLEDO)、微孔滤膜(尺寸25mm,孔径

荧光光谱法

荧光分析法测定维生素B2 一、实验目的 1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法; 2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法; 3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。 二、实验原理 当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。 实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。 图1.荧光分光光度计的结构原理图

荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。 荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。 荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。 定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。对同一物质而言,荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下的关系: F = 2、303Фf I0 a b c ⑴ Фf-荧光过程的量子效率; a-荧光分子的吸收系数; I0-入射光强度; b-试液的吸收光程。 在I0 与b 不变时,2、303Фf I0 a b为常数,则⑴式可以表示为 F=Kc ⑵ ⑵即可作为荧光定量检测的依据。 图2 VB2的结构式

荧光分析法基本概念

紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,就是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱就是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要就是三种电子: (1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致就是: (σ)<(π)<(n)<(π*)<( σ* ) σ,π就是成键轨道,n 就是非键轨道,σ* ,π* 就是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动与转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级与转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图就是由横坐标、纵坐标与吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。

纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语

1、发色基团与助色基团 发色基团:就是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论就是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱与的基团都就是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常就是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应与减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其她发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级与转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量 一、实验目的 1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。 二、实验原理 荧光分析法,是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中,荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系: 当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系: 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 三、仪器及试剂 1.仪器 960荧光分光光度计; LC-UV 紫外检测器; 微量进样器 2.试剂 ① 二氯荧光素(分析纯); ② 荧光素钠 四、操作步骤 1.标准溶液配制 准确称取0.05g 二氯荧光素标样,配制成2500ml 溶液,则此溶液浓度为0.05μm/mL ,分别移取此溶液2.0ml 、4.0ml 、6.0ml 、8.0ml ,于25ml 容量瓶中,bc I I F εφ0303.2=Kc I F =

并用蒸馏水稀释至刻度,摇匀后,待测定各标准溶液的荧光强度。 2.荧光强度测定 (1)荧光光度计操作 开启220V稳压电源至220V; 打开主机电源开关。 检查氙灯电是否开启。 (2)二氯荧光素发光谱的绘制,参数设置如下: ①设定纵坐标 ②设定灵敏度; ③设定扫描速度; ④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm; ⑤激发波长范围200-350 nm; ⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中; ⑦扫描得到激发光谱。 (3)标准溶液及样品的测定,参数设置如下: ①设定纵坐标 ②设定灵敏度; ③设定扫描速度; ④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到; ⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm; ⑥将1号标准溶液放入试样池中; ⑦扫描得到荧光光谱。 仪器开始扫描,得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作,就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。 五、数据记录及计算 1.列表

荧光分光光度法

荧光分光光度法 目的:检测色氨酸和糠氨酸的荧光值 检测限:原料奶巴氏灭菌乳中、复原乳最低含量10%,UH T灭菌乳中复原乳最低含量为20% 优缺点:灵敏度高,检测时间短,但稳定性差设、备昂贵,对于长时间存放的UH T灭菌乳检测性较差 高效液相色谱法 检测乳制品中糠氨酸的含量 原料奶巴氏灭菌乳中、复原乳最低含量10%UH T灭菌乳中复原乳最低含量为40% 准确度和精确度高但样品前处理时间长色谱柱造价高 近红外光谱法 比较物质光谱与待测成分含量间的线形或非线形模型 原料奶中复原乳最低含量10% 分析时间短,约为1min,易受光路条件影响且要建立校正模型,不能进行痕量组分分析 紫外分光光度法 检测原料奶中乳清蛋白,-乳白蛋α白,-乳球蛋白的β含量 原料奶中乳清蛋白,-乳白蛋白,-乳球蛋αβ白的含量显著高于复原乳 实验步骤繁琐,UHT乳中复原乳的检测限为20% AOAC化学法 检测乳制品中酪蛋白的含量 掺加复原乳后酪蛋白含量降低 检测时间短,灵敏度高 牛乳被誉为营养价值最接近于完善的食物,人均乳制品消费量是衡量一个国家人民生活水平的主要指标之一。世界上许多国家都对乳制品消费给予高度注视,加以引导和鼓励。在我国乳制品也逐渐成为人民生活的必须食品。据市场调查结果显示,目前城市居民食用乳制品的普及率已经达到95%以上,全国原奶加工产能有9000万吨,而国内奶源供应量仅有不足3600万吨,巨大的奶源缺口,成为乳制品安全的漏洞。 也是大量再制牛乳涌入市场的原因。天然牛乳与再制牛乳的物理性状极其相似,而营养成分与风味又不尽相同。如何鉴别天然牛乳与再制牛乳的风味,有助于消费者更好的认识乳制品的营养价值,从而进一步的提高人民的生活水平。 天然牛奶被誉为“万食之王”,因为它不仅含有其他食物所含的全部营养,而且含有世上千万种食物所没有的生物活性物质。生物活性物质在天然牛奶中的含量很少,但就营养而言,可以“四两拨千斤”!常喝牛奶能够提高人体免疫力,便是活性物质在起作用。因此,天然牛奶被称为“命脉素”。营养学家分析,每100克天然牛乳中。含蛋白质3.1克,脂肪3.5克,碳水化合物6克,灰分0.7克,钙120毫克,磷90毫克。铁0.1毫克,硫胺素0.04毫克,核黄素0.13毫克,尼克酸0.2 毫克,抗坏血酸1毫克,维生素A140单位。天然牛乳的蛋白质主要是含磷蛋白质——酪蛋白,也含白蛋白及球蛋白,此3种蛋白质均含全部必需氨基酸。天然牛乳的脂肪主要是棕榈酸、硬脂酸的甘油酯,也含少量低级脂肪酸,此外还含少量卵磷脂、胆甾醇、色素等。再制牛乳是指把牛奶浓缩、干燥成为浓缩乳或乳粉,再添加适量水,制成与原乳中水、固体物比例相当的乳液。再制牛乳要经过两次高温灭菌加工。加工通常采用UHT(超高温灭菌)法,要经过130℃--150℃超高温灭菌。一方观点:采用超高温灭菌法不仅破坏了天然牛乳中的全部物质和大部分维生素,还会使容易被人吸收的钙离子与牛奶的酪蛋白结合,形成不易被人吸收的络合物。因此,“再制牛乳”中的营养物质,其实只是在米、面、肉等食品中大量存在的普通蛋白质、脂肪和糖等能量类物质,与鲜牛奶的差距不言而喻。另一方持不同的观点:超高温灭菌法虽然采取高温灭菌,但高温时间只是瞬时的,因此不会大量破坏鲜奶中的营养成分。无论何种观点,不难看出再制牛乳的风味较天然牛乳而言发生了变化。本文就是通过对乳制品的风味鉴别,来进一步的得出天然牛乳与再制牛乳的优劣。 主要研究内容:天然牛乳的风味与再制牛乳的风味 目标:通过风味鉴别实验明确天然牛乳与再制牛乳风味 研究方法:通过感官评定来品评天然牛乳与再制牛乳风味,异常风味,芳香味,等特征 通过高效液相色谱法来确定天然牛乳与再制牛乳的风味物质,酸类、羰基化合物、酯类、硫化物、萜类等,及其差别。 终上两种方法对天然牛乳和再制牛乳进行鉴别与评价

分子荧光光谱法实验报告范文

分子荧光光谱法实验报告范文 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱:激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后,由基态跃迁到激发态,再回到较低能级或者基态时,发射出一定波长的辐射,称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光,平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后,价电子跃迁产生荧光,是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长,纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低;也表示用不同波长的光激发材料时,

使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光,合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下,测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法:先把第二单色器的波长固定,使测定的λem不变,改变第一单色器波长,让不同波长的光照在荧光物质上,测定它的荧光强度,以I为纵坐标,λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱,从曲线上找出λex,,实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中,横坐标为波长(或频率),纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱,有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法:先把第一单色器的波长固定,使激发的λex不变,改变第二单色器波长,让不同波长的光扫描,测定它的发光强度,以I为纵坐标,λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光,照射到液池内的荧光物质时,产生荧光,荧光强度If用仪器测得,在荧光浓度很稀(A0.05)时,荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系:If=KC。 三、实验试剂和仪器

荧光分光光度计- 原理

分子荧光分析法 发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同,荧光分析法可分为以下几种: 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源,待测物质的原子受激发后在很短时间内(10-8 s)发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法: 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后,在很短的时间内(10-8 s),部分将发生辐射跃迁至基态,这种二次辐射即为荧光,根据其波长可进行定性,根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同,称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长,称为stokes荧光;若短,称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法: 有些物质的多原子分子,在用紫外、可见光(或红外光)照射时,也能发射波长在紫外、可见(红外)区荧光,根据其波长及强度可进行定性和定量分析,这就是通常的(分子)荧光分析法。

基本原理 一. 分子荧光的发生过程 (一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=?+(-?)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂, 称“单线态”; 图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C) 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即?S=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”; 如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1:S=1/2+1/2=1 其多重性:M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”; “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。(二)分子去活化过程及荧光的发生: (一个分子的外层电子能级包括S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级) 处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为: 1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能

荧光分光光度法

荧光分光光度法 2015年版《药典》四部通则0405 某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。物质的激发光谱和荧光发射光谱,可用于该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时,物质在一定浓度范围内,其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系,可以用于该物质的含量测定。荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高,但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象,而且在液面附近溶液会吸收激发光,使发射光强度下降,导致发射光强度与浓度不成正比,故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。 测定法 所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计,按各品种项下的规定,选定激发光波长和发射光波长,并制备对照品溶液和供试品溶液。 通常荧光分光光度法是在一定条件下,测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。当线性关系良好时,可在每次测定前,用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度;然后在相同的条件下,分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度,用下式计算供试品浓度: 为供试品溶液的浓度; 式中 c X 为对照品溶液的浓度; c r 为供试品溶液的荧光强度; R x 为供试品溶液试剂空白的荧光强度; R Xb 为对照品溶液的荧光强度; R r

R rb 为对照品溶液试剂空白的荧光强度。 因荧光分光光度法中的浓度与荧光强度的线性较窄,故(R x -R Xb )/ (R r-R rb )应控制在0.5~2之间为宜,如若超过,应在调节溶液浓度后再 进行测定。 当浓度与荧光强度明显偏离线性时,应改用标准曲线法进行含量测定。 对易被光分解或弛豫时间较长的品种,为使仪器灵敏度定标准确,避免因激发光多次照射而影响荧光强度,可选择一种激发光和发射光波长与供试品近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液,作为基准溶液。例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液,黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液,红色荧光可用罗丹明B水溶液等。在测定供试品溶液时选择适当的基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。 【附注】荧光分光光度法因灵敏度高,故应注意以下干扰因素。 (1)溶剂不纯会带入较大误差,应先做空白检查,必要时,应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。 (2)溶液中的悬浮物对光有散射作用,必要时,应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。 (3)所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。 (4)温度对荧光强度有较大的影响,测定时应控制温度一致。 (5)溶液中的溶氧有降低荧光作用,必要时可在测定前通入惰性气体除氧。 (6)测定时需注意溶液的pH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。

荧光分光光度分析法

第一章荧光分光光度分析法 1.1概述 1.1.1 基本原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出荧光,荧光经过滤过和反射后,被光电倍增管所接受,然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出,从而产生荧光。 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征,这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱,因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 1.1.2 基本结构 图1 荧光分光光度计工作原理示意图 (1)光源:为高压汞蒸气灯或氙弧灯,后者能发射出强度较大的连续光谱,且在300nm~400nm 范围内强度几乎相等,故较常用。 (2)激发单色器:置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光谱。 (3)发射单色器:置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器,常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。

(4)样品室:通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时,光源与检测器成直角安排;测量固体时,光源与检测器成锐角安排。(5)检测器:一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。 1.1.3 仪器操作规程 1.1.3.1 开机 a. 确认所测试样液体或固体,选择相应的附件。 b. 先开启仪器主机电源,预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC,仪器自检通过后,即可正常使用。 1.1.3.2 测样 (1)spectrum模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。 ?对于做荧光光谱的样品,“Configure”中“Parameters”的参数设置如下:“Spectrum Type”中选择Emission;给定EX波长;给定EM的扫描范围(最大范围220nm—900nm);设定扫描速度;扫描间隔;狭缝宽度,点击“OK”完成参数的设定。 ?对于做激发光谱的样品,“Configure”中“Parameters”的参数设置如下:“Spectrum Type”中选择Excitation;给定EM波长;给定EX的扫描范围(最大范围220nm—900nm);设定扫描速度;扫描间隔;狭缝宽度,点击“OK”,完成参数的设定。 b. 在样品池中放入待测的溶液,点击“Start”,即可开始扫描。 c. 扫描结束后,系统提示保存文件。可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围;在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位,最后在“Channel”中进行通道设定。 d. 述操作步骤对固体样品同样适用。 (2)Quantitative模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。 b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下: Method 选择“Multi Point Working Curve” ;“Order of Curve” 中选择“1st和

实验报告2荧光分光光度法测定维生素B2的含量

实验项目:荧光分光光度法测定维生素B2的含量 【实验题目】 荧光分光光度法测定维生素B2的含量 【实验目的】 1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。 2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能,掌握其基本操作。 【实验原理】 维生素B2(又叫核黄素,VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为: 由于分子中有三个芳香环,具有平面刚性结构,因此 它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有 机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解,对热稳 定。 维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下,发出绿 色荧光,荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH=6~7的 溶液中荧光强度最大,而且其荧光强度与维生素B2溶液 浓度呈线性关系,因此可以用荧光光谱法测维生素B2的 含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而 转化为另一物质——光黄素,光黄素也是一个能发荧光的 物质,其荧光比维生素B2的荧光强得多,故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。 在稀溶液中,荧光强度F与物质的浓度c有以下关系:F=2.303ФI0εbc 当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系:F=Kc 这是荧光光语法定量分析的依据。 【主要仪器与试剂】 主要仪器:F-2500 HiTachi荧光分光光度计;1cm石英皿;50mL容量瓶;5mL移液管;烧杯;胶头滴管 试剂:维生素B2标准溶液:未知液4 【实验内容及步骤】 1、系列标准溶液的制备 取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中,各加入去离子水稀释至刻度,摇匀。标记为①②③④⑤的一系列维生素B2标准溶液。待测。 2、待测液制备 取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中,加入去离子水稀释至刻度,摇匀。待测。3、激发光谱和荧光发射光谱的绘制 设置λem=540nm为发射波长,在250~500nm范围内扫描标准溶液③,记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线,便得到激发光谱。从激发光谱图上找出其最大激发波长λex。在此激发波长下,在400~600nm范围内扫描,记录发射强度与发射波长间的函数关系,便得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长λem。 4、标准溶液及样品的荧光测定 将激发波长固定在最大激发波长λex,荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处λem。扫描蒸馏水和上述5个标准液的荧光发射强度。数据记录于表1中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,制作标准曲线。 在同样条件下测定未知溶液的荧光强度,并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度,计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。

荧光分光光度法测定维生素B2的含量

华南师范大学实验报告 课程名称:仪器分析实验实验项目:荧光分光光度法测定维生素B2 的含量 荧光分光光度法测定维生素B2的含量 一、实验目的 1.掌握荧光物质的标准曲线法定量测量含量的操作方法和原理; 2.了解分子荧光光谱定量分析与定性分析的特点及区别; 3.熟悉荧光光度计定量法测量软件的数据处理。 二、实验原理 含有荧光基团的化学物质,其分子吸收了辐射能成为激发态分子,再从激发态返回基态时发射光的波长比吸收的入射光波长更长,分子荧光就是发光方式中较常见的光致发光。在一定频率和一定强度的激发光照射下,当溶液的浓度很小同时光被吸收的分数也不太大时,稀溶液体系将符合朗伯-比尔定律,该溶液所产生的荧光强度与溶液中这种荧光物质的浓度呈线性关系,可用公式表示: I F='kbcI0 当入射光强度I0一定时I F=Kc 以上两式中K'为荧光量子效率;K为荧光分子的摩尔吸光系数;b为液槽厚度;c以为荧光物质的浓度。 分子荧光标准曲线法是取一定已知量的标准物质与待分析试样溶液经过相同的处理后,配制成一系列的标准溶液,测定其荧光强度,并以荧光强度为纵坐标,以标准溶液浓度为横坐标绘制其工作曲线,再由所测获的试样溶液的荧光强度对工作曲线作图从而求出试样溶液中该被分析检测物质的实际浓度含量。此法适用于痕量分析,并且标准溶液和试样溶液的荧光强度必须是在荧光仪已扣除空白溶液的荧光强度的读数。

维生素B2,又称核黄素。分子式C17H20N4O6。它是人体必需的13种维生素之一,作为维生素B族的成员之一,微溶于水,可溶于氯化钠溶液, 易溶于稀的氢氧化钠溶液。 可以用荧光光度法测维生素B2的含量的原因:维生素B2溶液在430~440 nm 蓝光的照射下,发出绿色荧光,荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大,在pH=11的碱性溶液中荧光消失,所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。 该实验的控制条件:维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素,光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多,故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。 荧光光谱法定量分析的理论依据: 常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 三、仪器和试剂 (1)仪器荧光光度计(FL-2500)、四面通石英比色皿一个:1cm 、1和2 mL 刻度移液管各一支、吸耳球、洗瓶、镜头纸。 (2)试剂μg/ml维生素B2标准溶液、二次蒸馏水 四、实验步骤 (1). 打开氙灯,再打开主机,然后打开计算机启动工作站并初始化仪器,预热30min (2)仪器初始化完毕后,在工作界面上选择测量项目,设置适当的仪器参数:

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