微生物发酵法生产介乳酸的研究进展
摘要：D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料, 其生产已越来越受到人们的重视。然而, 低光学纯度D-乳酸在很多领域的应用都受到限制。微生物发酵法能够生产高光学纯度的D-乳酸。除了乳酸生产的传统菌株) 乳酸细菌, 研究者们还通过基因工程的手段不断探索其它种属菌株利用更廉价的可再生资
源高产光学纯度D-乳酸的可行性。介绍了D-乳酸的物化性质及其在工业生产、化学加工和聚乳酸合成中的应用, 并详细综述了国内外发酵法生产光学纯度D-乳酸的最新研究进展, 着重介绍了采用基因工程育种策
略提高菌株的D-乳酸产量、转化率、生产强度以及光学纯度, 降低副产物的合成, 扩大底物利用范围的研究成果。所涉及的菌株包括:乳酸细菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌以及酵母等。这些研究表明, 应用基因工程手段改造生产菌株的代谢途径是选育D-乳酸发酵生产菌株的发展趋势。最后还对D-乳酸发酵生产的前景进行了展望。
关键词：D-乳酸光学纯度微生物发酵代谢工程
乳酸常为DL混合型, 为世界上公认的三大有机酸之一, 乳酸及其衍生物具有广泛的用途。乳酸异构体之一D-乳酸是一种重要的手性中间体, 其聚合物D-聚乳酸与L-聚乳酸形成立构复合物能提高L-聚乳酸的热稳定性。随着人们环保意识的提升, 生物可降解聚乳酸材料的市场需求量不断增加, 同时也推动了对其单体D-乳酸的需求。然而, 低光学纯度的D-乳酸在很多领域的应用受到限制, 人们不断寻找单一光学纯度D-乳酸的生产方法, 并探索其以可
再生、廉价资源为原料, 以高产量、高底物转化率、高生产强度和高化学纯度生产的可行性。本文将概述D-乳酸的性质与应用,并围绕D-乳酸生产菌种的最新研究进展作一综述。
1、 D-乳酸及其应用
1.1 D-乳酸的结构与理化性质
乳酸的学名为A-羟基丙酸, 分子式为C
2H
5
OCOOH, 是一种天然存在的有机酸, 广泛存在于
人体、动物、植物和微生物中[1]。乳酸是自然界最小的手性分子, 分子中羧基A位碳原子为不对称碳原子, 具有L(+)和D(-) 两种构型。L-乳酸为右旋型, D-乳酸为左旋型, L-乳酸和D-乳酸等比例混合即为消旋的DL-型。D-乳酸和L-乳酸除旋光性外, 它们的其它理化性质相同[2],但DL-型的物理性质与它们有所差别, 表现在其熔点和熔化热比单一D或L构型的低。
D-乳酸具有一元羧酸的典型化学性质, 水溶液呈弱酸性, 浓度达到50%以上时会部分形成乳酸酐, 与一些醇类物质反应生成醇酸树脂, 在加热条件能够进行分子间酯化反应, 形成乳酰乳酸, 稀释并加热可再水解成D-乳酸。在脱水剂氧化锌作用下, 两分子D-乳酸脱去两分子水, 自聚形成环状二聚体D-丙交酯。充分脱水则可形成聚合D-乳酸。由于乳酸越浓自身酯化趋势越强, 因此乳酸通常是乳酸和丙交酯的混合物。
1.2 D-乳酸及其衍生物的应用
1、D-乳酸在手性化合物合成中的应用
高光学纯度D-乳酸(97%以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体, 是重要的手性中间体与有机合成原料, 广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成[ 3]。此外, 钙拮抗剂降压药、皮考啉酸衍生物以及二甲四氯丙酸、氟系除草剂等也以高光学纯度D-乳酸作为原料。
2、D-乳酸衍生物在化学工业中的应用
以D-乳酸为原料的乳酸酯类在香料、合成树脂涂料、胶粘剂及印刷油墨等生产中应用广泛, 在石油管道和电子工业的清洗等方面也有应用。其中, D-乳酸甲酯能与水及多种极性溶剂均匀混合, 能充分溶解硝化纤维素、醋酸纤维素、乙酰丁酸纤维素等以及多种极性合成高分子聚合物, 同时具有熔点高、蒸发速度慢的优点, 是一种优秀的高沸点溶剂, 可作为混合溶剂的成分改善作业性和增溶性, 此外, 还可用作医药、农药的原料和其它手性化合物合成的前体、中间体。
3、D-乳酸在聚乳酸类生物降解性材料中的应用
乳酸是生物塑料聚乳酸的原料。聚乳酸材料的物理性质依赖于D, L两种异构体的组成和含量。由消旋型D, L-乳酸合成的消旋体D, L-聚乳酸( PDLLA)为无定型结构, 其机械性能较差, 降解时间较短, 且在体内会发生收缩, 收缩率达50%以上, 应用受到局限。L-聚乳酸和
D-聚乳酸的链段排列规整, 结晶度、机械强度和熔点等都远超过。实际应用中较多采用L和D 型聚合单体合成PLA。与传统热塑材料相比, 聚乳酸塑料具有优异的生物降解性、可加工性、热塑性以及高强度性能, 并将逐步替代目前困扰世界各国的白色热塑污染产品。其制品在农业、渔业、工业、服装行业和医疗等方面都有着广阔的应用前景。如: 聚乳酸生物塑料可用于取代目前易破碎的农用地膜, 用作土壤、沙漠绿化保水材料, 水产用材, 农药化肥缓释材料等。聚乳酸还可加工成建筑用的薄膜和绳索、纸张塑膜等。由于, 聚乳酸对人体无毒无害, 最适合加工成一次性饭盒以及其它各种食品、饮料的外包装材料。还可用于生产仿棉纤维、仿羊毛和仿丝绸纤维, 并可单独纺丝用于生产各种织物。在生物医学工程领域可用作骨内固定物、疫苗佐剂、医用手术缝合线、微胶囊、植入片、人造皮肤、人造血管等。由于D-乳酸聚合的聚乳酸不能被人体利用, 只有被人体内的微生物分解, 从而可以起到缓释作用, DLA 还被用于药物的缓释技术等。
2、 D-乳酸发酵生产菌株与育种
2.1 发酵法生产的优点
人们最初采用化学合成法来生产乳酸。然而, 化学合成法生产的乳酸为外消旋型, 即D, L-乳酸, 且其所需要的乙醛和剧毒物氰化氢等原料来源于石油的裂解, 随着石油资源的日
渐枯竭, 其应用受到一定限制。虽然酶法可以获得光学纯度的乳酸, 其工艺比较复杂,大规模工业应用还有待进一步研究[4]。与上述方法相比, 发酵法能以可再生资源为原料生产光学特异性的D-或L-乳酸, 其副产物较少, 转化率高( 有些菌体代谢葡萄糖产乳酸的转化率达90% ), 生产条件温和, 操作简单, 安全性高。目前, 世界乳酸产量的90%是由发酵法生产的, 其余是由化学合成的。国际上的D-乳酸生产也主要采用微生物发酵法。
然而, 较高的原材料预处理费用是发酵法生产乳酸的一个瓶颈。例如,淀粉质原材料来源广泛且廉价,但不能被多数微生物直接利用, 需要将其液化、糖化为葡萄糖, 因此降低了该工艺的成本竞争力;木质纤维素是最为广泛和廉价的生物质原料, 然而其应用比淀粉原料更为困难, 预处理成本更高, 且其水解产物中的一些戊糖不能被多数微生物利用。研究微生物的代谢机制从而培育能够快速利用这些廉价原料乃至生活废弃物生产光学纯度D-乳酸的
菌株, 并进一步提高D-乳酸生产菌株的产量、底物转化率和生产强度, 对于乳酸的工业生产具有非常重大的意义。
2.2 微生物的乳酸发酵类型
按照微生物发酵糖类的过程和产物的不同, 可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵、异型乳酸
发酵和混合酸发酵三种类型[5]。同型乳酸发酵微生物经EMP途径, 将lmol葡萄糖转化成2 mol 乳酸,理论转化率为100%。考虑到发酵过程中的其他生理过程, 一般转化率在80% 以上即视为同型乳酸发酵。异型乳酸发酵微生物经HMP 途径将1 mol葡萄糖转化为1 mol乳酸、1molCO2和1 mol乙醇),其中产物乙醇与乙酸的比例取决于微生物体系中的氧化还原反应作用[ 14], 葡萄糖的理论转化率只有50%。除Lactobacillus delbruelkii外的乳酸菌都是兼性异型乳酸发酵菌。在特殊情况下,如葡萄糖浓度受到了限制、pH 值改变或温度降低, 同型乳酸发酵微生物进行混合酸发酵。与同型乳酸发酵相同, 混合酸发酵也经由EMP途径, 但在丙酮酸的代谢途径发生了改变, 生成了甲酸、乙酸、乙醇等副产物。
2.3 乳酸细菌用于生产D-乳酸的研究进展
乳酸细菌作为传统的乳酸发酵工业的生产菌种,其优势在于: 自身就能合成高浓度的乳酸、对乳酸的耐受性较高、生产强度大等。然而, 大多数乳酸菌同时具有发酵型D-乳酸脱氢酶[D(-)-LDH ]和L-乳酸脱氢酶[ L( + )-LDH ] , 删除其中的L-LDH 编码基因可以将该重组菌株用于发酵产光学纯度D-乳酸。如, 我国李剑[6]克隆了菌株Lactobacillus sp. MD-1 的
D-LDH 基因, 序列分析表明该基因是一个新的D-LDH 基因, 将该菌株的L-LDH 基因敲除后突变株能够产生光学纯度97% 以上的D-乳酸。此外, 有的乳酸菌,还存在乳酸消旋酶,催化L-或D-乳酸向旋光性相反的乳酸类型转化, 直至两者比例达到平衡, 该酶的存在使得菌株即使只具有单一的LDH, 最终发酵产物仍为D, L-乳酸。基于以上研究, 应用大肠杆菌生产D-乳酸在培养基营养需求、D-乳酸产量、对葡萄糖底物的转化率、光学纯度等方面与乳酸细菌相比都已显示出巨大的优越性。然而, 微生物的代谢调控是一个非常复杂的过程, 虽然人们已获得了很多E. coli遗传和代谢信息,许多代谢网络节点之间的作用仍不清楚, 选择一套最佳D-乳酸生产重组E. coli构建方案仍然不是一件容易的事, 还有待进一步研究。
2. 5 其它D-乳酸生产菌株的研究进展
谷氨酸棒杆菌常被用于生产L-谷氨酸和L-赖氨酸, 然而, 因其自身具有L-LDH, 也可利用无机盐培基生产高浓度的L-乳酸[7]。将其自身L-LDH 编码基因失活, 并表达来源于
L.delbrueckii 的发酵型D-LDH基因, 所获得的菌株在无机盐培养基中经分批补料发酵, 达到60g/gDWC, 发酵30h产生1.336mol/L (120g/L) D-乳酸, 产物光学纯度大于99.9%。与上述产D-乳酸重组E. coli菌株相比, 该菌株同样营养需求简单、产物光学纯度高, 且能在更短的时间内获得高产量D-乳酸。但发酵过程中同时产生17g/L琥珀酸、3 g/L乙酸, 这些副产物的产生使得其D-乳酸转化率较低。进一步删除编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、乙酸激酶、CoA 转移酶的基因也许能够降低琥珀酸和乙酸的合成, 并提高乳酸的转化率。如上所述, 应用重组E. coli生产D-乳酸取得了较好的效果, 但若不添加中和碱, 低pH 值会抑制E. coli的生长和乳酸的合成, 而添加的中和碱与乳酸形成乳酸盐, 提取过程中将乳酸盐重新生成目的产物乳酸较困难, 且大量的CaSO4废杂对环境造成了极大的污染, 限制了此方法的应用。酵母菌对低pH 的耐受性比大肠杆菌强, Ishida等构建了一株重组酿酒酵母菌,此菌株的丙酮酸脱羧酶1的编码基因被删除, 染色体DNA 中整合了两个拷贝的来源于Leuconostocm esenteroides的D-LDH 基因。在加入中和碱的条件下该重组菌能生产61.5g/L D-乳酸, 葡萄糖转化率为61.2%。值得注意的是, 若发酵过程中不加碱中和乳酸, 该菌株仍可将53. 0%的葡萄糖转化为54.2g/L 游离D-乳酸, D-乳酸光学纯度达到99.9% 以上。与上述乳酸生产菌株相比, 这一研究提供了不加中和剂发酵生产纯D-乳酸的新途径。
3、展望
发酵工业的快速发展, 尤其是燃料乙醇生产的快速膨胀, 使得淀粉质原料如: 玉米、小麦、大米、红薯等变得已不再像从前一样丰富而廉价。此外, 这些粗原料的预处理过程极大地增加了D-乳酸发酵生产的成本, 使得其发酵产品在作为聚乳酸生产的原料时不具有价格优势。开拓新的原料来源, 如木质纤维素乃至生活废弃物类原料, 并对D-乳酸生产菌株的代
谢途径进行改造使其能快速利用这些原料生产D-乳酸, 不仅可以降低生产成本而且可以避免发酵工业与人争粮的现象。虽然研究者们已在有关领域进行了大量的工作, 至今纤维素类原料的利用仍然困难, 还有待更深入的研究。基因工程手段在改造生产菌株的代谢途径中体现了重要的作用, 并将是D-乳酸发酵生产菌株的研究趋势。通过代谢途径的改造理解微生物的代谢机制, 并将基因工程手段与发酵工艺控制相结合, 对D-乳酸生产菌株进行全局的代谢调控, 将有助于进一步降低副产物的含量, 提高产品的品质, 提高菌株的产量、转化率和生产强度等。D-乳酸发酵过程中存在的瓶颈性问题是, 大多数生产菌株耐酸程度有限, 需要在发酵过程中添加碱中和产物乳酸。然而, 产物乳酸钙对菌体生长和乳酸合成仍会产生一定的抑制作用, 影响产物浓度的提高, 同时乳酸钙的形成使分离纯化过程变得复杂, 使纯化成本增加。此外, 乳酸提取过程中产生的大量的硫酸钙废杂物是乳酸发酵生产的极大污染。发酵过程中从培养介质中及时移走乳酸可达到减少产物抑制、控制pH值的目的, 从而有助于提高产量、生产速率和原料的利用率、降低产品后续提取成本等。近年来将发酵过程与产品分离、提取过程相结合的乳酸发酵生产技术得到了快速的发展。原位分离技术是指将生产细胞的代谢产物快速移去的方法。按照将乳酸产物从发酵液中移走的方式的不同, 可分为电渗析发酵、膜法发酵、萃取发酵和吸附发酵等。原位分离技术多应用于研究L-乳酸发酵, 尚无将原位分离技术应用于D-乳酸发酵的报道。因此, 在进一步开发耐酸性高的D-乳酸生产菌株的同时, 改进现有的乳酸原位分离发酵工艺, 实现D-乳酸发酵生产与分离的有效耦合具有重大的研究价值和广阔的应用前景。
参考文献：
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第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源无机盐水生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源（nitrogen sources） 概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。? 种类：盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。 5、生长因子（growth factor）
长江大学 发酵工厂设计课程设计 题目名称：年产10万吨乳酸发酵车间设计 学院（系）：生命科学学院 专业班级： 学生姓名： 指导教师： 课程设计日期：2010年11月18日-2010年12月10日
目录 引言 1发酵工厂总平面设计方案……………………………………………………………… 1.1 工厂的选址……………………………………………………………………… 1.2 工厂总平面设计方案 2生产工艺流程设计 2.1 生产工艺概述 2.2 操作要点说明 2.3 酸奶质量标准 3设计计算说明 3.1 物料平衡计算 3.2 水平衡计算 3.3 热量平衡计算 3.4 无菌空气平衡计算 3.5 班产量计算与人员安排 3.6 设备的选型与校核计算 4车间设备布置设计 4.1 车间布置说明 4.l 车间布置图纸（平面图、立面图、主要设备图） 总结
年产10万吨乳酸发酵车间设计 学生： 指导老师： 民以食为天，食以乳为先。牛乳自古以来即被人类饮用，牛乳的组成最为接近人乳，含有人体所需要的全部营养成分，营养最为均衡，在人们的膳食结构中具有其他食品无法替代的地位和作用。由鲜牛乳发酵成的酸乳由于其丰富的营养、特殊的风味、爽滑的质构和良好的生理功能，备受人们青睐。联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）与国际乳品联合会（IDF）于1977年对酸乳作出如下定义：酸乳，即在添加（或不添加）乳粉（或脱脂乳粉）的乳（杀菌乳或浓缩乳）中，由保加利亚乳杆菌和嗜热乳酸链球菌进行乳酸发酵制成的凝乳状产品，成品中必须含有大量的、相应的活性微生物。通常根据酸乳成品的组织状态来进行分类，具体可分为凝固型酸乳（发酵过程在包装容器中进行，从而使成品因发酵而保留其均匀一致的凝乳状态）、搅拌型酸乳（成品先发酵后灌装而得，发酵后的凝乳已在灌装前和灌装过程中搅碎而成黏稠且均匀的半流动状态）和饮用型酸乳（类似搅拌型酸奶，但包装前凝块被分散成液体）。饮用酸乳制品对身体有很多益处，乳中许多成分具有很高的营养价值，而且微生物菌群产生的许多代谢产物对人体也极为有益。⑴营养作用：牛奶中乳糖经乳酸菌发酵，其中20%～30%被分解为葡萄糖和半乳糖。前者进一步转化为乳酸或其他有机酸，这些有机酸有益于身体健康；后者被人吸收利用，可参与幼儿脑苷脂和神经物质的合成，并有利于提高乳脂肪的利用率。牛奶中的蛋白质经发酵作用后，乳蛋白变成微细的凝乳粒，易于被人消化吸收。酸奶中的磷、钙和铁易被吸收，有利于防止婴儿佝偻病和老人骨质疏松病。牛奶中的脂肪经乳酸菌作用后，发生解离或酯键被破坏，易于被机体吸收。发酵过程中，乳酸菌还会产生人体所必需的维生素 B 1、维生素B 2 、维生素B 6 、维生素B 12 、烟酸和叶酸等营养物质。⑵缓解乳糖不耐 症：乳酸菌产生的乳糖酶能降解牛奶中的乳糖，因此乳糖不耐症患者饮用酸奶就不会出现饮用牛奶时发生的乳糖不耐症，如腹胀、腹痛、肠道痉挛、下泻等。⑶整肠作用：人体肠道内存在有益菌群和有害菌群。在人体正常情况下，前者占优势；当人患病时，有害菌群占优势。饮用酸奶可以维持有益菌群的优势。⑷抑菌
发酵技术指标 沃蒙特发酵技术服务平台 NO 项目英文技术名称名称指标 1他克莫司Tacrolimus 发酵单位：大于 1.0g/L, 发酵周期： 240 小时 , 提取收 率： 60-70% 2西罗莫司Sirolimus\Rapamyci 发酵单位： 1000±200 mg/L，发酵周期： 192hrs ，收率：35- 40% n产品含量：≥ 98% 3乳酸链球菌素Nisin 发酵水平 : 12-15g /L ，发酵时间：16-20小时，收率 :65% 以上。 4霉酚酸mycophenolate 发酵单位： 12g/L 以上，发酵时 间：160 小时，提取得率：mofetil, MMF 75% 5去甲金霉素DMCT,Demethylchlor 发酵单位： 10± 2g/L ，发酵时间： 200 小时，产品收率： 75％ tetracycline 6雄烯二酮Androstenedione 发酵时间 96 ± 24 hrs ，每 3- 3.3 公斤植物甾醇可获 得 1 公斤雄烯二酮。 7利福霉素Rifamycin 发酵周期 220 小时，发酵单位大于 20g/L ，收率 65% 86- 羟基烟酸6-Hydroxynicotinic 纯度：≥ 98%，用途说明：用于合成维 生素 A Acid 9L- 缬氨酸Valine 发酵产酸： 60±5 克 /L ，发酵周 期： 60 ± 5 小时，提取 收 率： 65%（医药级） 10 L- 异亮氨酸Isoleucine 发酵产酸： 25-30 克 / 升，发酵周期 : 60-72 小时， 提取收 率： 80% 发酵单位 :35 ± 3g/L ，发酵时间 :33-35 小时，产品 得率 : 饲 11 L- 色氨酸Tryptophan 料级≥ 85%，药品级 ≥ 70%，产品质量 :>98.0%( 纯度 ) ， 糖转化率： 18% 12 糖化酶Glucoamylase 发酵周期： 6～7 天，酶 活： 8 万- 10 万 U 13 耐高温淀粉酶Amylase 发酵周期： 140h，酶活： 17 万单位 14 纤维素酶Cellulase 发酵周期： 6～7 天，酶活： 80-100IU 15 超级泰乐菌素Super tylosin 发酵单位： 14000- 16000U/ml 发酵时间： 130-150 小时提 取 收率： 70-75%
微生物制药的一般工艺流程 微生物制药技术 工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。 微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容： 第一方面菌种的获得 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温
乳酸菌研究进展 摘要:本文对乳酸菌、乳酸菌的应用、乳酸菌菌剂真空冷冻干燥技术、冻干保护剂等多方面进行了阐述。 关键词: 乳酸菌；应用；发酵剂；真空冷冻干燥 1. 前言 早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。到目前为止，人们利用乳酸菌的乳酸发酵，制作泡菜[1]、酸菜、乳酪、酸奶等食品。另外青贮饲料经乳酸发酵后可增加贮藏时间和提高饲料的利用率。在工业上制取乳酸是用淀粉类物质先糖化后，再用乳酸菌进行乳酸发酵生产纯乳酸[2-3]。发酵乳中的乳酸菌有预防肠癌、降低血液胆固醇含量、提高系统免疫功能、减轻过敏反应和防止糖尿病等功能[1-3]。由于乳酸菌所具有的营养、健康的特殊功效，使其风靡欧、美、日、韩等市场，并被广泛应用于乳制品、饮料、肉制品、保健食品等食品及预防医学领域[4-6]。 泡菜产业是我国传统发酵食品中对国民经济具有重要贡献的产业之一。但我国泡菜企业长期沿用自然菌发酵，企业规模小，泡菜生产周期长，产品质量不稳定，食用安全性差。这些问题严重影响和制约了我国泡菜产业的发展。采用现代生物技术，开发泡菜发酵专用复合菌粉生物技术产品，对改造我国传统泡菜产业具有非常重要的现实意义。直投式泡菜发酵专用复合菌粉产品，是泡菜工业化生产的专用发酵剂，但目前市场上还没有见到该产品销售。直投式泡菜发酵专用复合冻干菌粉产品的使用，可以保证泡菜的产品质量，极大地缩短泡菜的发酵时间，提高泡菜的产量和质量。 2. 乳酸菌 2.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是指在代谢过程中能产生乳酸的细菌的总称。其中能进行乳酸发酵的大部分是细菌，有些为球菌、有些为杆菌，一般都不会运动。 常见的球形乳酸菌主要有：链球菌属将糖类经双磷酸已糖途径分解产生右旋乳酸，属正型乳酸发酵。多见于动物及动物性制品上；明串珠菌属将糖经单磷酸己糖途径分解产生左旋乳酸及乙醇等物质，属异型乳酸发酵。多见于植物体及植物制品之上；片球菌属将糖类经双磷酸己糖途径分解产生混旋的乳配。多数生活在植物及其制品上。 常见的杆形乳酸菌是乳杆菌属，约有20多种，有些种类产生右旋乳酸、也有产生左旋和混旋的乳酸，动、植物及其制品上均可找到它们。 2.2 乳酸菌特殊生活特点 乳酸菌具有强抗酸能力，大部分乳酸菌还具有很强的抗盐性，都能耐5％以
乳酸发酵 生工091 060509125 王玮 摘要：本文主要就乳酸发酵过程中发酵工艺的优化，乳酸的提取和精制，及其研究进展进行了简单的概述。 关键词：乳酸发酵优化提取和精制研究进展 乳酸，又名丙醇酸，学名α-羟基丙酸，分子式为C3H6O3，其结构分子中含有一个不对称的碳原子，因此具有旋光性按其构型和旋光性可分为L-乳酸、D-乳酸和DL外消旋乳酸。本文中介绍的主要是L-乳酸。乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，是制造无毒的高分子化合物聚L-乳酸的单体，也是医药、印刷、印染、制革、食品等工业的重要原料[1]。 产酸能力强，且可应用到工业上的主要是细菌中的乳酸菌类和霉菌中的根霉属。根霉属中常用于发酵生产乳酸[2]。 1 乳酸发酵工艺的优化及进展 L-乳酸发酵生产酶原料大多采用的是玉米、大米、薯干、糖蜜或淀粉等，根据原料的不同。有的原料需要首先将其加工处理获得淀粉。然后再经糖化工艺处理得到糖类底物。有些原料则可直接用于发酵过程．最后的糖类基质经微生物发酵即可得到L-乳酸[2]。 1.1 菌种选育 菌种的优良直接关系到发酵过程的控制及其产量等，是发酵过程中的一个至关重要的影响因素。目前以米根霉为亲本的优良菌株的选育有： 1)高产菌株的筛选：白冬梅等人[3]利用酸性馒头片富集培养，用含脱氧胆酸钠和溴甲酚绿平板检出的方法，从土壤中选出了根霉菌R．oryzae3017。同时利用UV、硫酸二乙酯和60Co对菌株R．oryzae3017进行了诱变选育，得到突变株R．102l[4]。而离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明，已经证实离子注入诱变，可以获得高突变率，扩大突变谱，为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间；同时，离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导[5]。 2)利用基因工程技术得到高产的目的工程菌株。L一乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase)以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH作辅酶，可逆催化氧化L一乳酸生成丙酮酸，因此可以提高L一乳酸脱氢酶表达基因在菌株中的扩增，使其向有利于L一乳酸生成的方向进行。Skory[6]首次将米根霉的乳酸脱氢酶基因在酵母菌中表达。其后又通过提高乳酸脱氢酶活性来提高米根霉的产酸能力，其中带有较长基因片断的质粒明显比带较短基因片断质粒的产酸量高[7]。尽管基因工程实现了有目的、有控制的菌株选育，但目前关于插入的DNA片断在米根霉菌株中是如何结合与复制的还不清楚，在如何选择最佳质粒载体等方面也还有待进一步的研究。 1.2 发酵条件优化 王学东等[8]人通过正交试验法对米根霉L一乳酸摇床发酵条件和培养基配比等影响其转化率的因素进行了研究，研究得出结论表明得出了在摇床条件下米根霉产L乳酸的最佳条件是发酵时间65 h；温度32℃；装量40 mL ；接种量2％；氮源(NH4)2S042．5‰；KH2P040.15‰；MgSO4·7H200．25；ZnS04·7H20 0.05，使该菌株产乳酸达到10％以上，乳酸对糖的转化率达到75％。 1.3 乳酸发酵技术及优化与工艺
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里。 一.发酵培养基的成分 现代分离的微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物质提供能量和构成特定产物的需要。其营养物质一般包括碳源、氮源（有机氮源、无机氮源）、无机盐及微量元素、生长因子、前体、产物促进和抑制剂等。另外，在设计培养基时还必须把经济问题和原材料的供应问题等因素一起考虑在内。 此外，还要考虑所筛选的菌种来源的地点环境，比如本实验室长期从事红树林微生物的分离及其研究工作，红树林的环境处于海洋与陆地之间，所以配制培养基所用的水除了一般的去离子水外还包括陈海水。 如果在知道产物结构或者产物合成途径的情况下，我们可以有意识地加入构成产物和合成途径中所需的特定结构物质。我们也可以结合某一菌株的特定代谢途径，加入阻遏或者促进物质，使目的产物过量合成。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基已二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激赖氨酸的合成。这是因为α-氨基已二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少α-氨基已二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。 二.发酵培养基的设计和优化 由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型；另外，由于测量数据常包含较大的误差，也影响了培养基优化过程的准确评估，因此培养基优化工作的量大且复杂。许多实验技术和方法都在发酵培养基优化上得到应用，如：生物模型、单次试验、全因子法、部分因子法、PlackettandBurman法等。但每一种实验设计都有它的优点和缺点，不可能只用一种试验设计来完成所有的工作。 1.单次单因子法 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题:
浙江大学2000年工业微生物考研试题 一、是非题（共16分。只需注明 “ 对 ” 或 “ 错 ” ） ? 遗传型相同的个体在不同环境条件下会有不同的表现型。 EMP 和 HMP 代谢途径往往同时存在于同一种微生物的糖代谢中。 如果碱基的置换，并不引起其编码的肽链结构的改变，那么，这种突变现象称为沉默突变。 低剂量照射紫外线，对微生物几乎没有影响，但以超过某一阈值剂量的紫外线照射，则会导致微生物的基因突变。 在宿主细胞内， DNA 病毒转录生成 mRNA ，然后以 mRNA 为模板翻译外壳蛋白、被膜蛋白及溶菌酶。 总状毛霉和米根霉同属藻状菌纲。 大多数微生物可以合成自身所需的生长因子，不必从外界摄取。 产子囊孢子的细胞一定是双倍体，而出芽生殖的细胞可以是双倍体，也可以是单倍体。 E.coli K12( l ) 表示一株带有 l 前噬菌体（ Prophage) 的大肠杆菌 K12 溶源菌株。 因为不具吸收营养的功能，所以，将根霉的根称为“假根”。 因为细菌是低等原核生物，所以，它没有有性繁殖，只具无性繁殖形式。 与单独处理相比，诱变剂的复合处理虽然不能使微生物的总突变率增大，但能使正突变率大大提高。 微生物系统分类单元从高到低依次为界、门、纲、科、目、属、种。 在自然条件下，某些病毒DNA 侵染宿主细胞后，产生病毒后代的现象称为转染（transfect) 。 一个操纵子中的结构基因通过转录、转译控制蛋白质的合成，而操纵基因和启动基因通过转录、转译控制结构基因的表达。 蓝细菌是一类含有叶绿素 a 、具有放氧性光合作用的原核生物。 二填充题（共 30分）： 实验室常见的干热灭菌手段有 a 和 b 等。 实验室常用的有机氮源有 a 和 b 等，无机氮源有 c 和 d 等。为节约成本，工厂中常用e 等作为有机氮源。 细菌的个体形态主要有 a 、 b 和 c 等。 细菌肽聚糖由 a 和 b 交替交联形成基本骨架，再由 c 交差相连，构成网状结构。 a 是芽孢所特有的化学物质。一般它随着芽孢的形成而形成，随芽孢的萌发而消失。 微生物系统命名采用 a 法，即 b 加 c 。 中体 (mesosome) 是 a 内陷而成的层状、管状或囊状结构。它主要功能 b 。 鞭毛主要化学成分为 a ，鞭毛主要功能为 b 。 荚膜的主要化学成分有 a 和 b 等，常采用 c 方法进行荚膜染色。 霉菌细胞壁化学组成是 a 等；酵母菌细胞壁化学组成是 b 和 c 等。 培养基按其制成后的物理状态可分为 a 、 b 和 c 。 枝原体突出的形态特征是 a ，所以，它对青霉素不敏感。 碳源对微生物的主要作用 a 。 Actinomycetes 是一类介于 a 和 b 之间，又更接近于 a 的原核微生物。它的菌丝因其形态和功能不同可分为 c 、 d 和 e 。 霉菌的有性繁殖是通过形成 a 、 b 和 c 三类孢子而进行的。其过程都经历 d 、 e 、 f 三阶段。大多数霉菌是 g 倍体。
工艺流程：淀粉 水解反应 葡萄糖 预处理 液仓 淀粉乳 盐酸（酸化）调配 预热（85℃～90℃） 均质（300～500KPa） 杀菌(100℃，10min) 冷却(50℃左右) 菌种保藏菌种活化菌种扩培接种 发酵（终点） 冷却（15℃～20℃） 溶解杀菌混合
氮源、中和剂（碳酸钙）分离 提纯 乳酸成品 保持冷链贮存或销售 4.2.1.2 操作要点说明 （1）预处理 净化可以除去原料中的杂质，使淀粉达到最高的纯净度。 （2）水解 淀粉是葡萄糖以ɑ-1，4-糖苷键连接起来的多聚体，在催化剂存在和适宜温度等条件下，易于水解成葡萄糖、麦芽糖、糊精等单体或低聚物。合理控制水解，尽可能减少副反应发生，则是糖化工艺所要控制的关键。 （3）预热 预热一方面可以杀菌，而且由于适当加热，可以使葡萄糖液化，并完全去除淀粉和多聚糖的存在，增加产品的稳定性。预热温度控制在85℃～90℃。 （4）均质 均质主要是使原料充分混合均匀，阻止分层，提高葡萄糖的稳定性和稠度，并保证单体均匀分布，从而获得质地细腻、口感良好的产品。均质压力控制在300～500KPa。 （5）杀菌 杀菌目的在于杀灭原料中的杂菌确保乳酸杆菌的正常生长和繁殖，钝化原料中的天然抑制物。杀菌温度控制在100℃，保温10min进行杀菌。 （6）冷却 冷却主要是为接种的需要。经过热处理的糖乳需要冷却到一个适宜的接种温度，此温度控制在50℃左右。
（7）接种 接种是造成糖乳受微生物污染的主要环节之一，因此严格注意操作卫生，防止细菌、酵母、霉菌、噬菌体及其他有害微生物的污染。接种时充分搅拌，使发酵菌与原料混合均匀。 （8）发酵 发酵温度控制在50℃左右，从而为微生物代谢提供最适的温度环境，发酵时间24h，且期间不搅拌。 发酵终点判定：发酵时罐口敞开，让CO 自由逃逸。当残糖降到1g/1时， 2 就识为发酵已经完成，再测定pH 时即可停止发酵。 （9）冷却 冷却目的是抑制乳酸菌的生长、降低酶的活性、防止产酸过度、使糖液逐渐凝固、降低和稳定CO 析出的速度。将发酵乳迅速降温至15℃～20℃。 2 （10）混合 将经溶解和杀菌的氮源、中和剂与发酵乳进行混合。 （11）分离提纯 由于乳酸在发酵过程中加入碳酸钙，因此，发酵最终的醪液悬乳酸与碳酸钙形成的乳酸钙，以水和形式存在。根据这一特性，采取相应的过滤介质和方法，即离子交换脱盐转酸方式及其分离提纯工艺。 （12）灌装和冷藏 采用相应灌装机进行灌装后的成品置于0℃～5℃冷藏12h～24h，进行后熟。
微生物发酵法生产透明质酸 郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。 1 透明质酸的发展 1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。 由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。 工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。提取法和发酵法生产HA的比较见表1。 表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项目提取法发酵法 存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖 形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易 分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大 价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg 应用价格昂贵，化妆品中的添加量 受到制约 能增加化妆品中的添加量 发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后 化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。山东省生物药物研究院（原 山东省商业科技研究所）是国内最早从事HA研究开发的单位之一，1990 年该院郭学平等在国内首先开始HA的发酵生产研究，先后完成了小试和中 试实验。发酵法生产HA的研究成功改变了我国HA生产技术的落后局面， 使我国HA的生产进入了新的发展时期。 2 化学结构及理化性质 HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛 酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图1。
工业微生物学3章 1、 什么是营养物质？营养物质有哪些生理功能？ 营养指物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的过程，这些能量和物质即为营养物质。 营养物质的生理功能有：为生物提供必需的能量，结构合成物质，调节生物体的新陈代谢，为生物提供良好的生理环境。 4、什么是能源？试以能源为主，对微生物营养类型进行分类能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 能源是指能为微生物的生命活动提供必需的能量来源的营养物质和辐射能。 以能源，碳源不同可将微生物分成四大类: 7、什么是生长因子？它主要包括哪几类化合物？是否任何微生物都需要生长因子？如何才能满足微生物对生长因子的需求？ 生长因子：某些微生物不能从普通的碳源。氮源合成，而需要另处少量加入来满足生长需要的有机物质。 主要包括：氨基酸，维生素，嘌呤和嘧啶及其衍生物、甾醇、胺类、C4～C6 的分枝或直链脂肪酸等。 各种微生物所需的生长因子互不相同，有的需要多种，有的不需要，培养条件也会影响微生物对生长因子的需求。 为了满足微生物对生长因子的需求，一般要在培养基本中添加少量的该种生长因子。 9、为什么实验室配制培养基时，一般采用蛋白胨而不是以蛋白质为氮源？为什么枯草杆菌能水原明胶，而大肠杆菌则不能？ 蛋白胨是水解产物，微生物可直接利用，另处蛋白胨比蛋白质更易保存，所以实验室一般用蛋白质胨作氮源。 大肠杆菌是G+ 菌，它的细胞壁中含有脂多糖和外壁层，使蛋白分解酶无法穿过细胞壁，来到胞外水解明胶，而枯草杆菌是G-菌，情况相反，因而可以水解明胶。 13、什么是选择性培养基？它在工业微生物学工作中有何重要性？试举一例并分析其中的选择性原理。 根据某种某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理，化学条件的抗性而设计的培养基，称为选择性培养基，其重要性在于它可以使混合菌样中的劣势变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。 例如，已知结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，那么，在革兰氏阳，阴性菌的混合培养物中加入结晶紫，即可使革兰氏阳性菌的生长受到抑制，而分离对象革兰氏阴性菌则可趁机大大增殖，在数量占据优势。 16、什么是微生物的最适生长温度？温度对同一微生物的生长速度，生长量代谢速度及各代谢产物的累积的影响不否相同？研究这一问题有何实践意义？ 最适生长温度是某微生物分裂代时最短成生长速率最高时的培养温度。同一微生物的不同生理过程有着不同的最适温度，温度对同一微生物的生长速度，生长量，代谢速度及各代谢产物的累积量的影响各不相同。 研究这一问题，使我们能根据目标产物的情况，选择最适温度，以提高发酵生产效率。 19、 24、导酵母菌接种到含有葡萄糖和最低限度无机盐的培养液中，并分装到烧瓶A 和B 中，将烧瓶A 放在30 的好氧培养中，烧瓶B 放在30 的 氧培养。问： A 哪个培养能获得更多的A TP ？A B 哪个培养能获得更多的酒精：B C 哪个培养中的细胞世代时间更短？A D 哪个培养能获得更多的细胞量？A E 哪个培养液的吸光更高？A 能 源 CO2(自养型)------- 自养型 有机碳化物-------光能异养型 光： 光能营养型 化合物： 化能营养型
微生物发酵制药 -----总体工艺过程流程 工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。 微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。 微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容： 第一方面菌种的获得 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 1.分离思路：新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。 2.定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 3.采样：有针对性地采集样品。 4.增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第37卷 第3期 生物工程· 40 ·甲壳素(Chitin)是自然界中唯一带正电荷的天然高分子聚合物，学名为(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(C 8H 13NO 5)n。它的来源极为广泛，主要存在于甲壳动物外壳、软体动物内骨骼、昆虫表皮、菌类及藻类等微生物的细胞壁中。每年地球上的生物合成量约为100亿t，是产量仅次于纤维素的第二大可再生资源，也是除蛋白质外数量最大的含氮天然有机高分子。甲壳素收稿日期：2011-08-11 *通讯作者 作者简介：程倩(1986—)，女，湖北天门人，博士研究生，研究方向为食品科学。 性能独特、组织相容性良好、可生物降解，其开发应用已涉及工业、农业、国防、化工、环保、食品、医药、保健、美容、纺织等诸多领域。目前，工业上用来生产甲壳素的主要原料是水产加工厂废弃的虾壳和蟹壳，其甲壳素的含量一般在15%~40%，蛋白质含量为20%~40%，碳酸钙含量为20%~50%。制备甲壳素的方法主要包括脱盐、脱蛋白、脱色等３个步骤，即采用稀盐酸程 倩1，吴 薇2，籍保平1* (1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083； 2.中国农业大学工学院，北京 100083) 摘要：甲壳素是含氮天然有机高分子，具有优良的生物活性、安全性和降解性，在农业、化工、环保、食品、医药等行业有着巨大的应用前景。甲壳素制备方法主要有传统的酸碱法以及新兴的微生物发酵法。对微生物发酵法提取甲壳素的国内外研究进行综述，并探讨了微生物发酵的问题及今后的研究方向。 关键词：甲壳素；发酵；提取；进展 中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)03-0040-04 Progress on the extraction of chitin by microbial fermentation CHENG Qian 1, WU Wei 2, JI bao-ping 1* (1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083 )Abstract: Chitin is a nitrogen-containing natural organic polymer, possesses excellent biological activity, safety and degradability, and has a great prospect in agriculture, chemical industry, environmental protection, food, pharmaceutical and other industries. The traditional acid-base method and the emerging microbial fermentation are two main methods for chitin preparation. In this paper, the advance of the extraction of chitin by microbial fermentation at home and abroad was illuminated. At last, the method of fermentation was also discussed. Key words: chitin; fermentation; extraction; progress 微生物发酵法提取甲壳素的国内外研究进展
浙江大学工业微生物92-97 1992 年攻读硕士学位研究生入学考试试题 一填空（共15分） 1、细菌一般进行a 繁殖，即b 。酵母的繁殖方式分为有性和无性两类，无性繁殖又可分为c ，d 两种形式，有性繁殖时形成 e ；霉菌在有性繁殖中产生的有性孢子种类有 f ，g ，h ；在无性繁殖中产生的无性孢子种类有i ，j ，k ；放线菌以l 方式繁殖，主要形成m ，也可以通过n 繁殖。 2、一摩尔葡萄糖通过EMP途径和TCA循环彻底氧化，在原核微生物中产生a 摩尔ATP，在真核微生物中产生b 摩尔ATP，这是因为在真核微生物中，c 不能通过线粒体膜，只能借助于d 将EMP途径产生的磷酸二羟丙酮还原成 e ，后者可进入线粒体，将氢转移给f ，形成g ，自身又回复到磷酸二羟丙酮。这一过程称为“穿梭”，每次穿梭实际损失h 个ATP。 3、微生物基因突变的机制包括a 、b 及c 。诱发突变的方法分为物理方法和化学方法，物理方法主要是d ， e ， f 和g ；化学诱变剂包括h ，i 和j 。 二是非题（叙述正确的在括号写T，错误的写F，共10分） 1、自养型、专性厌氧型微生物不是真菌（） 2、在酵母细胞融合时，用溶菌酶破壁（） 3、从形态上看，毛霉属细菌都有假根（） 4、营养缺陷型菌株不能在基本培养基上正常生长（） 5、产黄青霉在工业生产上只用于生产青霉素（） 6、分子氧对专性厌氧微生物的抑制和制死作用是因为这些微生物内缺乏过氧化氢酶（） 7、同工酶是指能催化同一个反应，有相同控制特征的一组酶（） 8、基因位移是借助于酶或定向酶系统实现的主动输送，因此不需要消耗能量（） 9、培养基中加入一定量NaCl的作用是降低渗透压（） 10、噬菌体的RNA必须利用寄主的蛋白质合成体系翻译，因此只能在寄主体内繁殖（） 三. 名词解释（共15分） 1、抗代谢物 2、温和噬菌体 3、阻遏酶 4、转化 5、活性污泥 四在恒化器中培养微生物，在稳态操作时，μ=D，D为稀释率，μ可用Monod公式描述：求：a. 恒化器出口底物浓度S0和微生物浓度X0 b. 当稀释率D增加到一定程度后会产生“清洗”现象，求发生清洗现象的最小稀释率Dcrit c. 单位体积细胞产率可以用细胞出口浓度X0与稀释率的乘积DX0表示。求当DX0达到最大值时的稀释率Dmax 五. 简要叙述工业微生物研究和实验中的微生物培养基必须具备的要素和对于大规模生产 时对培养基的基本要求。（15分） 六. 以肌苷酸生产菌为例，说明营养缺陷型菌株筛选的机理及筛选的方法。（15分） 七. 试述革兰氏阳性菌和阴性菌在细胞壁组成上的差别，并判断下述几种微生物的染色结果是什么。 a. 枯草芽孢杆菌 b. 金黄葡萄球菌 c. 大肠杆菌 d. 乳链球菌 e.假单孢菌 1993年攻读硕士学位研究生入学考试试题 一填空（共15分，每格0.5分）
1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？ 工业微生物育种建立在： （1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上； （2）物理和化学诱变剂的发现和应用； （3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。 工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。 2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？ 1)自然选育阶段 2)人工诱变选育阶段 3)杂交育种阶段 4)代谢控制育种阶段 5)基因工程育种阶段 3.工业微生物育种的核心指标有哪些？ 1)在遗传上必须是稳定的。稳定性。 2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。 3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。 4)种子的生长必须旺盛、迅速。 5)产生所需要的产物时间短。转化率。 6)比较容易分离提纯。 7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 8)能保持较长的良好经济性能。产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。 10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？ 5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理； 球状体：G-菌，残留部分细胞壁。 是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。 L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株； 6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。 酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。
课程名称：工业微生物学 课程编码：04043100 英文名称：Industrial Microbiology 学时：54 学分：3 适用专业：生物工程，制药工程，食品科学与工程，生物技术，食品质量与安全 课程类别：必修 课程性质：学科基础课 先修课程：生物化学 教材：《微生物学》路福平等，中国轻工业出版社，2005 一、课程性质与任务 工业微生物学是为生物工程、制药工程、食品科学与工程、食品质量与安全和生物技术专业开设的一门重要技术基础课。通过本课程的学习，要求学生掌握微生物的基本知识，包括微生物的形态、结构、营养、生长、环境因素对微生物的影响、菌种选育、菌种保藏以及新陈代谢和遗传变异等；了解微生物在生物界中的地位、在自然界中的分布与作用、特别是在食品、发酵与制药工业中的实际应用等，为其它专业课的学习奠定良好基础。 虽然工业微生物学是我校生物工程，制药工程，食品科学与工程，食品质量与安全，生物技术专业重要的一门基础生物学课程，但因为学习时间有限，因而本课程不能详尽无遗地讲解微生物学的各个方面，在内容的选择和安排上要注意做到主次分明、概念清楚、由浅入深、理论联系实际，为提高教学质量与教学效果创造有利条件。 二、课程教学的基本要求 工业微生物学是生物工程、制药工程、食品科学与工程、食品质量与安全和生物技术专业的一门重要技术基础课，以阐述微生物的形态结构与功能、微生物的营养、环境因素对微生物生长的影响以及微生物的遗传育种为主，同时适当介绍微生物的生态学、微生物的分类以及传染与免疫等知识。考虑到学生已经在生物化学课中学过各种物质代谢的知识，所以在工业微生物学中不再讲解，只介绍微生物的产能方式如呼吸和发酵。通过本课程的学习，要求学生掌握微生物的基本知识，包括微生物的形态、结构、营养、生长、环境因素对微生物的影响、菌种选育、菌种保藏以及新陈代谢和遗传变异等；了解微生物在生物界中的地位，在自然界中的分布与作用，特别是在食品、发酵与制药工业中的实际应用等，为其它专业课的学习奠定良好基础。 为适应相应专业的发展，还要求比较系统地掌握发酵专业中有关微生物的形态、生理、培养、鉴别、检出、筛选、保藏等方面的知识；了解微生物对营养物质的需要和营养物质在生命活动中的功能，具有选择与配制培养基的能力；掌握灭菌的原理与方法；了解环境因素与微生物生命活动的关系、了解微生物的生长发育、呼吸与发酵之间的关系、了解微生物在自然界中的分布及微生物间的相互关系和寻找新菌种的途径。通过对遗传变异知识的学习使学生具有分离、筛选和培育微生物新菌种的能力。 三、课程内容及教学要求 第一章绪论
乳酸发酵工艺流程 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
工艺流程：淀粉 水解反应 葡萄糖 预处理 液仓 淀粉乳 盐酸（酸化）调配 预热（85℃～90℃） 均质（300～500KPa） 杀菌(100℃，10min) 冷却(50℃左右) 菌种保藏菌种活化菌种扩培接种 发酵（终点） 冷却（15℃～20℃） 溶解杀菌混合 （碳酸钙）分离
提纯 乳酸成品 保持冷链贮存或销售 4.2.1.2 操作要点说明 （1）预处理 净化可以除去原料中的杂质，使淀粉达到最高的纯净度。 （2）水解 淀粉是葡萄糖以ɑ-1，4-糖苷键连接起来的多聚体，在催化剂存在和适宜温度等条件下，易于水解成葡萄糖、麦芽糖、糊精等单体或低聚物。合理控制水解，尽可能减少副反应发生，则是糖化工艺所要控制的关键。 （3）预热 预热一方面可以杀菌，而且由于适当加热，可以使葡萄糖液化，并完全去除淀粉和多聚糖的存在，增加产品的稳定性。预热温度控制在85℃～90℃。 （4）均质 均质主要是使原料充分混合均匀，阻止分层，提高葡萄糖的稳定性和稠度，并保证单体均匀分布，从而获得质地细腻、口感良好的产品。均质压力控制在300～500KPa。 （5）杀菌 杀菌目的在于杀灭原料中的杂菌确保乳酸杆菌的正常生长和繁殖，钝化原料中的天然抑制物。杀菌温度控制在100℃，保温10min进行杀菌。 （6）冷却 冷却主要是为接种的需要。经过热处理的糖乳需要冷却到一个适宜的接种温度，此温度控制在50℃左右。 （7）接种 接种是造成糖乳受微生物污染的主要环节之一，因此严格注意操作卫生，防止细菌、酵母、霉菌、噬菌体及其他有害微生物的污染。接种时充分搅拌，使发酵菌与原料混合均匀。