第29卷第11期 光 子 学 报 V ol.29N o.11 2000年11月 AC TA PHO TON IC A SIN ICA N ov ember2000
植物叶片超微弱发光光谱研究
谭石慈 邢 达 唐永红 李德红
(华南师范大学激光生命科学研究所,广州510631)
摘 要 利用以高灵敏度背向照明CCD和象增强器为核心的探测系统,对植物叶片和叶绿体光诱导的超微弱发光(延时发光)光谱进行探测,结果发现,叶片和叶绿体的延时发光光谱很一致,二者在485、560～590、650、685、725～735nm附近都有发射峰.随着光照停止时间的延长,光强逐渐减弱,但峰位仍保持不变.
关键词 超微弱发光;延时发光;光谱;叶片;叶绿体;叶绿素
0 引言
生物的超微弱发光现象普遍存在于动植物之中.这种发光强度极低,仅10～104hν/cm2·s,波长范围在1,2180～800nm.虽然生物超微弱发光的机制仍然还在探讨之中,但至今进行的很多研究工作表明超微弱发光与生物体的诸多生命活动密切相关,如氧化代谢、细胞分裂、细胞凋亡、生长调节、光合使用、去毒作用等等3～9.光合作用是绿色植物的一项重要功能,光在植物的生长发育过程中起着十分重要的作用.为了探讨生物超微弱发光与生物学过程的联系以及在农业科学领域的应用潜能,我们利用自行研制的超微弱发光图象探测系统对植物叶片光诱导的超微弱发光(延时发光)光谱进行了初步探测,得到了一些有意义的结果.
1 材料与方法
1.1 材料
叶片取自新鲜白菜(B rassica pekinensis Rupr)以及庭园绿化植物洒金榕(Codiaeum Variegatum(L.)Bl.).其中洒金榕是一种色素缺陷型植物,叶片上间杂有许多黄色的斑点.叶绿体取自白菜叶片,分离方法参照文献10.色素取自洒金榕叶片以及绿豆(Phaseolus radiatus L.)黄化苗和绿苗,萃取方法参照文献10.
1.2 方法
实验装置如图1所示.主要由样品室、象增强器(Hamamatsu C3100,J a pan)、中继镜(相对孔径1∶1.4)、背向照明致冷CCD探测器(TE/ CCD-512T KB,PI inc.,Am erica)、S T130控制器(PI Inc.,America)以及计算机组成.样品室内壁涂黑,以避免内壁多次散射光对实验的影响
.
图1 实验装置示意图
Fig.1 Schema tic diag r am of ex perimental setup
样品的发光图象被象增强器增强后,经中继镜成象在CCD探测器的光阴极上,由控制器进行二维图象采集,并在计算机屏上显示出来.光谱的测量只需在象增强器的镜头前放置一滤光片,就可获得某波长附近的发光图象.实验中共使用了30片窄带滤光片,中心波长:410～750nm,带
国家杰出青年科学基金(批准号69725009)和广东省自然科学基金(批准号970315)资助项目 收稿日期:2000-03-28
宽:7.0～13.5nm ,透过率:60%～80%.样品经60W 白炽灯照射2分钟后放入样品室,暗置20s 后开始记录.连续采集6幅图象,每幅采集时间10s.每换一片滤光片都进行同样的记录.
利用上述方法获得各个波长的发光图象后,从图象中取出强度数据,用滤光片的透过率和带宽对数据进行校正并归一化,可作出发光光谱曲线.
洒金榕和绿豆黄化苗及绿苗的色素吸收光谱由华南师范大学分析测试中心提供.
2 结果和分析
2.1 白菜叶片和叶绿体的延时发光光谱
图2给出了白菜叶片(a)和叶绿体(b)的延时发光光谱随时间的变化情况.从图2可以看出,叶片与叶绿体的延时发光光谱很相似,二者在485、580～590、650、685、725～735nm 附近都有较强的峰,发光强度随时间很快地衰减,但光谱分布基本保持不变.叶片与叶绿体之间发光光谱的这种一致性说明,叶片的延时发光主要来自叶绿体
.
图2 不同时间测到的白菜叶片(a)和叶绿体(b)的延时
发光光谱.曲线1～6分别为光照停止20、30、40、50、60、70s 后测到的光谱
Fig.2 Spectra o f dela y emissio n fr om Chinese cabbag e
leaf (a )and ch lo ro plast suspensio n (b )m ea sur ed at differe nt times .Lines 1～6a re spectra mea sur ed a t 20,30,40,50,60,70seco nds
a fter the cessa tio n o f illumina tio n respectiv ely
人们发现所有的光合作用生物都能发生一种“后发光”.例如植物被光照一段时间后又放到暗处,能继续发出微弱的红光.这种后发光叫做“滞后荧光”11
,以便与激发光去掉之后大约10-9
s 内就停止的“瞬发荧光”相区别.这两种类型的发光具有相同的光谱分布,都与光系统Ⅱ的反应中心的叶绿素有关
11,12
.我们实验过程中的图象采集
至少是在停止光照20s 后进行的,因此探测到的发光不是去激发后叶绿素分子的瞬发荧光,但不排除含有滞后荧光的成分.从图2来看,红区的发光占了发光总量的30%～40%左右.滞后荧光可能与反应中心叶绿素的逆还原有关11.2.2 洒金榕叶片的发光图象及色素分析
图3(b)为洒金榕叶片的延时发光图象,(a )为叶片的外形图.外形图中叶片上的明亮区域为黄色斑点和叶脉,灰色区域为叶片的绿色部分.从图3可以看出,叶片上的黄色斑点和叶脉在发光图象中呈现为暗区,而叶片的绿色部分呈现为亮区.这说明洒金榕叶片的绿色部分有延时发光,而黄色部分没有.
图3 洒金榕叶片的延时发光图象.(a )、(b )为叶片的外
形图Fig.3 Pho tog ra ph (a )and emissio n image (b)of “Sa
J in Ro ng ”leaf
将叶片的黄色部分和绿色部分分离开,分别提取色素,测吸收光谱.结果表明(见图4),洒金
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榕叶片的黄色部分只含有胡萝卜素和叶黄素,而绿色部分不仅含有胡萝卜素和叶黄素,还含有叶绿素a 、b.由此可见,叶绿素a 、b 在延时发光中起到了重要的作用.我们曾发现黄化绿豆苗在去黄化过程中,延时发光强度逐渐上升,最后达到一稳定值13.黄化苗的去黄化即黄化质体(原质体)发育为成熟叶绿体的过程.黄化质体不含叶绿素,只含有原叶绿素,去黄化后原叶绿素分子转化为叶绿素分子.色素的吸收光谱(未给出)说明,绿豆的黄化苗只含类胡萝卜素,不含叶绿素a 、b,而去黄化后的绿苗含有大量的叶绿素a 、b.这也说明了叶绿素分子在延时发光中起到了关键作用
.
图4 洒金榕叶片黄色部分(a )和绿色部分(b )的色素吸
收光谱.叶黄素和胡萝卜素的吸收峰:443,470,420nm ;叶绿素a 的吸收峰:430,662,410nm ;叶绿素b 的吸收峰:453,642nm .
Fig .4 Abso rptio n spectr a o f pig ments ex tracted fro m
the yello w pa rts (a )and the g reen par ts (b )of “Sa J in Ro ng ”leaf .Abso r ption peaks of xa ntho ph yll and ca ro tene :443,470,420nm;abso r ption pea ks o f chlo ro phy ll a :430,662,410nm;abso rptio n peaks o f chlor opyll b :453,642nm
洒金榕叶片上的黄色斑点部分含有的质体为有色体,不具有光合作用能力.而黄化苗的黄化
质体同样不具有光合作用能力,只有发育为成熟的叶绿体后才能进行光合作用.可见,没有光合作用能力的质体是没有延时发光的,这说明延时发光与光合作用过程有关,并且与叶绿素有关.
3 讨论
叶绿体是植物进行光合作用的场所.光合作用是一个光能的吸收、转化和能量贮存的过程.从水的氧化到二氧化碳的还原需要 1.4eV 的能量14,这个“上山”过程是通过光合作用的两个光系统(光系统Ⅱ和光系统Ⅰ)协同完成的.光系统Ⅱ与水的氧化相连系,光系统Ⅰ与N ADP +
的还原相连系.每个光系统都有一个反应中心,反应中心由一种特殊状态的叶绿素a 分子和电子供体-受体组成.辅助色素(天线色素)吸收的能量只有传递到反应中心才能被陷获,此后才会发生电荷分离和后继的一系列氧化还原反应,光能才转化为化学能.
反应中心发生电荷分离后接着进行一系列的电子传递,即一系列氧化还原反应.电子很快地
在H 2O 与N ADP +
之间的一连串的电子传递链(载体)上传递.这些电子载体按氧还原势从高到低的顺序排列在内囊体膜上.电子从膜内向膜外
流动的同时,伴有质子(H +
)通过质醌(PQ )库从膜外向膜内的跨膜运输.当质子通过“偶连因子”CF 1(AT P 酶)返回膜外时,这种潜在的能源就被A TP 酶利用合成AT P.因此,只要电子在电子传递链上传递,质子就能经过通路而流动,合成A TP,如同水流经涡轮机将能量以电能的形式贮存起来一样.当两个顺次相连的载体的氧还原势的差别超过0.16V 时,就足以使ADP 与Pi 合成A TP 15.光反应的总产物N ADPH 和ATP 分别
用作CO 2转化为糖的还原力和能源.
所以,在自然情况下,叶绿体就象一个精致微观的换能器,不断地将光能转换为化学能贮存在有机分子中.此时,反应中心的激发态叶绿素a 分子只能进行一种高效率的反应,即光氧化反应,而不会发生电子传递的逆转.停止光照后,光氧化裂解水释放电子的途径受阻,光系统Ⅱ反应中心P +
680只有从Pheo -
夺取一个电子填补空穴,从而造成电子传递的逆转和激发态分子P *
680的形成.P *
680以光子的形式释放能量回到基态的过程,就产生了反应中心电荷重合时的发光.电子从
Pheo -回到P +
680所需的活化能可由停止光照后发生的ATP 回复反应(A TP →ADP +Pi)释放的能量来提供14.
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11期 谭石慈等.植物叶片超微弱发光光谱研究
总之,停止光照的即刻,截断了光合使用的能量来源,反应中心原初光化学反应推动的一系列复杂的电子传递过程、质子的跨膜运输以及与之相偶连的光合磷酸化过程都停止下来.以光反应的最终产物A TP和N ADPH为动力的CO2的同化过程也停止下来,高能产物ATP回复反应释放的能量重新布居叶绿素分子的激发态.这样,贮存在AT P中的部分能量又重新以光子的形式由叶绿素分子释放出来.
由于延时发光与光合作用过程紧密联系,叶片延时发光的直接探测可能作为检测植物光合使用能力的一项指标.并且由于延时发光持续时间较长,也可为光合作用原初反应后继过程的研究提供有用的信息.超微弱发光的探测和光谱分析有可能为检测植物光合作用的生化过程以及光合效率提供一种新方法.
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SPECTRAL STUDIES OF ULTRA -WEAK BIOPHOTON
EMISSION FROM PLANT ′S LEAVES
Tan Shici,Xing Da,Tang Yo ngho ng ,Li Dehong
L aser L ife Science Institute ,South China N ormal University ,Guangz hou 510631
Receiv ed date :2000-03-28
Abstract With a high sensitivity back -illuminated CCD detecto r a nd an imag e intensifier ,it is studied
the ultra-w eak biophoton emission spectra o f pla nt ′s leaves and chlo ropla st,and found that the emission spectra o f Chinese cabbage leaf a nd chlo roplast resemble closely each other,the emission
peaks are distributed ov er 485,560
～590,650,685,725～735nm ,the intensity dro ps g radually with the time,but the distribution of the peaks do n ′t chang e.Keywords Ultra-w eak bio photon emission;Delay emissio n;Spectra;Chlo roplast;Chlorophyll
Tan Shici w as bo rn in 1943.She g raduated from the phy sics department ,
Zhong shan Univ ersity in 1966.She had been eng aged in the technolog y a nd applications of laser at Univ ersity o f Science and Tech nolog y o f China untill 1989.From then o n,she w o rked on photobiolog y at Laser Life Science Institute,South China No rm al University .
书 讯
《生物医学光子学进展》
生物医学光子学是近年来受到国际生物医学界和光子学界关注的一个热点.近几年的发展表明,该学科已包括了光子学、电子学、计算机、生命科学、数学、物理等学科的交叉与融合,其研究必将对人类生命科学的发展产生重大影响.
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