作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(10): 1691?1697
https://www.doczj.com/doc/045634429.html,/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@https://www.doczj.com/doc/045634429.html,
本研究由现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-34), 国家自然科学基金项目(30960322), 中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项资金(XJSYWFZX2008-01)和国际科技合作项目(2008DFA32020)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 黄华孙, E-mail: xjshhs@https://www.doczj.com/doc/045634429.html,
第一作者联系方式: E-mail: tdhuang1986@https://www.doczj.com/doc/045634429.html,
Received(收稿日期): 2010-02-05; Accepted(接受日期): 2010-04-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01691
根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立
黄天带 李 哲 孙爱花 周权男 华玉伟 黄华孙*
中国热带农业科学院橡胶研究所 / 国家橡胶树育种中心 / 农业部橡胶树生物学重点开放实验室 / 省部共建国家重点实验室培育基地 / 海南省热带作物栽培生理学重点实验室, 海南儋州 571737
摘 要: 为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系, 以花药愈伤组织为受体, 研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明, 农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响, AS 不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后, 转入未添加AS 的培养基, 22℃共培养6 d, 通过50 mg L –1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS 染色、uid A 和Npt II 基因PCR 特异扩增、PCR 产物测序及Npt II 基因Southern 检测, 鉴定出11株转基因植株, 并通过嫁接和次生体胚发生, 获得来自8个转基因株系的681株转基因植株, 移栽成活253株。
关键词: 橡胶树; 根癌农杆菌; 花药愈伤组织; 遗传转化; 次生体胚发生
Establishment of Agrobacterium tumefaciens -mediated Anther Calli Transfor-mation System in Hevea brasiliensis
HUANG Tian-Dai, LI Zhe, SUN Ai-Hua, ZHOU Quan-Nan, HUA Yu-Wei, and HUANG Hua-Sun *
Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Rubber Tree Breeding Centre / Key Laboratory of Rub-ber Biology, Ministry of Agriculture / State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation ＆ Physiology of Tropical Crops, Danzhou 571737, China
Abstract: Developping a new Hevea variety by crossing breeding will take 20?30 years, but genetic transformation provides an effective alternative for shortening breeding cycle. At present, two kinds of recipient materials, anther compact embryogenic calli (ACEC) and maintained friable embryogenic calli (MFEC), have been used successfully in Hevea genetic transformation. How-ever, few transformed plants are produced from ACEC-derived embyos, and plants regenerated from MFEC are abnormal, show-ing that they have poorer performance in growth, yield, and disease resistance than the budded control. In order to establish Agro-bacterium tumefaciens -mediated Hevea anther calli transformation system, we surveyed the factors influencing transformation frequency, including strains of Agrobacterium , co-culture temperature/time and acetosyringone (AS), and the methods for em-bryos regeneration. GUS transient expression frequency was significantly affected by Agrobacterium strains and co-culture tem-perature/time, which was 5.07 blue spots/callus for EHA105, higher than that for GV3101 and LBA4404. The highest GUS tran-sient expression frequency was 8.43 and 19.10 blue spots/callus under 22 co ℃-cultured temperature and 6 d co-cultured time respectively. Twenty-two thousand ACEC were transformed by the strain EHA105 with pCAMBIA2301, and then transferred to the medium without AS and incubated at 22 for 6 d in the dark. Subsequently, ℃11 transformants were identified by GUS staining, PCR amplification of target genes, sequencing of PCR products and Southern hybridization. Among them, three planted died di-rectly in the field; three as scions were budded onto seedlings, producing five budded transgenic plants; five were multiplicated at embryo phase by secondary embryogenesis, producing 676 transgenic plantlets, among which 248 survived in the field. The re-sults showed that the present transformation system and the plant propagation by transgenic embryos secondary embryogenesis are efficient for the production of transgenic rubber plants.
Keywords: Hevea brasiliensis ; Agrobacterium tumefaciens ; Anther calli; Genetic transformation; Secondary embryogenesis
天然橡胶具有合成橡胶无法比拟的弹性、延展性及导热性, 是重要的工业原料[1], 主要来源于巴
西橡胶树(Hevea brasiliensis Mu?ll. Arg.)。巴西橡胶树为多年生异花授粉木本作物, 童期长达5~6年,
1692作物学报第36卷
通过常规杂交育种手段, 培育一个新品种需要20~ 30年。转基因技术是缩短橡胶树育种周期、加快新品种培育十分有效的途径。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的橡胶树遗传转化研究, 始于20世纪90年代。Arokiaraj 等[2-3]以花药致密胚性愈伤组织为受体, 首次成功建立农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系, 获得3株转Npt II基因和uidA基因植株。Montoro等[4-5]和Blanc 等[6]以内珠被长期继代易碎胚性愈伤组织为受体, 通过研究钙、共培养温度等因子对农杆菌介导遗传转化效率的影响, 获得374株转Npt II基因和uidA 基因橡胶树。橡胶树遗传转化体系的成功建立为功能基因转化橡胶树奠定了基础。Arokiaraj等[7]和Jayashree等[8]均以花药致密胚性愈伤组织为受体, 分别获得102株转人血清白蛋白基因(HSA)植株和3株转抗死皮的橡胶树超氧化物歧化酶基因(HbSOD)植株。Leclercq等[9]将另一抗死皮基因铜锌超氧化物歧化酶基因(CuZnSOD)转入橡胶树内珠被长期继代易碎胚性愈伤组织, 获得90个转化愈伤系, 其中13个高表达CuZnSOD基因。
刘志昕等[10]和赵辉等[11]分别以花药致密胚性愈伤组织和长期继代的花药易碎胚性愈伤组织为受体, 均获得PCR检测阳性胚状体, 但未再生转基因植株, 主要原因在于受体的体胚发生和转化胚状体再生能力低。本研究以花药致密胚性愈伤组织为农杆菌侵染受体, 研究影响遗传转化效率因素的同时, 探讨转化胚状体再生及增殖方式, 以期建立农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系。
1材料与方法
1.1植物材料
将橡胶树大规模推广品种热研7-33-97单核靠边期花药接种于胚性愈伤组织诱导培养基上, 培养30 d后用于农杆菌侵染。1.2 质粒
实验质粒为pCAMBIA2301, 其T-DNA区域含有CaMV 35S启动子及其调控的Npt II基因和带一段内含子的uid A基因(图1)。
1.3培养基
诱导愈伤培养基为MS培养基添加3.0 mmol L–1 CaCl2、7.0 μmol L–1 KT、8.1 μmol L–1 NAA、6.8 μmol L–1 2,4-D、204.5 mmol L–1蔗糖和2.2 g L–1 Phytagel; 分化培养基为MS培养基添加2.2 μmol L–1 6-BA、14.0 μmol L–1 KT、1.4 μmol L–1GA3、0.1 μmol L–1 NAA、3.8 μmol L–1 ABA、204.5 mmol L–1蔗糖和2.2
g L–1 Phytagel; 植株再生培养基为MS培养基添加
0.23 μmol L–1 KT、0.11 μmol L–1 IAA、8.7 μmol L–1 GA3和4.5 μmol L–1 2,4-D。
1.4侵染与转化
将愈伤组织在3个不同农杆菌菌株(EHA105、GV3101和LBA4404)悬浮液中侵染5 min后, 转入添加不同浓度(0、5、10、50、100、500 μmol L–1)乙酰丁香酮(AS)和10 mg L–1硝酸银共培养基(诱导愈伤培养基pH 5.2)上培养, 20~28℃暗培养1~9 d。每个处理3次重复。结果用SAS9.0进行统计分析。将共培养后的愈伤组织转移到添加10 mg L–1硝酸银和500 mg L–1特泯丁的愈伤诱导培养基上进行恢复培养, 25℃暗培养7~10 d。继而转入添加10 mg L–1硝酸银、50 mg L–1卡那霉素和500 mg L–1特泯丁的愈伤诱导培养基进行抗性愈伤筛选, 每20 d继代一次, 继代2次后将抗性愈伤组织转入添加500 mg L–1特泯丁和50 mg L–1卡那霉素的分化培养基上诱导体细胞胚胎发生。最后, 将体细胞胚转入添加50 mg L–1卡那霉素的植株再生培养基诱导植株再生。
1.5 GUS的瞬时表达及稳定表达
将共培养愈伤组织及抗性愈伤组织、胚状体和植株叶片放入X-Gluc染色液并抽真空5~10 min后, 置37℃培养箱中过夜培养。用体视显微镜观察GUS
图1质粒pCAMBIA2301 T-DNA区段示意图
Fig. 1 T-DNA structure of pCAMBIA2301 vector
LB: T-DNA左边界; RB: T-DNA右边界; 35S-t : 35S终止子; 35S-p: 35S启动子; Nos-t: Nos终止子; Npt II: 新霉素磷酸转移酶II基因;
uid A: β-葡糖醛酸酶基因。
LB: left border; RB: right border; 35S-t: 35S terminator; 35S-p: 35S promoter; Nos-t: nopaline synthase gene terminator; Npt II: neomycinphos-
photransferase II gene; uid A: β-glucuronidase gene.
第10期黄天带等: 根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立1693
表达情况, 对每个处理愈伤组织的蓝色斑点进行计数。X-Gluc染色液的组成为100 mmol L–1 NaH2PO4· 2H2O, 100 mmol L–1 Na2HPO4·12H2O, 10 mmol L–1 Na2EDTA, 1 mmol L–1K3[Fe(CN)6], 1 mmol L–1 K4[Fe(CN)6], 0.5%(V/V) TritonX-100, 20% (V/V)甲醇,
0.5 mg mL–1 X-Gluc。
1.6转化子PCR检测及产物序列分析
以抗性胚状体及GUS染色为阳性植株叶片DNA为模板, 利用Npt II和uid A基因特异引物, 进行PCR检测。提取DNA参照Varghese等[12]方法。Npt II特异扩增引物为5′-AAGCACGAGGAAGCGG TCAGC-3′和5′-TGGAGAGGACACGCTGAAATCA CC-3′, uid A特异扩增引物为5′-GGTGGGAAAGCG CGTTACAAG-3′和5′-GTTTACGCGTTGCTTCCGC CA-3′。Npt II、uid A引物预期扩增片段长度分别为812和1 203 bp。PCR程序为94℃预变性2 min, 1个循环; 94 40 s, 60 1 min, 72 1 min, 35
℃℃℃个循环;
72 10 min, 1
℃个循环; 4℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。利用ABI3730X对PCR检测为阳性拟转化子产物进行测序后, 通过Blastx进行序列比对分析。
1.7转化子Southern鉴定
按照DIG High Prime DNA Labeling and Detec-tion Starter Kit II (Roche, Germany)试剂盒, 以Eco R I 过夜消化PCR检测阳性植株的总DNA (20 μg)为模板, 以随机引物法标记Npt II基因为探针, 进行Southern杂交鉴定。
1.8转化植株移栽
将转基因植株直接移栽或通过两种方式增殖后移栽, 其一利用次生体胚发生对获得的转化体细胞胚进行增殖, 然后诱导体胚植株再生; 其二通过籽苗芽接, 将转基因植株顶芽或芽片嫁接到籽苗, 成活后进行移栽。参照Hua等[13]的次生体胚发生方法和黄守锋[14]的籽苗芽接法。
2 结果与分析
2.1不同处理对GUS瞬时表达的影响
农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间等对橡胶树花药愈伤组织的转化效率具有显著影响, EHA105菌株侵染力最强, GUS瞬时表达率为每个愈伤组织块5.07个蓝色斑点, 分别是GV3101和LBA4404菌株的11.8倍和72.4倍; 随共培养温度的升高和共培养时间的延长, 转化效率先升高再下降, 共培养温度22,
℃共培养6 d, 使GUS瞬时表达率最高, 每个愈伤组织块分别达到8.43个和19.10个蓝色斑点。共培养基中添加AS无助于橡胶树花药愈伤组织转化效率的提高, 随添加AS浓度的升高, 转化效率显著下降, 并且, 当添加AS浓度高于50 μmol L–1时, 愈伤组织生长开始受到抑制(表1)。
2.2转化植株的获得及其分子生物学鉴定
利用优化后转化体系, 即以EHA105为侵染菌株, 侵染5 min后, 转入未添加AS的共培养基22℃暗培养6 d, 转化2.2万个花药愈伤组织, 经2个周期抗性愈伤组织筛选和3个半月愈伤组织分化后, 共获得541个抗性胚状体。随机取13个抗性胚状体部分胚块进行PCR检测, 其中4个抗性胚状体检测到Npt II基因特异片段, PCR检测阳性率为30.78%。取其中一个PCR阳性胚状体进行GUS染色, 可看到整个胚状体被染成蓝色(图2-A)。
诱导540个胚状体再生植株, 共获得99株抗性植株(图2-D), 植株再生率为18.33%, 其中11株叶片GUS染色呈现蓝色(图2-B)且uid A基因与Npt II 基因均扩增出与阳性对照相同的PCR特异扩增片段(图3), PCR特异扩增片段序列与pCAMBIA2301 (gi:7638149)中Npt II和uid A基因序列相似率均为97%以上。随机挑取其中4株拟转化植株进行Southern 杂交, 结果3株植株具有明显杂交信号, 2株为单拷贝插入, 1株为三拷贝插入(图3), 另一单株杂交信号较弱。
2.3转化植株的繁殖及移栽
获得11株转基因植株后, 3株(1~3)未经增殖直接移栽到大田, 均未成活; 3株(4~6)通过籽苗芽接进行一轮室外嫁接繁殖(图2-E), 获得5株转基因单株(图2-G); 其余5株转基因植株在胚状体阶段通过橡胶树次生体胚发生进行繁殖研究(图2-C)。5个转基因胚状体(7~11)进行3次次生体胚发生增殖后诱导植株再生, 最终获得676株转基因单株, 增殖系数为135.20, 移栽成活248株(图2-F), 成活率为36.69%, 5个转基因胚状体来源的植株均移栽成活(表2)。
3 讨论
3.1农杆菌介导橡胶树遗传转化体系建立
农杆菌介导的遗传转化在水稻[15]、玉米[16-17]、番茄[18]等作物已经成为常规的转基因手段, 但是对一些重要的木本植物仍然比较困难。自20世纪90年代以来, 世界各主要植胶国家如马来西亚、印度及法国, 相继开展农杆菌介导的橡胶树遗传转化研
1694
作 物 学 报
第36卷
表1 不同处理对GUS 瞬时表达的影响
Table 1 Effects of different treatments on GUS transient expression 处理 Treatment
愈伤数(块) No. of calli 斑点数(个) No. of blue spots 斑点数(个)/愈伤 Blue spots per callus
EHA105 30 152 5.07 a GV3101 30 13 0.43 b 菌株 Strain
LBA4404 30 2 0.07 b
0 30 142 4.73 a 5 30 96 3.20 ab 10 30 65 2.17 abc 50 30 39 1.30 bc 100 30 12 0.40 bc 乙酰丁香酮
AS (μmol L –1)
500 30 0 0.00 c
20 30 148 4.93 ab 22 30 253 8.43 a 24 30 106 3.53 bc 26 30 160 5.33 ab 共培养温度
Culture temp. ()℃
28 30 9 0.30 c
1 30 3 0.10 c
2 30 0 0.00 c
3 30 16 0.53 c
4 30 22
5 7.50 bc 5 30 211 7.03 bc
6 30 573 19.10 a
7 30 316 10.53 b
8 30 164 5.47 bc 共培养时间
Culture time (d)
9 30 116 3.87 bc
数据后不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上差异显著(Duncan 法)。
The small letters followed the data in the last colume mean significantly different between the treatments at the 0.05 probability level (Duncan’s method).
图2 转基因胚状体、植株GUS 检测、植株再生及移栽
Fig. 2 GUS staining for transformed embryos and plantlets, plant regeneration and transplantation
A: 子叶形胚GUS 染色(右边为对照); B: 转基因植株叶片GUS 染色(右边为对照); C: 转基因胚状体次生体胚发生; D: 转基因再生植株; E: 籽苗芽接法嫁接转化植株; F: 直接移栽转化植株; G: 嫁接成活转化植株。
A: GUS staining for cotyledonary embryo (right is control); B: GUS staining for leaf of transformed plantlet (right is control); C: transformed embryo secondary embryogenesis; D: regenerated Hevea ; E: budded transgenic Hevea by mini-seedling budding; F: transgenic Hevea in soil;
G: growing budded transgenic Hevea .
第10期
黄天带等: 根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立 1695
图3 转基因植株分子检测
Fig. 3 Molecular detection of transgenic plantlets
左: uid A 基因PCR 特异扩增; 中: Npt II 基因PCR 特异扩增; 右: Npt II 基因Southern 检测; M: marker; +: 阳性对照, 质粒
pCAMBIA2301; –: 阴性对照, 非转化植株; 0: 空白对照, 水; 1~11: 转基因单株。
Left: PCR analysis of uid A gene; middle: PCR analysis of Npt II gene; right: Southern analysis of Npt II gene; M: marker; +: positive control,
pCAMBIA2301; –: negative control, untransformed plantlet; 0: blank control, water; 1–11: transgenic plantlets.
表2 转基因植株的增殖及移栽结果
Table 2 Results of multiplication and transplantation for transgenic Hevea
株号 No. 增殖方式
Multiplication methods
增殖前株数 No. prior to multiplication
增殖后株数 No. after multiplication
增殖系数 Multiplication
index
移栽成活株数 Survived No.
移栽成活率 Survived frequency (%)
1–3
未增殖
Non-multiplication
3 3 1 0 0
4 1 2 2 2 100.00
5 1 1 1 1 100.00 6
籽苗芽接
Mini-seedling budding 1 2 2 2 100.00
7 1 272 272 27 9.93 8 1 178 178 110 61.80
9 1 18 18 6 33.33 10 1 199 199 103 51.76
11 次生体胚发生
Secondary embryogenesis
1 9 9
2 22.22
总计Total
11 684 45.9 253 36.99
究, 先后建立农杆菌介导的遗传转化体系, 并利用其转化体系获得功能基因转化植株[2-9,19-21]。我国橡胶树遗传转化研究起步相对较晚, 刘志昕等[10]、赵辉等[11]、王颖等[22]和洪磊等[23]对橡胶树遗传转化方法及其影响因素进行研究, 获得了PCR 检测阳性胚状体, 但未见Southern 检测、转化再生植株及转化效率报道。本研究获得11株GUS 表达、PCR 扩增和PCR 产物测序检测阳性植株, 随机选取4株进行Southern 检测, 结果3株为阳性植株。
3.2 转化胚状体次生体胚发生是获得转化植株的有效途径
刘志昕等[10]、赵辉等[11]和王颖等[22]获得PCR 检测阳性胚状体, 但均未获得转化植株, 特别是赵辉等[11]以长期继代的花药易碎胚性愈伤组织为受体, 胚状体诱导率达到30%, 但是绝大部分为畸形胚, 无法再生植株。Arokiaraj 等[2]以GV2260为侵染菌株获得65个抗性胚状体, 但仅再生3株植株, 以LBA4404为侵染菌株获得38个抗性胚状体, 未获再生植株。虽然Blanc 等[24]利用长期继代的易碎胚性愈伤组织高效增殖特点, 增殖转化愈伤组织后再诱
导体胚发生, 成功获得来自6个愈伤系的374株转基因植株, 但是, 长期继代的胚性愈伤组织再生植株产量低、长势差、易感病[24], 无法实现通过转基因改良橡胶树目的。转化胚状体畸形胚比例高、生活力弱, 无法直接再生植株是橡胶树遗传转化重要技术瓶颈。
橡胶树次生体胚发生是以胚状体为外植体, 通过循环体胚发生, 实现胚到胚的循环增殖, 最终实现体胚植株增殖的方法, 异常胚状体和成熟子叶期胚状体均能诱导次生体胚发生和产生成熟子叶期胚状体[13]。本研究中抗性胚状体PCR 检测阳性率高达30.78%, 但是抗性胚状体植株再生频率仅为18.33%, 而且, 利用次生体胚发生成功获得5个株系676株转基因单株。因此, 利用次生体胚发生将抗性胚状体增殖后, 再诱导抗性胚状体植株再生和转基因检测, 不但能降低胚状体无法再生而造成转化胚状体丢失的风险, 而且可进一步提高遗传转化效率, 在理论上, 本研究建立遗传转化体系的转化效率, 将由0.05%(11/22000)提高到0.75%(540×30.78%/22000), 这还需在后续研究中验证。
1696作物学报第36卷
由于转基因植株成活频率低丢失大量转化子是橡胶树遗传转化另一难题, Arokiaraj等[7]移栽73株只成活16株; 本试验直接移栽3株, 均未成活。为此, Arokiaraj等[3]直接将转基因植株作为芽条嫁接于室外实生砧木上, 但是, 这种途径不能从根本上解决转化子的丢失问题, 因为无法确保转化胚状体全部再生植株; Blanc等[6]增殖长期继代转化愈伤后再生植株, 高效获得6个株系374株转基因橡胶树, 但是, 这类受体再生植株农艺性状差[24], 与通过转基因改良橡胶树目的相悖。本研究通过次生体胚发生成功获得5个株系676株转基因单株, 移栽成活248株, 每一个转化子均有转化植株移栽成活且室内依然保存转化胚状体。转化胚状体次生体胚发生是从胚状体阶段进行转化胚状体的增殖, 大大提高了转化胚状体进入植株再生阶段的比例, 而且, 由于转化胚状体的增殖, 致使再生植株数量也相应增加, 因此, 转化胚状体次生体胚发生是获得足够转化植株, 实现安全移栽的有效途径。
4 结论
以EHA105为侵染菌株, 侵染5 min后, 转入未添加AS的共培养基, 22℃暗培养6 d, 成功建立了根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系, 并证明转化胚状体次生体胚发生是获得转化植株的有效途径。
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科学出版社生物分社新书推介
《生物序列分析》（生物信息学数据分析丛书）
〔英〕R. Durbin S. Eddy A. Krogh G. Mitchison 编著
王俊郭一然单杲主译
978-7-03-028443-3 ￥60.00 2010年8月出版
本书在结构上大致可以分为四个部分，每个部分所覆盖的问题分别是：
二序列联配、多序列联配、系统发育树和RNA结构。具体分为：二序列联
配、Markov链与隐马模型、使用HMM的二序列联配、用于序列家族的列
型HMM、多序列联配方法、构造系统发育树和系统发育的概率论方法。本
书介绍的列型HMM、多序列联配方法、构造系统发育树和系统发育的概率
论方法。本书介绍的一些方法将不同的生物信息来源整合到一般的、清晰且
可操作的序列分析概率论模型中，有助于研究者深入了解生物序列分析的基
础。本书可供生物信息学、分子生物学、数学、计算机科学以及物理学专业
的研究生或高年级本科生及这些领域的老师和研究人员参考。
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