突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病
毒载体的构建
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的: 构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法: 首先利用RT PCR 方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA; 然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA 上产生2个突变位点, 使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点, 该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS M2; 最后将INS M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上, 并与骨架载体共转染至细菌内, 通过细菌内同源重组得到重组载体。结果: Hind Ⅲ和Xho I 酶切、 Pac I酶切及测序均证实载体pAd INSM2构建成功。结论: 构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd INS M2为进一步转染非胰岛β细胞, 对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。
【关键词】胰岛素原腺病毒载体/pAdEasy 1 弗林蛋白酶糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病, 胰岛素是治疗糖尿病的主要药物, 但由于随时需要注射胰岛素, 给患者带来了极大的不便, 对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子
生物学领域取得的迅猛发展, 特别是重组DNA 技术的建立［1］, 我们通过重叠延伸PCR技术对胰岛素原基因进行2个位点的突变, 将人胰岛素原基因cDNA 上B C链连接处的碱基序列Lys Thr Arg Arg 及C A链连接处的Leu Gln Lys Arg分别突变为Arg Thr Lys Arg及Arg Gln Lys Arg序列, 以使其可以被弗林蛋白酶识别［2］。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中, 使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一, 并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛β细胞, 使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料
PCR产物胶回收试剂盒、限制性内切酶Hind Ⅲ、 Xho I、Probest DNA聚合酶、 Simple T Vector、 DNA marker均购于大连宝生物公司; T4 DNA 连接酶、 M MLV逆转录酶购于Invitrogen公司; 限制性内切酶Pme I、 Pac I购于NEB公司; 质粒DNA 抽提试剂盒购于
赛百盛; 引物由上海生物工程有限公司合成; pAdEasy1载体系统、 DH5α菌株、 BJ5183菌均由血研所中法实验室保存。
1．2 方法
1．2．1 引物设计
根据GenBank发表的人胰岛素原基因cDNA序列, 综合利用Primer5和Oligo6引物设计软件设计人胰岛素原基因全长的引物, INS1: 5′GCT CTC GAG GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT3′; INS2:
5′GAG AAG CTT GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT3′, 划线部分为酶切位点（Xho I 和Hind III）。再根据PCR定点突变原理, 分别在人胰岛素原基因B C链及C A链连接处进行2次突变, 突变引物设计如下: INS3: 5′TTC TTC TAC ACA CCC CGG ACC CGC3′; INS4: 5′GCG GGT CCG GGG TGT GTA GAA GAA3′; INS5: 5′GTC CCG GCA GAA GCG TGG CAT TGT3′; INS6: 5′ACA ATG CCA CGC TTC TGC CGG GAC3′; 斜粗体划线部分为突变的位点。
1．2．2 野生型人胰岛素原基因的获得
取胎龄5个月的经水囊引产的健康胎儿胰腺组织, 液氮中冷冻过后用DEPC处理过的研钵研磨, 然后加入TRIzol抽提总RNA, 以提取的总RNA经逆转录后合成的cDNA为模板, 以引物INS1和INS2进行PCR反应。反应条件: 94℃, 预变性5 min; 变性、退火及延伸条件分别是94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共进行30次循环; 最后72℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将PCR 产物克隆至T载体上进行筛选、扩增及鉴定, 并送测序公司测序。
1．2．3 突变型人胰岛素原基因的获得
采用重叠延伸PCR 法, 使人胰岛素原基因产生两处突变。以获得的野生型人胰岛素原基因为模板, 首先进行B链/C肽连接处的突变。用引物INS1、 INS4和引物INS3、 INS2分别扩增出两段PCR产物, 利用引物INS3和INS4的互补部分使这两段PCR产物互为模板和引物, 在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因, 然后再
加入引物INS1和INS2继续扩增含有第一个突变的人胰岛素原基因（命名为INS M1）, 将扩增产物连接到T载体中, 并送测序公司测序鉴定。第二处突变在C肽与A链的连接处。以经测序第一处突变改造成功的人胰岛素原基因为模板, 用引物INS1、 INS6和引物INS5、INS2经过以上同样的方法诱导产生含有第二个突变的人胰岛素原基因（命名为INS
M2）, 将扩增产物连接到T载体中送测序公司测序鉴定。
1．2．4 穿梭腺病毒载体的构建
将腺病毒穿梭质粒pAdtrack CMV和突变型人胰岛素原基因（INS M2）分别用Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切, 纯化
、回收双酶切产物进行连接, 连接反应条件为INS M2双酶切产物5 μL、 pAdtrack CMV双酶切产物3 μL、 Buffer 1 μL、 T4 DNA连接酶1 μL, 16℃ 16 h, 连接产物命名为pAdtrack INS M2, 转化DH5α感受态细胞, 铺板、挑菌、摇菌、提取质粒, Hind Ⅲ、Xho
Ⅰ酶切鉴定。
1．2．5 重组腺病毒载体的构建
先把BJ5183细菌用氯化钙法制备成感受态, 将腺病毒骨架质粒pAdEasy1转化到BJ5183感受态细胞中, 铺板
、挑菌、摇菌后再用同样的方法制备成感受态细胞。然后pAdtrack INS M2被限制性内切酶PmeⅠ线性化, 再经碱性磷酸酶CIAP处理后, 转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感
受态细胞中去同源重组。经过铺板、挑菌、摇菌、提取质粒等步骤获得重组质粒pAd INS M2。经Hind Ⅲ、 XhoⅠ和PacⅠ酶切鉴定。
2 结果
2．1 野生型人胰岛素原基因的扩增
利用设计的人INS的特异性引物, 以正常流产胎儿胰腺组织总RNA为模板, 采用RT PCR的方法, 扩增出人
INS全长的cDNA片段, 片段大小与预期结果一致（图1）。
2．2 人胰岛素原基因的定点突变
采用重叠延伸PCR 法, 以获得的野生型人胰岛素原基因为模板, 用引物INS1、 INS2、 INS3、 INS4扩增得
到2个PCR产物（PCR1和PCR2）, 将两段PCR产物连接, 使其在B链/C肽连接处产生2个碱基的突变, 得到INS M1（图2）。将其连接到T载体上并转化到DH5α中, 经测序鉴定位点突变成功。再以INS M1为模板, 用引物INS1、 INS2、 INS5、 INS6扩增得到另两段PCR产物（PCR3和PCR4）,同样将两段PCR产物连接, 使其又在C肽/A链连接处产生一个碱基的突变, 得到INS M2（图2）。将其连接到T载体上并转化到DH5α中, 经测序鉴定位点突变成功。
2．3 穿梭腺病毒载体的构建
胶回收Hind Ⅲ/XhoⅠ双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack CMV 和含突变型人胰岛素原基因的T载体（INS M2T）, 连接后产物命
人胰岛素的制备
一、获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex 与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素 利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。
电泳分析，同位素活性测定。 （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA 链。 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸 ?前端引物： ?5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ ?后端引物： ?5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 二、组建重组质粒 采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程 pQE--30用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 (一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链同时表达法 将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A 链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA 的转化 1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
大肠杆菌生产制备重组 人胰岛素工艺 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
1.提取: 2.既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将从原DNA中分离. 3.2.提取质粒: 4.使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 5.3.基因重组: 6.取出与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 7.4.将质粒送回大肠杆菌: 8.再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将吸收. 9.5.胰岛素的产生: 10.再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。 2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在L时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。
北京邮电大学世纪学院 毕业设计(论文) 题目通化东宝公司甘舒霖基因重组人胰 岛素产品营销策略研究 2012年 5月 30日
北京邮电大学世纪学院毕业设计（论文）任务书 姓名学号08070620 专业市场营销系（院）经济管理系设计（论文）题目通化东宝公司甘舒霖基因重组人胰岛素产品营销策略研究 题目分类□工程设计；□工程技术研究；□软件工程（如CAI课题等）；?专题研究；□艺术设计；□其他 题目来源□自然科学基金与部、省、市级以上科研课题；□企、事业单位委托课题；□院级课题；?自拟课题□其他 指导教师（指导教师组 组长及成员姓名） 职称工作单位备注 讲师对外经济贸易大学指导教师/成员 副教授北京邮电大学世纪学院组长 助教北京邮电大学世纪学院成员 讲师北京邮电大学世纪学院成员 副教授对外经济贸易大学成员 毕业设计(论文)的内容和要求： 毕业论文的内容： 1．通过文献研究对相关理论进行综述； 2．对通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品进行现状和行业环境分析； 3．了解通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品流程和盈利模式； 4．在调查的基础上得出通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品经营模式上和策略上的变化，研究其经营模式创新； 5．调查客户对通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品的态度和建议； 6．分析其运营流程和盈利模式中存在的问题及解决方案； 7．提出其对通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品的借鉴意义及未来发展趋势； 8．给出优化建议，为其通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品发展提供借鉴。 毕业论文的要求： 1．原始数据：大量阅读相关文献，搜集相关数据，论文相关数据的获得可以通过问卷调查、实地调查、文献参阅、年鉴查阅等方法获得，要求要有一手的数据。 2．基本方法：在该选题研究过程中，学生必须掌握和运用好市场营销学、服务营销学等学科的基本理论。并且重点结合营销学的专业知识，对通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素产品的创新进行深刻的研究与分析。 本选题研究中可采用文献分析法、定性调研、问卷调查法，网络调查法、访谈法等方法。 具体而言，文献分析法是主要针对国内外胰岛素环境分析、国内外胰岛素营销现状等方面内容，寻找相关文献，进行分类整理和研究。 定性调研是用来在确定问题的哪几个属性最重要，再进行网络调查或问卷调查，确定这些属性的程度，从调研获得的数据。（如：a、通化东宝经营现状：销售情况、人员情况、场地情况，消费者反馈情况等。b、通化东宝胰岛素销售情况等。c、市场细分调查。d、顾客满意度调查。）
生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略 I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法：
2017/2/21 第三章载体 第一节基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR ?首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性 内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟 枪法”或“散弹枪”实验法。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体λ的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体 M13（5）病毒?面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先 用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用
1.提取目的基因: 既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
简介 胰岛素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的特效药物 ，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相关资料表明：糖尿病已成为继 心血管疾病、肿瘤之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康，全球共有糖尿病患者 1.75亿人，中国糖尿病患 者9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药物的开发和生产具有重大的社会效益和经济 效益。 人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉和肝脏内，并抑制糖原异生。 胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。
主要成份 活性成份：人胰岛素 非活性成份：甘油、间–甲酚 其结构式： 分子式：C257H338N65O77S6 分子量：5807.69 生产企业 中国通化东宝、丹麦诺和诺德、美国礼来 目前，国际上生产医用重组人胰岛素的（recombinant human insulin,rhI）方法主要有三种： 1)用基因工程大肠杆菌(E.coli)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hI)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2)用基因工程 E.coli发酵生产人胰岛素原(human pminsulin，hPI)，后经加工形成hI。E.coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI；
1.提取目的基因: 既从人的DNA 中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA 质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+ 的物质,如CaCl2 ,这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。
一、基础知识 活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。 2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1 分析： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L 时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L 可使DNA析出。【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
人胰岛素的制备 供单询胞 外通DNA 如"r DNA 歸& J- |转化与扩增
基因匚程基生廉程示意3! 一、 获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA 以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成 胰岛素口只“肛补DNA 再以cDNA 第一链为模板，在反转录酶或 DNA 聚合酶I 的 作用在，最终合成编码它的双链 DNA 序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 （一）从人体细胞内提取胰岛素基因转录的 mRNA 1, 细胞总RNA 勺提取： 取胰岛B 细胞，用PBS 洗后，加入TRIZOL 试将细胞破裂，后用DEPC 处理， 多次离心后，取RNA 白色沉淀，测OD 值，电泳。 2，从总RNA 中分离 mRNA 取上述提取的总 RNA 若干，加入 Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打 匀。70 C 水浴（裂解RNA 的二级结构），20-30 C 条件下，静置（让 Oligotex 与mRN 结合）。将Oligotex/mRNA 复合物的沉淀加到 EP 管SPIN 柱上高速离心， 加Buffer 将其他RNA 洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRN A （二） mRNA 专录合成cDNA 第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNAS 适当引物于EP 管中，加入RNase-free water ，混 匀 后,70 °C 反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上 5min;稍微离心 一下，顺序加入缓冲液、RNA 酶抑制剂、反转录酶、dNTP （加入放射性同位素 利于检验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42 C 放置2分钟。取出置于冰上。 电泳分析，同位素活性测定。 宣组转化干 J 鉴定与表达 工彊蔚或堀胞 J 工程繭或细睫帚养 05.扈追产物井韶吨化 annncon O
利用重组酵母菌生产人胰岛素 摘要利用套叠PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切位点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZα-A的α-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZα-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。SDS2PAGE和Native2PAGE的分析表明：蛋白在分泌表达过程中，加入Insulin的A链（2.4k）和B链（3.4k）之间的Kex2酶切位点发挥了作用，Kex2蛋白酶将A链和B链切开，在α-factor信号肽的作用下通过分泌途径将A链和B链分泌到胞外，同时A链和B链又以二硫键形成了高级结构。WesternBlot结果表明：重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应，具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。 关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集 Abstract：Use nested PCR synthesis of recombinant human insulin gene, join Kex2 cleavage sites between the A and B chains. The synthetic recombinant human insulin gene in the correct reading frame was inserted into the constitutive secretory expression vector pGAPZα-A α-factor signal peptide sequence Preparation the construct pGAPZα-A/Insulin recombinant secretory expression vector. The expression vector linearization Bln I treated electroporation competent cells of Pichia pastoris GS115 constructed expression of secretory Insulin engineered bacteria.The analysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that: the protein in the process of secretion expression added Insulin A chain (2.4k) and Kex2 cleavage sites between the B-chain (3.4k) played a role, Kex2 protease of the A and B chains cut through the secretory pathway in the role of the α-factor signal peptide of the a and B chains secreted into the extracellular domain, while the a-chain and B-chain disulfide bond formation Youyi advanced structure. WesternBlot: The results show that the recombinant protein was able to specifically react with mouse anti-human Insulin Antibodies
胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020
生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh —PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 （2）煮沸法
1. 提取目的基因: 既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离?2. 提取质粒： 使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状DNA. 3. 基因重组： 取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 4?将质粒送回大肠杆菌： 再大肠杆菌的培养液中加入含有 Ca+的物质，如CaCI2，这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5?胰岛素的产生： 再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质?通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素！ 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA E提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54 “基础知识”，讨论并回答下列问题: 1. （记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2. （记忆）DNA勺溶解性特点： DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5- 1分析： DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度有何特点？在 O.14mol/L时溶解度最小；要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么浓度？ O.14mol/L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将 DNA和蛋白质进一步分离目的。 3. （记忆）DNA勺耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解 DNA在60?80C时蛋白质变性沉淀而 DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4. （记忆）DNA勺鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是 DNA寸,需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定 在沸水浴条件下，该试剂与 DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计 【活动2】阅读教材P55 “实验设计”，讨论并回答下列问题：
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎ 实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 ※ 基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化— 涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
胰岛素能降低人体血糖的含量。糖尿病患者是由于胰腺的β细胞不能分泌胰岛素，使患者血糖过高，继而带来吃得多、 喝得多、尿得多、体重减少(即三多一少)的一系列临床症状。糖尿病的死亡率仅次于心脏病和癌症。 19世纪以前，糖尿病像妖魔一样肆意夺走人们的生命，那时糖尿病患者的平均生存时间仅4．9年，面对这旷日持久的大浩劫，人类一筹莫展。1921年，加拿大医生班廷(Banding) 取两条狗的胰脏，将之搅碎过滤，并收集少量液体注射到一只已经出现糖尿病昏迷的小狗身上，奇迹发生了，昏迷的小狗血糖开始下降，当液体注射完毕，世界上第一只从糖尿病昏迷状态下苏醒过来的小狗就站起来跑开了。从狗胰脏收集的“神奇”液体，就是我们现在使用的胰岛素。1922年1月班廷第一次使用从牛胰脏中提取的胰岛素，对一个患糖尿病2年，已被医生放弃的男孩进行治疗，结果“药到病除”。全世界为这个划时代的医学成果而欢呼!班廷也由此荣获1923年诺贝尔生理学和医学奖。 胰岛素治疗糖尿病至今仍然是临床上最有效的方法。过去，胰岛素主要靠从猪等大家畜胰腺中提取。从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。 图7-1 胰岛素生成图大肠杆菌说：给我一个基因，我将源源不断给你药物” 基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素(图7．1)。实际上这种大肠杆菌是经过改造已经带上新的遗传性状的细菌，称为基因工程菌。 1978年美国的吉尔伯特研究组用此方法成功地生产了鼠胰岛素，随后依塔库拉研究组用相同方法生产出了人的胰岛素。1981年基因重组人胰岛素产品正式投入市场，大肠杆菌成了名副其实的生产胰岛素的“活工厂”，胰岛素供不应求的问题彻底解决了。基因重组人胰岛素的生产为制药工厂开辟了新天地，开创了制药工业的新时代。 有了好药，电子工业又开发出精巧灵敏的血糖自我检测器，患者可随时用指尖血测得血糖值，再由医生指导用降血糖药物进行预防性治疗，使糖尿病的控制有了革命性的大变化。更进一步的产品，如“免刺手指血糖检测器”、“免打针胰岛素(口吸喷雾器)”很快也会上市。但是科学家最大的期望，是用基因疗法来根治糖尿病。 现在科学家们正在进一步设想，将胰岛素基因通过一定的手段移植到糖尿病患者体内的有关细胞里，让新移入的基因来指挥细胞生产机体所需要的胰岛素。据报道，