中国组织工程研究 第17卷 第53期 2013–12–31出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53
doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.014 [https://www.doczj.com/doc/044529813.html,]
付元，刘秀琴，程娜，张守青，常红，张秋业，陈秀霞，高兴娟. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll 样受体3和4的信号转导途径[J]. 中国组织工程研究，2013，17(53):9182-9188.
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
9182
www.CRTER .org
付元★，女，1987年生，山东省曲阜市人，青岛大学医学院在读硕士，主要从事肾脏疾病与免疫疾病的研究。
fy_v2011@https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
通讯作者：常红，副主任医师，硕士生导师，青岛大学医学院附属医院儿内科，山东省青岛市 266003
changhong1970@ https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)53-09182-07
修回日期：2013-10-17 (201308011/W 〃W)
Fu Yuan ★, Studying for master’s degree, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China fy_v2011@https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
Corresponding author: Chang Hong, Associate chief
physician, Master’s supervisor, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
changhong1970@https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
Accepted: 2013-10-17
紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll 样受体3和4的信号转导途径*★
付 元1，刘秀琴2，程 娜1，张守青1，常 红1，张秋业1，陈秀霞1，高兴娟3 (1青岛大学医学院附属医院儿内科，山东省青岛市 266003；
2
青岛市市立医院儿内科，山东省青岛市 266003；3烟台市毓璜顶医院儿内科，山东省烟台市 264000)
文章亮点：
1 文章的特点在于应用荧光定量PCR 和流式细胞技术检查了TLR3和TLR4在外周血单个核细胞的表达量及相关性，分析了过敏性紫癜患儿有肾脏损伤和无肾脏损伤的免疫紊乱情况。
2 结果提示Toll 样受体4活化可能是导致过敏性紫癜免疫功能紊乱的始动因素之一，Toll 样受体4的过度活化与过敏性紫癜的肾脏损伤有关。 关键词：
器官移植；器官移植基础实验；过敏性紫癜；紫癜性肾炎；单个核细胞；Toll 样受体3；Toll 样受体4；髓样细胞分化因子88；髓样分化蛋白2；白细胞介素类；省级基金 主题词：
紫癜，过敏性；Toll 样受体3；Toll 样受体4；白细胞介素类 基金资助：
山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011SW006)*
摘要
背景：目前关于Toll 样受体3和Toll 样受体4介导的信号转导通路在紫癜性肾炎的发病机制中的作用尚不清楚。
目的：分析Toll 样受体3和Toll 样受体4在过敏性紫癜和紫癜性肾炎发病机制中的作用。
方法：选取过敏性紫癜患儿64例，分为过敏性紫癜无肾损害组36例及过敏性紫癜性肾炎组28例，另选健康儿童30例作为正常对照组。实时荧光定量PCR 检测外周血单核细胞Toll 样受体3、Toll 样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素12 mRNA 的基因相对表达量；应用流式细胞术检测外周血单核细胞Toll 样受体3、Toll 样受体4蛋白表达率。
结果与结论：①过敏性紫癜患儿Toll 样受体4 mRNA 及蛋白表达显著高于正常对照组(P < 0.05)。紫癜性肾炎组Toll 样受体4 mRNA 及蛋白表达均显著高于紫癜无肾损害组(P < 0.05)。②过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 的表达均显著高于正常对照组(P < 0.05)，白细胞介素12 mRNA 的表达显著低于正常对照组(P < 0.05)；紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 的表达显著高于紫癜无肾损害组(P < 0.05)，紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA 的表达显著低于紫癜无肾损害组(P < 0.05)。③过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll 样受体4 mRNA 与蛋白表达呈正相关(r =0.60，P < 0.01)；过敏性紫癜患儿Toll 样受体4 mRNA 与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6表达均呈正相关(P < 0.01)，与白细胞介素12 mRNA 表达呈负相关(r =-0.66，P < 0.01)。提示Toll 样受体4可能通过髓样细胞分化因子88依赖信号转导途径介导过敏性紫癜的免疫发病机制，Toll 样受体4的过度活化可能与过敏性紫癜的肾损伤有关。
Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathways in the peripheral blood mononuclear cells of purpura nephritis patients
Fu Yuan 1
, Liu Xiu-qin 2
, Cheng Na 1
, Zhang Shou-qing 1
, Chang Hong 1
, Zhang Qiu-ye 1
, Chen Xiu-xia 1
, Gao Xing-juan 3 (1Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 2Departemt of Pediatrics, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 3Department of Pediatrics, Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 may be play a significant role in the pathogenesy of many diseases about the renal, but, at present, the influence of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathway in children with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis has been unknown.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 in Henoch-Sch?nlein purpura and Henoch-Sch?nlein purpura nephritis.
METHODS: Totally 64 children with a clinical diagnosis of Henoch-Sch?nlein purpura were enrolled in the study
and divided into two groups, 36 children with non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, and 28 children with
Henoch-Sch?nlein purpura nephritis. Another 30 healthy age-matched children served as controls. The relative expression levels of Toll-like receptor 3, Toll-like receptor 4, myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-12 mRNA in peripheral blood mononuclear cells were detected by real-time fluorescent PCR. Protein levels of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 were detected by flow cytometric analysis. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the relative expression levels of Toll-like receptor 4 mRNA and protein were remarkably increased in children with Henoch-Sch?nlein purpura (P < 0.05); compared with the children with non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, the relative expression levels of Toll-like receptor 4 mRNA and protein were remarkably increased in children with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis (P < 0.05). (2) Compared with the control group, mRNA expression levels of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β, and interleukin-6 were remarkably increased in children with Henoch-Sch?nlein purpura (P < 0.05), while interleukin 12 mRNA expression level was remarkably decreased (P < 0.05). Compared with the children with
non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, the mRNA expression levels of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β, and interleukin-6 were remarkably increased in children with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis (P < 0.05), while the mRNA expression of interleukin 12 was remarkably decreased (P < 0.05). (3) The mRNA expression of Toll-like receptor 4 showed a positive correlation with expressions of Toll-like receptor 4 protein (r=0.60, P < 0.01), myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β, and interleukin-6 mRNA (P < 0.01), but negative with interleukin-12 mRNA (r=-0.66, P < 0.01). These findings indicate that Toll-like receptor 4 activation may be involved in the pathogenesis of Henoch-Sch?nlein purpura and the excessive activation of Toll-like receptor 4 may be associated with the damage of kidney in the Henoch-Sch?nlein purpura.
Subject headings: purpura, Schoenlein-Henoch; Toll-like receptor 3; Toll-like receptor 4; interleukins
Funding: the Research Award Fund for Outstanding Young Scientists in Shandong Province, No. BS2011SW006*
Fu Y, Liu XQ, Cheng N, Zhang SQ, Chang H, Zhang QY, Chen XX, Gao XJ. Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 4 signal transduction pathways in the peripheral blood mononuclear cells of purpura nephritis patients. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9182-9188.
0 引言Introduction
过敏性紫癜是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病，合并肾脏受累时称为紫癜性肾炎，肾脏受累的严重程度往往直接影响到本病的病程和预后[1]。迄今其病因及发病机制尚未完全阐明[2-3]。目前认为，感染为主要的发病诱因，发病机制主要为免疫功能紊乱。
Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是近年来发现的一类模式识别受体，通过识别病原相关分子，激活天然免疫，最终产生一系列炎症细胞因子释放和启动适应性免疫应答[4]。研究显示TLRs信号通路介导多种感染性和非感染性肾脏疾病[5]，如尿路感染、脓毒症引起肾衰竭、病毒性相关性肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等。而有关TLRs与紫癜性肾炎发病机制关系的研究尚未见报道。文章通过检测Toll样受体3、Toll样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素12 在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞的表达，探讨Toll样受体3和Toll样受体4信号转导途径在紫癜性肾炎免疫发病机制中的可能作用。
1对象和方法Subjects and methods
设计：病例-对照研究。
时间及地点：于2011年10月至2012年11月在青岛大学医学院附属医院儿研所和中心实验室完成。
对象：选取2011年11月至2012年11月在本院收治的过敏性紫癜急性发作期患儿64例作为研究对象，其中男38例，女26例；年龄在3-14岁之间，平均年龄为6.9岁。根据2000年中华医学会儿科学分会肾脏病学组紫癜性肾炎的诊治循证指南[6]，分为过敏性紫癜无肾损害组及过敏性紫癜有肾损害组。其中紫癜性肾炎组28例，紫癜无肾损害组36例。
另选取本院儿保科健康体检儿童30例作为正常对照组，其中男17名，女13名，年龄4-12岁。平均年龄为6.4岁。所有检查均获得受试者家属知情同意后实施，并报医院医学伦理会讨论通过。
诊断标准：根据2006年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准进行诊断[7]。
纳入标准：①均符合2006年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准。②年龄≤14岁。③首次发病。④近4周内未使用任何糖皮质激素、免疫抑制剂或肝素等药物。
排除标准：反复发作的过敏性紫癜、血小板减少性紫癜、白血病、血友病。
Toll样受体3和Toll样受体4信号转导途径在紫癜性肾炎发病机制中的作用实验所用材料：
试剂来源
淋巴细胞分离液
SYBGreen试剂盒
ABI7000型荧光定量PCR仪
引物
Solarbio公司
大连宝生物有限公司
Applied Biosystems公司
由上海生工生物工程股份有限公司合成
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH9183
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方法：
分离外周血单个核细胞：无菌采取肝素钠抗凝静脉血
3 mL ，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。
cDNA 的合成：
外周血单个核细胞总RNA 的提取：取已分离的外周血单个核细胞，加入RNAisoPlus 裂解后，先后加入氯仿、异丙醇、体积分数75%的乙醇低温离心后获得总RNA ，应用核酸定量分析仪测量总RNA 的浓度和纯度，所有标本的A 260/A 280比值是在1.8-2.0之间。
反转录-聚合酶链反应：在50 μL 的反转录反应体系中，以2.5 μg mRNA 为模板逆转cDNA 。取1 μL 的cDNA 为模板，进行PCR 扩增，目的基因mRNA 序列相关引物的参数见表1。
反转录-聚合酶链反应产物鉴定：取Toll 样受体3、
Toll 样受体4、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素12及GAPDH 扩增产物3 μL 在2%琼脂糖凝胶中，120 V 电泳30 min ，经紫外线图像成像系统(DU640型)观察，并用凝胶成像仪进行拍摄；以验证引物的特异性及获得引物的最适退火温度。
实时荧光定量PCR(real-timePCR)：采用SYBGreen 试剂盒，使用ABI7000型荧光定量PCR 仪检测，应用Rotor gene 6软件进行荧光信号的收集和结果分析。荧光定量PCR 的数据采用2-△△ct
法进行相对定量，
具体计算方法参考文献[8]。
流式细胞术：采集肝素抗凝的新鲜的外周静脉血 2 mL ，取100 μL 加入10 μL 抗体组合为CD14-FITC/ Toll 样受体3(Toll 样受体4)-PE 的流式试管中。对照组取 100 μL 标本加入到10 μL 抗体组合为CD14-FITC/ IgG2a-PE 的流式试管中。混匀，室温避光孵育15 min 。加入溶血素3 mL ，混匀后静置15 min 。2 000 r/min 离心
5 min ，倒去上清，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，2 000 r/min 离心5 min ，倒去上清液，加入500 μL 的PBS ，放入Cytomics FC500型流式细胞检测，测定10 000个外周血单核细胞中抗人CDl4-FITC 抗体和抗人Toll 样受体3/Toll 样受体4-PE 抗体染色双阳性细胞百分率。流式细胞术的数据经CXP 分析软件获取分析。
主要观察指标：①Toll 样受体3和Toll 样受体4蛋白在外周血单个核细胞膜表面的表达。②Toll 样受体3和Toll 样受体4信号转导通路的相关分子在外周血单个核细胞细胞膜表面的表达。③Toll 样受体3和Toll 样受体4活化后基因表达的量。
统计学分析：所有数据处理均采用SPSS 17.0软件包进行分析，检测结果以x _
±s 表示；两组独立样本经方差齐性检验后，方差齐性，采用t 检验；多组样本均数比较采用单因素方差分析；相关分析采用Pearson 分析，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 参与者数量分析 纳入患儿64例，正常儿童30例，按意向性处理分析，全部进入结果分析。
2.2 过敏性紫癜组与正常对照组基线资料分析 见表2。
表2 过敏性紫癜组与正常对照组基线资料分析 Table 2 Baseline data of participants
注：两组儿童性别、年龄比较，差异无显著性意义，有可比性。
组别 n 性别(男/女) 年龄(岁) 过敏性紫癜组
正常对照组 64 30
38/26 17/13
3-14 4-12
表1 RT-PCR 荧光实时定量PCR 引物序列 Table 1 Primer sequence of real-time fluorescent PCR
基因
序列
复性
温度(℃) 长度
(bp)
Toll 样受体3 Toll 样受体4 髓样分化 蛋白2 髓样细胞分化 因子88 白细胞介素1β 白细胞介素6 白细胞介素12 GAPDH
上游引物：5’-GTC CAA CGG CTT
TGA CGA GAT-3’ 下游引物：5’-CTG GCC CGA AAA CCT TCT TCT-3’ 上游引物：5’-TGT CCT CCC ACT CCA GGT AAG T-3’
下游引物：5’-GAT TGC TCA GAC CTG GCA GTT-3’ 上游引物：5’-ATT CCA AGG AGA GAT TTA AAG CAA TT-3’ 下游引物：5’-CAG ATC CTC GGC
AAA TAA CTT CTT-3’ 上游引物：5’-GCA CAT GGG CAC ATA CAG AC-3’ 下游引物：5’-TGG GTC CTT TCC AGA GTT TG-3’ 上游引物：5’-CCA CGG CCA CAT TTG GTT-3’ 下游引物：5’-AGG GAA GCG GTT GCT CAT C-3’
上游引物：5’-TCG GTC CAG TTG CCT TCT CC-3’ 下游引物：5’-TCT GAA GAG GTG AGT GGC TGTC-3’
上游引物：5’-TGC AAA GCT TCT GAT GGA TCC T-3’ 下游引物：5’-CTG CCC GAA TTC TGA AAG CA-3’ 上游引物：5’-TCA TGG GTG TGA
ACC ATG AGA A-3’
下游引物：5’-GGC ATG GAC TGT
GGT CAT GAG-3’
59 60 56 58 58 61 58 60 188 143 100 239 71 127 194 146
2.3 各组儿童外周血单核细胞Toll样受体3、Toll样受体
4 mRNA和蛋白表达变化过敏性紫癜患儿Toll样受体3
mRNA、Toll样受体3蛋白表达水平与正常对照组比较，
差异均无显著性意义(P > 0.05)；Toll样受体4 mRNA、
Toll样受体4蛋白表达均显著高于正常对照组
(P < 0.05)。结果见表3，图1。
紫癜性肾炎组Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白
表达均显著高于紫癜无肾损害组，差异有显著性意义
(P < 0.05)，结果见表4，图2-4。
2.4 各组儿童外周血单核细胞髓样分化蛋白2、髓样
细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6、白
细胞介素12mRNA的表达变化过敏性紫癜组髓样分
化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白
细胞介素6 mRNA的表达显著高于正常对照组，差异
均有显著性意义(P< 0.05)，白细胞介素12 mRNA的
表达显著低于正常对照组，差异有显著性意义(P<
0.05)。见表5。
图1 过敏性紫癜组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表
达
Figure 1 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the
Henoch-Sch?nlein purpura group
注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4蛋白表达显著高于正常对照
组(P < 0.05)。
表3 过敏性紫癜组与正常对照组外周血单核细胞Toll样受体
3、Toll样受体4 mRNA和蛋白的表达变化
Table 3 Expression of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor
4 mRNA and protein in peripheral blood mononuclear
cells of Henoch-Sch?nlein purpura patients and
healthy controls (x_±s)
注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高
于正常对照组。
指标过敏性紫癜组正常对照组t P
Toll样受体3 mRNA
Toll样受体3 蛋白
Toll样受体4 mRNA
Toll样受体4蛋白
0.65±0.48
0.05±0.06
1.68±0.74
0.34±0.18
0.38±0.26
0.06±0.05
1.04±0.49
0.14±0.75
2.04
0.78
4.94
7.48
> 0.05
> 0.05
< 0.05
< 0.05
表4 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核
细胞Toll样受体4 mRNA和蛋白的表达变化
Table 4 Expression of Toll-like receptor 4 mRNA and protein in
peripheral blood mononuclear cells of
non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis patients,
Henoch-Sch?nlein purpura nephritis patients and
healthy controls (x_±s)
与紫癜无肾损害组比较，a P < 0.05；与正常对照组比较，b P < 0.05。
注：紫癜性肾炎组Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于
紫癜无肾损害组。
组别Toll样受体4 mRNA Toll样受体4蛋白
紫癜性肾炎组
紫癜无肾损害组
正常对照组
F
1.94±0.65ab
1.47±0.75
1.04±0.49
14.05
0.41±0.22ab
0.29±0.12
0.14±0.75
23.58
图2 正常对照组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白表达
Figure 2 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the
control group
注：过敏性紫癜患儿Toll样受体4蛋白表达显著高于正常对照
组(P < 0.05)。
图3 紫癜无肾损害组外周血单个核细胞Toll样受体4蛋白
表达
Figure 3 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the
non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis group
注：紫癜无肾损害组Toll样受体4蛋白表达显著低于紫癜性肾
炎组。
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH9185
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
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紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 的表达显著高于紫癜无肾损害组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA 的表达显著低于紫癜无肾损害组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表6。 2.5 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll 样受体4 mRNA 与Toll 样受体4蛋白表达相关性 过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll 样受体4 mRNA 与Toll 样受体4蛋白表达呈正相关(r =0.60，P < 0.01)，见图5。 2.6 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞T oll 样受体4 mRNA 与其他相关分子表达相关性 过敏性紫癜患儿T oll 样受体4mRNA 与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6表达均呈正相关(P < 0.05)，与白细胞介素12 mRNA 表达呈负相关(r =-0.66，P < 0.01)，见表7。
图4 紫癜性肾炎组外周血单个核细胞Toll 样受体4蛋白表
达
Figure 4 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the Henoch-Sch?nlein purpura nephritis group
注：紫癜性肾炎组Toll 样受体4蛋白表达显著高于紫癜无肾损害组。
表5 过敏性紫癜组与正常对照组外周血单核细胞髓样分化蛋
白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介
素6、白细胞介素12 mRNA 的表达
Table 5 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2,
myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β,
interleukin-6, interleukin-12 in the Henoch-Sch?nlein
purpura and control groups (x _
±s )
注：过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 的表达显著高于正常对照组，白细胞介素12 mRNA
的表达显著低于正常对照组。
指标 过敏性紫癜组 正常对照组 t P 髓样分化蛋白2 髓样细胞分化因子88
白细胞介素1β 白细胞介素6
白细胞介素12
1.15±0.37 1.21±0.39 1.52±0.45 1.05±0.32 0.43±0.17
0.83±0.30 0.87±0.22 0.79±0.38 0.68±0.33 0.69±0.20
4.09
5.39
6.29 4.21 5.31
< 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
表6 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核
细胞髓样细胞分化因子88、髓样分化蛋白2、白细胞介
素1β、白细胞介素6、白细胞介素12 mRNA 的表达
Table 6 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2,
myeloid differentiation factor 88, interleukin-1β,
interleukin-6, interleukin-12 in the non-Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, Henoch-Sch?nlein purpura nephritis
and control groups (x _
±s )
与紫癜无肾损害组比较，a P < 0.05；与正常对照组比较，b P < 0.05。
注：紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、
白细胞介素6 mRNA 的表达显著高于紫癜无肾损害组，紫癜性肾炎组白细
胞介素12 mRNA 的表达显著低于紫癜无肾损害组。
指标 过敏性紫癜组 紫癜无肾损害组
正常组 t P
髓样分化蛋白2 髓样细胞分化
因子88 白细胞介素1β
白细胞介素6
白细胞介素12 1.26±0.37ab
1.35±0.45ab
1.64±0.30ab 1.13±0.27ab 0.33±0.12ab
1.06±0.36 1.10±0.30
1.32±0.54 0.92±0.36 0.59±0.12
0.83±0.30 0.87±0.22
0.79±0.38 0.68±0.33 0.69±0.20 11.41 15.25
29.23 14.34 66.08 < 0.05 < 0.05
< 0.05 < 0.05 < 0.05
图5 过敏性紫癜组外周血单核细胞Toll 样受体4蛋白与
Toll 样受体4 mRNA 的相关图 Figure 5 Correlation between Toll-like receptor 4 protein and mRNA expression in the Henoch-Sch?nlein purpura group
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
T o l l 样受体蛋白
0 1 2 3 4
Toll 样受体4 mRNA
注：过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞Toll 样受体4 mRNA 与
Toll 样受体4蛋白表达呈正相关(r =0.60，P < 0.01)。
表
7 过敏性紫癜组Toll 样受体4与各因子的表达相关性 Table 7 Correlation expression of Toll-like receptor 4 and other receptors in the Henoch-Sch?nlein purpura group
注：过敏性紫癜患儿Toll 样受体4 mRNA 与髓样分化蛋白2、髓样细胞分
化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6表达均呈正相关，与白细胞介素12 mRNA 表达呈负相关。
指标
r P 髓样分化蛋白2 髓样细胞分化因子88 白细胞介素1β
白细胞介素6
白细胞介素12 0.66 0.67 0.66 0.64 -0.66
< 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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3 讨论 Discussion
过敏性紫癜是儿童时期较常见的一种小血管炎，发病率高，容易反复，根据不同的临床症状及体征，可将过敏性紫癜分为皮肤型、腹型、肾型、关节型、混合型等，据文献报道20%-80%的过敏性紫癜患儿会有肾损害发生
[9-10]
。其病因及发病机制尚未完全明确，可能涉
及体液免疫和细胞免疫紊乱，同时有细胞因子和炎症介质的参与。
Toll 样受体是天然免疫模式识别受体之一，与微生物的病原相关分子模式识别激活固有免疫系统；研究发现Toll 样受体分布十分广泛，不同的TLR 在不同组织及细胞表达有所不同，主要表达于单核-巨噬细胞、树突状细胞等
[11]
。
TLRs 识别配体包括外源性及内源性两种，Toll 样受体3主要识别病毒感染细胞后产生的dsRNA [12]
，Toll 样受体4主要识别脂多糖，髓样分化蛋白2蛋白与Toll 样受体4
胞外区结合而定位于细胞表面
[13]
，并促进细胞对脂多糖
的反应。TLR 信号通路包括髓样细胞分化蛋白88依赖性或髓样细胞分化因子88非依赖性途径激活核转录因子κB 、IRF3诱导细胞因子及趋化因子基因转录。Toll 样受体3主要参与非髓样细胞分化因子88依赖的转导[14]
，Toll
样受体4既参与髓样细胞分化因子88依赖的转导又参与
非髓样细胞分化因子88依赖转导途径
[15]
。目前研究较为
明确的为髓样细胞分化因子88依赖途径。TLR 通过两条信号途径转导细胞信号后，一方面刺激天然免疫细胞分泌大量的细胞因子、趋化因子诱导炎症反应，另一方面诱导树突状细胞活化及成熟，促进协同刺激分子和趋化因子的表达与释放，从而诱导T 细胞活化、增殖和发育。因此TLRs 是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁
[16]
。
近年来国内外研究显示，TLRs 信号通路在自身免疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用。研究发现TLRs 在肾小管上皮细胞、足细胞、肾小球系膜细胞等肾脏固有细胞及间质树突状细胞中表达
[17]
，TLRs 信号通路介导多种感染性
和非感染性肾脏疾病，如尿路感染、脓毒症引起肾衰竭、肾脏再灌注损伤、病毒性相关性肾炎、IgA 肾病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小病变性肾病、肾纤维化等
[18-23]
。但TLRs 与过敏性紫癜、紫癜性肾炎
的相关报道较少。
本组结果显示，过敏性紫癜患儿Toll 样受体3 mRNA 及蛋白表达与正常对照组比较，差异无显著性；过敏性紫癜患儿Toll 样受体4mRNA 及蛋白的表达均高于正常对照组，过敏性紫癜有肾脏损害组Toll 样受体4mRNA 及蛋白的表达量均高于过敏性紫癜无肾脏损害组；提示Toll 样受体4活化可能是导致过敏性紫癜免疫功能紊乱
的始动因素之一，Toll 样受体4的过度活化与过敏性紫癜的肾脏损伤有关。
白细胞介素1β主要是由单核细胞和树突状细胞合成，当作用于肾小球系膜细胞后还可刺激系膜细胞合成白细胞介素1β。该细胞因子可刺激肾小球系膜细胞合成降解胶原和基底膜的中性蛋白酶从而破坏肾小球
[24]
；还
可刺激系膜细胞分泌单核细胞趋化因子，趋化单核巨噬细胞的浸润，促进局部肾脏炎症反应。同时白细胞介素1β可促进内皮细胞合成纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)，使纤溶酶原活性下降，促进凝血，促使新月体的形成，加重肾脏损害
[25]
。
白细胞介素6也可由单核巨噬细胞和系膜细胞等合成，在其他细胞因子存在时可直接刺激肾小球系膜组织增生，导致肾小球纤维化，白细胞介素6亦可促使B 细胞增殖并产生大量IgE 、IgA ，沉积于肾小球系膜区引起肾炎
[26]
。
白细胞介素12是目前已知特异性最强的能独立诱导Th0向Th1细胞的分化与增殖的细胞因子[27]
，可以诱
导Th1细胞的形成，避免Th2的活化，在调节Th1/Th2
的平衡起重要作用。
本组结果显示，过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 的表达均显著高于正常对照组，白细胞介素12 mRNA 的表达显著低于正常对照组，过敏性紫癜患儿Toll 样受体4 mRNA 与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6表达均呈正相关，与白细胞介素12 mRNA 表达呈负相关。过敏性紫癜有肾损害组白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 较过敏性紫癜无肾损害组过表达而白细胞介素12 mRNA 低表达，提示Toll 样受体4经髓样细胞分化因子88依赖途径的信号转导通路异常活化，导致细胞因子失调，白细胞介素1β、白细胞介素6 过度产生，白细胞介素12产生不足致Th0向Th1分化减弱，Th2优势活化，引起Th1/Th2失衡，参与过敏性紫癜发病，加重过敏性紫癜的肾损伤。其具体机制尚需进一步的实验研究。
综上，过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll 样受体4蛋白及Toll 样受体4 mRNA 、髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA 表达明显升高，有肾损害组上述分子表达水平明显高于无肾损害组；过敏性紫癜患儿外周血单核细胞白细胞介素12 mRNA 表达明显降低，过敏性紫癜有肾损害组明显低于无肾损害组。Toll 样受体4可能通过髓样细胞分化因子88依赖信号转导途径介导过敏性紫癜及紫癜性肾炎的免疫发病机制。
作者贡献：实验设计为常红，实验实施为付元、程娜、张
守青、陈秀霞、高兴娟，实验评估为常红、张秋业，资料收集
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
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为付元。付元、常红成文、审校并对文章负责。文章作者均经过系统培训，未使用盲法评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组
织直接或间接地经济或利益的赞助。
伦理要求：参与实验的患儿监护人自愿参加，对治疗过程
完全知情同意。
学术术语：Toll 样受体-是参与非特异性免疫(天然免疫)
的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。Toll 样受体是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，T oll 样受体可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，
无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。
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1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体( tyrosine kinase associated receptor ) 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT 信号通路来传导信号，这包括白介素2?7 (IL-2?7 )、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH (生长激素)、EGF (表皮生长因子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN (干扰素)等等。这些细胞 因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK ( Janus kinase ) 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase, RTK )，而JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH )，其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT ( signal transducer and activator of transcription ) STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性 的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具 有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“ GTFLLRFSS ”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT 信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残 基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位
Ｔｏｌｌ样受体信号通路的研究进展 摘要Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是近年来发现的一类模式识别受体，通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)激活天然免疫。而髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR信号通路中的一个关键接头分子，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。本文对Toll样受体、髓样分化因子88的分子结构和基本功能，及Toll样受体的信号传导通路进行了综述。 关键词Toll样受体；髓样分化因子88；信号通路；负调控机制 免疫系统识别“非我”和“自我”的过程是依赖于不同的受体来完成的,作为先天性免疫系统的重要组成部分及连接获得性免疫与先天性免疫的“桥梁”, TLRs 是生物的一种模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR),它主要通过识别病原相关分子模式PAMPs来启动免疫反应。而MyD88是Toll受体信号通路中的一个关键接头分子，是第一个被鉴定的含TIR结构域的接头蛋白分子，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。 1TLR的结构与基本功能 Toll样受体一词来自对果蝇的研究,是决定果蝇背腹分化的基因所编码的一种跨膜受体蛋白,同时还参与果蝇的免疫反应,具有介导抗真菌感染信号转导的功能[1]。后来在哺乳动物也发现有与Toll受体同源的受体分子，统称为称为Toll 样受体TLRs。 TLRs是广泛分布在免疫细胞尤其非特异免疫细胞以及某些体细胞表面的一类模式识别受体，它们可以直接识别结合某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，即病原相关分子模式。迄今为止,已经发现哺乳动物至少有13种toll样受体,其中人的toll样受体鉴定出11种(TLR1-TLR11) [2]。TLRs识别的配基各不相同，其中TLR1-TLR5的结构已被确定,但只有TLR2与TLR4的功能被部分揭示。TLR4主要介导G-菌感染后LPS的信号转导,而TLR2主要介导G+感染后脂蛋白、脂多肽等的信号转导。它们都最终导致该转录因子的转位与相应免疫基因的活化而转录,释放前炎症因子及辅助刺激分子起到调节炎症反应的作用,从而提示TLRs可能在先天性免疫系统中起重要作用[3-4]。 TLRs家族成员具有相似的结构特征。它们均为Ⅰ型跨膜受体,由胞外区、跨膜区和胞内区3个功能区组成。胞外区序列差异大,是与配体结合的特异部位,主要包括十几至二十几个串联的富亮氨酸重复基序(leucine-rich repeats, LRRs),LRR
1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3
4 脉冲信号产生电路 4.1 实验目的 1．了解集成单稳态触发器的基本功能及主要应用。 2．掌握555定时器的基本工作原理及其性能。 3．掌握用555定时器构成多谐振荡器、单稳态触发器的工作原理、设计及调试方法。 4.2 实验原理 1．集成单稳态触发器及其应用 在数字电路的时序组合工作中，有时需要定时、延时电路产生定时、展宽延时等脉冲，专门用于完成这种功能的IC，就是“单稳延时多谐振荡器”，也称“单稳触发器”。其基本原理是利用电阻、电容的充放电延时特性以及电平比较器对充放电电压检测的功能，实现定时或延时，只需按需要灵活改变电阻、电容值大小，就可以取得在一定时间范围的延时或振荡脉冲输出。常用的器件有LS121/122、LS/HC123、LS/HC221、LS/HC423、HC/C4538及CC4528B等。 集成单稳态触发器在没有触发信号输入时，电路输出Q=0，电路处于稳态；当输入端输入触发信号时，电路由稳态转入暂稳态，使输出Q=1；待电路暂稳态结束，电路又自动返回到稳态Q=0。在这一过程中，电路输 出一个具有一定宽度的脉冲，其宽度与电路的外接定时元件C ext 和R ext 的数 值有关。 图4-1
集成单稳态触发器有非重触发和可重触发两种，74LS123是一种双可重触发的单稳态触发器。它的逻辑符号及功能表如图4-1、表4-1所示。 在表4-1中“正”为正脉冲，“负”为负脉冲。 LS/HC123的特点是，复位端CLR也具有上跳触发单稳态过程发生的功能。 在C ext >1000pF时，输出脉冲宽度t w ≈0.45R ext C ext 。 器件的可重触发功能是指在电路一旦被触发（即Q=1）后，只要Q还未恢复到0，电路可以被输入脉冲重复触发，Q=1将继续延长，直至重复触发的最后一个触发脉冲的到来后，再经过一个t w （该电路定时的脉冲宽度）时间，Q才变为0，如图4-2所示： 图4-2 74LS123的使用方法： （1）有A和B两个输入端，A为下降沿触发，B为上升沿触发，只有AB=1时电路才被触发。 （2）连接Q和A或Q与B，可使器件变为非重触发单稳态触发器。 （3）CLR=0时，使输出Q立即变为0，可用来控制脉冲宽度。 （4）按图4-3、3-5-4连接电路，可组成一个矩形波信号发生器，利用开关S瞬时接地，使电路起振。 图4-3 图4-4 2．555时基电路及其应用 555时基电路是一种将模拟功能和数字逻辑功能巧妙地结合在同一硅片上的新型集成电路，又称集成定时器，它的内部电路框图如图4-5所示。 图4-5 电路主要由两个高精度比较器C 1、C 2 以及一个RS触发器组成。比较器 的参考电压分别是2/3V CC 和1/3V CC ，利用触发器输入端TR输入一个小于 1/3V CC 信号，或者阈值输入端TH输入一个大于2/3V CC 的信号，可以使触发 器状态发生变换。CT是控制输入端，可以外接输入电压，以改变比较器的参考电压值。在不接外加电压时，通常接0.01μF电容到地，DISC是放电输入端，当输出端的F=0时，DISC对地短路，当F=1时，DISC对地开路。 R D 是复位输入端，当R D =0时，输出端有F=0。 器件的电源电压V CC 可以是+5V~+15V，输出的最大电流可达200mA，当 电源电压为+5V时，电路输出与TTL电路兼容。555电路能够输出从微秒级到小时级时间范围很广的信号。 （1）组成单稳态触发器 555电路按图4-6连接，即构成一个单稳态触发器，其中R、C是外接定时元件。单稳态触发器的输出脉冲宽度t w ≈1.1RC。 图4-6 （2）组成自激多谐振荡器 图4-7 自激多谐振荡器电路 按图4-7连接，即连成一个自激多谐振荡器电路，此电路的工作过程
郑州工业应用技术学院 课程设计说明书 题单片机脉冲信号测量 姓名： 院（系）：信息工程学院专业班级：计算 机科学与技术学号： 指导教师： 成绩： 时间：年月日至年月日
摘要 脉冲信号测量仪是一种常用的设备，它可以测量脉冲信号的脉冲宽度，频率等参数，并用十进制数字显示出来。利用定时器的门控信号GATE进行控制可以 实现脉冲宽度的测量。在单片机应用系统中，为了便于对LED显示器进行管理，需要建立一个显示缓冲区。本文介绍了基于单片机AT89C51的脉冲信号参数测量仪的设计。该设计可以对脉冲信号的宽度，频率等参数进行测量。 关键词：脉冲信号；频率；宽度；单片机AT89C51
目录 摘要............................................................... I 目录............................................................... II 第一章技术背景及意义 (1) 第二章设计方案及原理 (2) 第三章硬件设计任务 (3) 第四章软件结论 (12) 第五章参考文献 (13) 第六章附录 (14)
第一章技术背景及意义 单片机微型计算机是微型计算机的一个重要分支，也是颇具生命力的机种。单片机微型计算机简称单片机，特别适用于控制领域，故又称为微控制器。通常，单片机由单块集成电路芯片构成，内部包含有计算机的基本功能部件：中央处理器、存储器和I/O 接口电路等。因此，单片机只需要和适当的软件及外部设备相结合，便可成为一个单片机控制系统。由于单片机稳定可靠、物美价廉、功耗低，所以单片机的应用日益广泛深入，涉及到各行各业，如工业自动化、智能仪表与集成智能传感器、家用电器等领域。单片机应用的意义绝不仅限于它的广阔范围以及带来的经济效益，更重要的意义在于，单片机的应用正从根本上改变着传统的控制系统的设计思想和设计方法。从前必须由模拟电路或数字电路实现的大部分控制功能，现在使用单片机通过软件就能实现了。随着单片机应用的推广普及，单片机控制技术将不断发展，日益完善。因此，本课程设计旨在巩固所学的关于单片机的软件及硬件方面的知识，激发广大学生对单片机的兴趣，提高学生的创造能力，动手能力和将所学知识运用于实践的能力。 中断功能是一种应用比较广泛的功能，它指的是当CPU正在处理某件事情的时候，外部发生了某一件事（如一个电平的变化，一个脉冲沿的发生或定时器计数溢出等）请求CPU迅速去处理，于是，CPU暂时终止当前的工作，转去处理所发生的事件。中断服务处理完该事件以后，再回到原来被中止的地方继续原来的工作，这样的过程称为中断。本文中用到了定时器T0溢出中断，以实现软件延时。脉冲信号测量仪是一种常用的设备，它可以测量脉冲信号的脉冲宽度，脉冲频率等参数。
cAMP信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：G蛋白偶联受体 胞内应答过程：激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶→cAMP→依赖cAMP的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因转录 举例：1.多发性骨髓瘤：通过调变细胞内环腺苷酸浓度可以诱导多种肿瘤细胞增殖阻滞和凋亡，成为肿瘤治疗新途径。 2.肝损伤：对乙酰氨基酚致药物性肝脏损伤可能与cAMP-PKA 信号通路有关。 3.研究人员已经确定了这其中的机制，现在，一种能抑制Epac的新的候选药物——称为ESI Epac特异性抑制剂，也已经被证明能够保护正常小鼠免受致命性立克次氏体感染。目前，研究人员正在设计第二代ESI——更有效，即使在最高剂量也无毒。也有来自预备试验的迹象表明，ESI能够保护动物抗击一些致命的病毒感染。 磷脂酰肌醇信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：酶耦联型受体 胞内应答过程：Ca2+活化各种Ca2+结合蛋白引起细胞反应，钙调素（calmodulin，CaM）由单一肽链构成，具有四个钙离子结合部位。结合钙离子发生构象改变，可激活钙调素依赖性激酶（CaM-Kinase）。细胞对Ca2+的反应取决于细胞内钙结合蛋白和钙调素依赖性激酶的种类。 IP3信号的终止是通过去磷酸化形成IP2，或被磷酸化形成IP4。Ca2+由质膜上的Ca2+泵和Na+-Ca2+交换器将抽出细胞，或由内质网膜上的钙泵抽进内质网 DG通过两种途径终止其信使作用：一是被DG-激酶磷酸化成为磷脂酸，进入磷脂酰肌醇循环；二是被DG酯酶水解成单酯酰甘油。由于DG代谢周期很短，不可能长期维持PKC活性，而细胞增殖或分化行为的变化又要求PKC长期活性所产生的效应。现发现另一种DG生成途径，即由磷脂酶催化质膜上的磷脂酰胆碱断裂产生的DG，用来维持PKC的长期效应。 举例：1.肿瘤治疗：该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。 2.肝癌：PIK3R1在肝癌组织中表达上调,PIK3R1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进HepG2细胞的增殖. 生物技术15-1 曹文祥
变频器的电压检测电路（新） ——正弦变频器电压检测实际电路分析 一、电路构成和原理简析 电压检测电路，是变频器故障检测电路中的一个重要组成部分，旨在保障使IGBT 逆变电路的工作电源电压在一特定安全范围以内，若工作电源危及IGBT （包含电源本身的储通电容）器件的安全时，实施故障报警、使制动电路投入工作、停机保护等措施。此外，少数机型还有对输出电压的检测，在一定程度上，起到对IGBT 导通管压降检测的同样作用，取代驱动电路中IGBT 的管压降检测电路。 1、电压检测电路的构成、电压采样方式及故障表现 图1 电路检测电路的构成（信号流程）框图 1、电压检测电路的电压采样形式（前级电路） 1）直接对DC530V 电压采样 78L05C 8 P N 图2 DC530V 电压检测电路之一 直接对P 、N 端DC530V 整流后电源电压进行进行采样，形成电压检测信号。如阿尔法ALPHA2000型变
频器的电压检测电路，如图2所示。 电路中U14线性光耦合器的输入侧供电，由开关变压器的独立绕组提供的交流电压，经整流滤波、由78L05稳压处理得到5V 电源所提供，电源地端与主电路N 端同电位。输出侧供电，则由主板+5V 所提供。 直流回路P 、N 端的DC530V 电压，直接经电阻分压，取得约120mV 的分压信号，输入U14（线性光耦合器，其工作原理前文已述）进行光、电隔离与线性放大后，在输出端得到放大了的检测电压信号，再由LF353减法放大器进一步放大，形成VPN 直流电压检测信号，经CNN1端子，送入MCU 主板上的电压检测后级电路。 2）由开关变压器次级绕组取得采样电路信号 +5V -42V 图3 DC530V 电压检测电路之二 N +5V N1输入电压波形示意图V T 截止 VT 饱合导通 0V 530V 5V 0V -42V N3输出电压波形示意图 压采样等效电路T1 图4 直流回路电压采样等效电路及波型示意图 主电路的DC550V 直流电压检测信号，并不是从主电路的P 、N 端直接取得，而是“间接”从开关电源的二次绕组取出，这是曾经令一些检修人员感到困惑、找不到电压检测信号是从何处取出的一件事情，也成为该部分电路检修的一个障碍。电压采样电路如上图4所示。 在开关管VT 截止期间，开关变压器TRAN 中储存的磁能量，由次级电路进行整流滤波得到+5V 工作电源，释放给负载电路；在VT 饱和导通期间，TC2从电源吸取能量进行储存。 N3二级绕组上产生的电磁感应电压，正向脉冲出现的时刻对应开关管的截止时间，宽度较大，幅值较低，经二极管D12正向整流后提供负载电路的供电，有电流释放回路；反向脉冲出现的时刻对应开关管的饱和导通时间，宽度极窄，但并不提供电流输出，回路的时间常数较大（不是作为供电电源应用，只是由R 、C 电路取得电压检测信号），故能在电容C17上维持较高的幅值。开关管VT 饱合导通时，相当于将N1绕组直接接入530V 电源，因而在同一时刻N3绕组此时所感应的负向脉冲电压，是直接反映N1绕组供电电压高低的，并与其成线性比例关系——N3绕组感应电压的高低，仅仅取决于N1、N3绕组的匝数比。整
Rheumatol Int DOI 10.1007/s00296-014-3137-5 Role of integrins and their ligands in osteoarthritic cartilage Jian Tian · Fang?Jie Zhang · Guang?Hua Lei Received: 25 May 2014 / Accepted: 17 September 2014 ? Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 [1]. Radiographic evidence of OA occurs in the majority of people by 65 years of age, and among them about 80 % in people who aged over 75 years [2]. However, the pathogen-esis of this disease is not fully elucidated. Cartilage damage is one of the major pathological changes in OA. Articular cartilage is an avascular, a neu-ral, alymphatic, and viscoelastic connective tissue that functions autonomously to bear loads and provide almost friction-free movement of diarthrodial joints [3]. Chondro-cytes, the only cell population of adult articular cartilage, are strongly involved in maintaining the dynamic equi-librium between synthesis and degradation of the extra-cellular matrix (ECM) [4]. Collagens represent the major structural components of the articular cartilage. Cartilage is made up of two main ECM macromolecules: type II collagen and aggrecan, a large aggregating proteoglycan [5, 6]. Cartilage destruction is thought to be mediated by two main enzyme families: the matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the cartilage collagen break-down, whereas enzymes from disintegrin and metallopro-teinase domain with thrombospondin motifs (ADAMTS) family mediate cartilage aggrecan loss [7]. Activation of biochemical pathways involves the production of proin-flammatory cytokines, inflammation, degradation of the ECM by MMPs and ADAMTS, and cessation of ECM syn-thesis via dedifferentiation and apoptosis of chondrocytes [8, 9]. Therefore, the ECM is a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in regulating many biological processes, which include cell growth, differentiation, and survival [10, 11]. Cell–matrix interactions control cell function and behav-ior by signal transduction through a variety of cell sur-face receptors. The integrins are the major family of ECM receptors, which can transmit information from the matrix to the cell. Integrin binding of ECM ligands results in the Abstract Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease, which is characterized by articular cartilage destruction, and mainly affects the older people. The extracellular matrix (ECM) provides a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in reg-ulating many biological processes, including cell growth, differentiation, and survival. However, the pathogenesis of this disease is not fully elucidated, and it cannot be cured totally. Integrins are one of the major receptors in chondro-cytes. A number of studies confirmed that the chondrocytes express several integrins including α5β1, αV β3, αV β5, α6β1, α1β1, α2β1, α10β1, and α3β1, and some integrins ligands might act as the OA progression biomarkers. This review focuses on the functional role of integrins and their extracellular ligands in OA progression, especially OA car-tilage. Clear understanding of the role of integrins and their ligands in OA cartilage may have impact on future develop-ment of successful therapeutic approaches to OA.Keywords Chondrocyte · Integrin · Fibronectin · Tenascin C · Osteopontin · Osteoarthritis · Cartilage Introduction Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease and is char-acterized by articular cartilage destruction along with changes occurring in other joint components including bone, menisci, synovium, ligaments, capsule, and muscles Rheumatology INTERNATIONAL J. Tian · F.-J. Zhang · G.-H. Lei (*) Department of Orthopaedics, Xiangya Hospital, Central South University, No. 87 Xiangya Road, Changsha 410008, Hunan, China e-mail: gh.lei9640@https://www.doczj.com/doc/044529813.html,; lgh9640@https://www.doczj.com/doc/044529813.html,
Toll样受体信号通路图 TLR家族成员(TLR3除外)诱导的炎症反应都经过一条经典的信号通路(图1)，该通路起始于TLRs的一段胞内保守序列—Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1receptorhomologousregion，TIR)．TIR可激活胞内的信号介质—白介素1受体相关蛋白激酶(IL-1Rassociatedkinase，IRAK)IRAK-1和IRAK-4、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFR-associatedfactor6,TRAF-6)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)和IκB激酶(IκBkinase，IκK)，进而激活核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)，诱导炎症因子的表达。 Toll-liker Receptor Signaling 本信号转导涉及的信号分子主要包括： CD14，MD-2，TRAM，TRIF，TIRAP，MyD88，TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，IRAK-1，IRAK-2，IRAK-4，IRAK-M，TRAF6，TRIAD3A，ST2L，SOCS1，RIG-I，FADD，TOLLIP，RIP1，A20，UEV1A，Ubc13，ECSIT，MEKK-1，TAK1，
TBK1，MKK3/6，p38，TAB1/2，MKK4/7，JNK，IKKα，IKKβ，IKKγ，IKKε，NEMO，IκBα，NF-κB，p65/RelA，Casp-8，IRF-3，IRF-7，MA VS等
细胞受体类型、特点 及重要的细胞信号转导途径 学院：动物科学技术学院 专业：动物遗传育种与繁殖 姓名：李波
学号：2015050509
目录 1、细胞受体类型及特点 (4) 1.1离子通道型受体 (4) 1.2 G蛋白耦联型受体 (4) 1.3 酶耦联型受体 (5) 2、重要的细胞信号转导途径 (5) 2.1细胞内受体介导的信号传递 (5) 2.2 G蛋白偶联受体介导的信号转导 (6) 2.2.1激活离子通道的G蛋白偶联受体所介导的信号通路 (7) 2.2.2激活或抑制腺苷酸环化酶的G蛋白偶联受体 (7) 2.2.3 激活磷脂酶C、以lP3和DAG作为双信使 G蛋白偶联受体介导的信号通 路 (8) 2.2 酶联受体介导的信号转导 (9) 2.2.1 受体酪氨酸激酶及RTK-Ras蛋白信号通路 (10) 2.2.2 P13K-PKB(Akt)信号通路 (10) 2.2.3 TGF-p—Smad信号通 (11) 2.2.4 JAK—STAT信号通路 (12)
1、细胞受体类型及特点 受体(receptor)是一种能够识别和选择性结合某种配体(信号分子)的大分子物质，多为糖蛋白，一般至少包括两个功能区域，与配体结合的区域和产生效应的区域，当受体与配体结合后，构象改变而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。受体与配体问的作用具有3个主要特征：①特异性；②饱和性；③高度的亲和力。 根据靶细胞上受体存在的部位，可将受体分为细胞内受体(intracellular receptor)和细胞表面受体(cell surface receptor)。细胞内受体介导亲脂性信号分子的信息传递，如胞内的甾体类激素受体。细胞表面受体介导亲水性信号分子的信息传递，膜表面受体主要有三类：①离子通道型受体(ion—channel—linked receptor)；②G蛋白耦联型受体(G—protein —linked receptor)；③酶耦联的受体(enzyme—linked recep—tor)。第一类存在于可兴奋细胞。后两类存在于大多数细胞，在信号转导的早期表现为激酶级联事件，即为一系列蛋白质的逐级磷酸化，借此使信号逐级传送和放大。 1.1离子通道型受体 离子通道型受体是一类自身为离子通道的受体，即配体门通道(1igand—gated channel)，主要存在于神经、肌肉等可兴奋细胞，其信号分子为神经递质。神经递质通过与受体的结合而改变通道蛋白的构象，导致离子通道的开启或关闭，改变质膜的离子通透性，在瞬间将胞外化学信号转换为电信号，继而改变突触后细胞的兴奋性。如：乙酰胆碱受体以三种构象存在，两分子乙酰胆碱的结合可以使之处于通道开放构象，但该受体处于通道开放构象状态的时限仍十分短暂，在几十毫微秒内又回到关闭状态。然后乙酰胆碱与之解离，受体则恢复到初始状态，做好重新接受配体的准备。离子通道型受体分为阳离子通道，如乙酰胆碱、谷氨酸和五羟色胺的受体，和阴离子通道。 1.2 G蛋白耦联型受体 三聚体GTP结合调节蛋白(trimeric GTP—binding regulatory protein)简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由a、p、-／三个亚基组成，a和7亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当a亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，“亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的ATP 水解，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS(regulator of G protein signaling)增强。RGS也属于GAP(GTPase activating protein)。 G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白(图10—6)，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内
TOLL样受体7（TLR7）增殖分化信号通路论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的探讨TLR7的激活对HaCaT细胞增殖与分化的影响及其可能的机制。方法培养HaCaT细胞，以不同剂量的TLR7配体Gardiquimod经不同的时间体外刺激HaCaT细胞，MTT及流式细胞术分析TLR7的激活对HaCaT细胞增殖的影响。以不同剂量的TLR7配体Gardiquimod经不同的时间体外刺激HaCaT细胞，加入氯化钙诱导HaCaT细胞分化，Western-Blot分析HaCaT细胞的分化Markers（颗粒层：Keratin1，基底层：Keratin5和棘层：Involucrin）并以此分析TLR7的激活对氯化钙诱导HaCaT细胞分化的影响。 Western-blotting分析TLR7在HaCaT细胞中激活的信号通路 PI3K-AKT和RAS-MAPK等。在TLR7配体Gardiquimod处理HaCaT细胞前1h，分别加入特异性阻断剂(PD98059及LY2940002)阻断TLR7配体Gardiquimod激活的相关信号通路，然后分析阻断剂对TLR7配体Gardiquimod调控HaCaT细胞增殖及分化影响，从而探讨PI3K-AKT 和RAS-MAPK信号通路在TLR7配体Gardiquimod对HaCaT细胞增殖及分化调控中的作用。结果MTT及流式细胞分析结果显示：TLR7配体Gardiquimod促进HaCaT细胞增殖，且具有时间及剂量依赖性；TLR7配体Gardiquimod能够抑制氯化钙诱导的HaCaT细胞分化markers （Keratin1及Involucrin）的表达，存在时间效应及剂量效应；信号通路分析揭示TLR7配体Gardiquimod能够增加ERK1/2和MAPK的水平；阻断剂的研究发现TLR7配体Gardiquimod部分依赖PI3K-AKT
Toll 样受体(TLRs)是一个模式识别受体家族，它们在进化上高度保守，从线虫到哺乳 动物都存在TLRs，目前在哺乳动物中已发现 12 个成员[1]．TLRs 主要表达于抗原递 呈细胞及一些上皮细胞，为玉型跨膜蛋白，胞外区具有富含亮氨酸的重复序列，能够 特异识别病原微生物进化中保守的抗原分子———病原相关分子模式 (pathogen-associatedmolecular patterns, PAMPs)[2]．为了有效地抵抗入侵的病原体，机体需要对多种 PAMPs 产生适当的免疫应答，TLRs 可以通过识别 PAMPs 诱发抵抗病原体的免疫反应．而且 TLRs 也参与识别有害的内源性物质．TLRs 的激活可诱导很强的免疫反应，有利于机体抵抗病原体感染或组织损伤，但是过度的免疫反应也会带来不利影响，如产生内毒素休克、自身免疫性疾病等．为了保证 TLRs 介导正确的免疫应答，机体 存在精密的负调控机制，及时抑制 TLRs 信号，维持机体的免疫平衡[3]TLR 家族成员(TLR3 除外)诱导的炎症反应都经过一条经典的信号通路(图 1)，该通路起始于TLRs 的一段胞内保守序列———Toll/IL-1 受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)．TIR可激活胞内的信号介质———白介素 1 受体相关蛋白激酶 (IL-1R associated kinase， IRAK) IRAK-1 和IRAK-4、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TNFR-associated factor 6, TRAF-6)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和 I资B激酶 (I资B kinase， I资K )，进而激活核因子资 B(nuclear factor 资B，NF-资B)，诱导炎症因子的表达．TLRs 信号通路上的许多接头蛋白都具有 TIR结构域：髓系分化因子 88(myeloid differentiationfactor 88， MyD88)、MyD88- 接头蛋白相似物(MyD88-adaptor like，Mal)、含有 TIR 结构能诱导干扰 素茁的接头分子 (TIR domain-containingadaptor inducing interferon 茁，TRIF)、TRIF 相关接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)和SARM (sterile 琢 and armadillo motif-containingprotein)[4]．它们参与 TLRs 所介导的信号转导，其中 MyD88 最重要，参与了除 TLR3 外所有 TLRs介导的信号转导．MyD88 首先通过 TIR 与 TLRs 相结合，接着募集下游信号分子 IRAK-4，IRAK-4 磷酸化激活IRAK-1，随后 活化 TRAF6．活化的 TRAF6 具有泛素连接酶(E3)的活性，能够结合泛素结合酶(E2)，进而泛素化降解 IKK-酌．这种泛素化降解可以活化TGF-茁激酶(TGF-茁 activated kinase 1， TAK1) 和TAK1 结合蛋白 (TAK1 binding protein， TAB1、TAB2、 TAB3)．活化的 TAK1 会催化 IKK-茁磷酸化，最终激活 NF-资B，促使炎症因子的表达．除了共同的 NF-资B 激活通路，不同的 TLRs 还存在着其特有的信号通路，一些TLRs 具有募集 Mal、TRAM 和 TRIF 的作用．不同的接头分子在信号传导中发挥的作 用不同[5]，TRIF 在脂多糖(LPS)激活的 TLR4 途径和 Poly(I∶C)激活的 TLR3 途径中都起到了重要的作用，而 TRAM 仅在 TLR4 的途径中发挥作用．TLRs 的激活是一把双刃剑，它可以通过刺激先天性免疫应答和提高获得性免疫反应来保护机体，但是它所引 起的持续性炎症反应也会对机体产生损伤，自身免疫、慢性炎症和感染性疾病都与它 有一定关系．例如LPS 持续刺激TLR4 就可以引起严重的败血病和感染性休克，此外，类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺心病、结肠炎、哮喘、心肌病、狼疮和动脉粥样硬化
脉冲信号发生器 摘要：本实验是采用fpga方式基于Alter Cyclone2 EP2C5T144C8的简易脉冲信号发生器，可以实现输出一路周期1us到10ms，脉冲宽度：0.1us到周期-0.1us,时间分辨率为 0.1us的脉冲信号，并且还能输出一路正弦信号（与脉冲信号同时输出）。输出模式 可分为连续触发和单次手动可预置数（0~9）触发，具有周期、脉宽、触发数等显示功能。采用fpga计数实现的电路简化了电路结构并提高了射击精度，降低了电路功耗和资源成本。 关键词：FPGA；脉冲信号发生器；矩形脉冲；正弦信号； 1 方案设计与比较 脉冲信号产生方案： 方案一、采用专用DDS芯片的技术方案： 目前已有多种专用DDS集成芯片可用，采用专用芯片可大大简化系统硬件制作难度，部数字信号抖动小，输出信号指标高；但专用芯片控制方式比较固定，最大的缺点是进行脉宽控制，测量困难，无法进行外同步，不满足设计要求。 方案二、单片机法。 利用单片机实现矩形脉冲，可以较方案以更简化外围硬件，节约成本，并且也可以实现灵活控制、能产生任意波形的信号发生器。但是单片机的部时钟一般是小于25Mhz，速度上无法满足设计要求，通过单片机产生脉冲至少需要三条指令，所需时间大于所要求的精度要求，故不可取。 方案二：FPGA法。利用了可编程逻辑器件的灵活性且资源丰富的特点，通过Quartus 软件的设计编写，实现脉冲信号的产生及数控，并下载到试验箱中，这种方案电路简单、响应速度快、精度高、稳定性好故采用此种方案。 2 理论分析与计算 脉冲信号产生原理：输入量周期和脉宽，结合时钟频率，转换成两个计数器的容量，用来对周期和高电平的计时，输出即可产生脉冲信号。 脉冲信号的精度保证：时间分辨率0.1us，周期精度：+0.1%+0.05us，宽度精度：
喷油脉冲信号 操作说明 喷油器的驱动器简称喷油驱动器有四种基本类型： 饱和开关型 峰值保持型 博士（BOSCH）峰值保持型 PNP型 喷油脉冲检测操作说明 连接： 用通用探针连接喷油脉冲传感器输出信号线。将一缸信号拾取器夹在一缸高压线上。 操作说明： ●在“电控发动机参数”菜单下点击“喷油脉冲信号”图标，系统即可进入 喷油脉冲传感器波形测试界面，并显示所测得的喷油脉冲传感器波形，如下图所示。 ●用鼠标左键点击“停止”图标（“停止”图标被按下后即变为“测试”图 标），系统即停止测试，再点击此图标即可恢复测试（同时“测试”图标恢复为“停止”图标）。 ●显示的转速、占空比、频率与显示的波形实时对应。 ●在停止状态下可点击“显示调整”图标，在弹出的工具窗口中可对X、Y轴 进行缩放、平移，以便观察。 ●用鼠标左键点击“保存数据”图标可将检测有效结果进行保存。
●用鼠标左键点击“保存波形”图标可将波形保存于指定目录。 ●用鼠标左键点击“图形打印”可对界面有效区域进行图形打印。 ●点击帮助图标可进入帮助系统查看相应技术数据。 ●用鼠标左键点击“返回”图标可返回上级菜单。 喷油脉冲传感器检测 饱和开关型（PFI/SFI）喷油器驱动器
*测试步骤 起动发动机，以2500转/分转速保持油门2-3分钟，直至发动机完全热机，同时燃油反馈系统进入闭环，通过观察屏幕上氧传感器的信号确定这一点。 关掉空调和所有附属电器设备，让变速杆置于停车档或空档，缓慢加速并观察在加速时喷油驱动器喷油时间的相应增加。 A. 从进气管加入丙烷，使混合气变浓，如果系统工作正常，喷油驱动器喷油时间将缩短，它试图对浓的混合气进行修正（高的氧传感器电压）。