家蚕普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ的cDNA克隆、序列分析及在大肠杆
菌中的表达
作者:宋志冰
指导老师:阚云超
(南阳师范学院生命科学与技术学院2003级4班)
摘要:利用RT-PCR 技术扩增了编码家蚕雌、雄虫触角普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ的cDNA 片段,将其克隆至pGEM-T载体,获得了普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ基因成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pET30a ( + ) 中,并转化入原核细胞中表达。序列测定结果表明,家蚕触角普通气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长分别为495 bp 和483 bp,各自编码164和160 个氨基酸残基。推导的氨基酸序列与已报道的10 种昆虫普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ高度同源(73 %～98 %) ,并具有气味结合蛋白的典型特征。经IPTG 诱导,普通气味结合蛋白Ⅰ和Ⅱ基因能在大肠杆菌BL21(DE3) 中表达。
关键词：普通气味结合蛋白; 触角; 基因克隆; 原核表达
Cloning and sequencing of cDNA encoding general odorant
binding protein Ⅰand Ⅱin the Bombyx mori
Author: Song Zhibing
Guider: Kan Yunchao
(The college of life science and technology of Nan Yang Normal
University Class4 Grade2003)
Abstract: The cDNA encoding the general odorant binding protein ⅠandⅡ(named as GOBP1andGOBP2) was isolated from themale and female antennae of Bombyx mori by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) . The cDNA fragment wasfurther cloned into Pgem-T vector , and then constructed into expression vector pET-30a ( + ) for overexpression in prokaryotic cells. Structural analysis showed that the full length of mature GOBP1 and GOBP2 open reading frame (ORF) were 495 bp and 483bp, encoding 164 and 160 amino acid residues . The deduced amino acid sequence showed a high identity to the reported sequences ofGOBP1 and GOBP2 from other insects and shared the typical structural features of odorant binding proteins from other insects.Induced by IPTG, the full length of GOBP1 and GOBP2 were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) ..
Key words：general odorant binding protein ; antenna ; gene cloning ; prokaryotic expression
1 引言
昆虫气味结合蛋白(odorant binding protein ,OBP) 是一类低分子的
水溶性酸性蛋白(Pelosi andMaida ,1995) ,在昆虫识别外界气味物质中起重要作用(Li and Prestwich , 1997 ;王睿等,1999) ,多在昆虫嗅觉感器中表达。对于鳞翅目昆虫依据其生理功能将OBP 分为信息素结合蛋白
( pheromone bindingprotein , PBP) 、普通气味结合蛋白Ⅰ(general odorantbinding protein Ⅰ, GOBP1) 、普通气味结合蛋白Ⅱ(GOBP2) 和PBP 相关蛋白( PBP2like protein) (Li andPrestwich ,1997) 。实验证明PBP 可与特定的信息素结合,它们主要存在于毛形感器中,在信息素识别过程中起关键作用。GOBP1和GOBP2 在雌、雄蚕触角中表达量相同( Vogt et al . , 1991 ;Jacquin2Joly et al . , 2000 ;Wang et al . ,2003 ) ,在所研究的昆虫中表现出很高的序列同源性。一些实验证明,相对于PBP 家族间较高的特异性而言, GOBP1和GOBP2 家族有明显的广谱性。它们除了能结合较广范围的气味分子外,还能结合一些信息素分子(Li and Prestwich , 1997) 。但还未找到合适的配体(Li and Prestwich , 1997) ,也就不能得到一个理想的嗅觉模型(Maibeche2Coisne et al . , 1998)由于昆虫触角较小,直接分离纯化大量气味结合蛋白用于生物化学和生物物
理学研究比较困难。迄今对昆虫GOBP1和GOBP2 蛋白的结构和功能研究尚少,对功能的研究还限于根据一些生理生化和免疫学实验结果作出的一些
推理, 没有直接的证据(Li and Prestwich , 1997 ;Maibeche2Coisne et al . , 1998 ; 王桂荣等, 2002) 随着生物化学和分子生物学技术的快速发展,利用多种原核和真核表达系统表达外源基因,进而对其蛋白结构和功能进行研究已成为可能。本研究旨在利用RT-PCR 法克隆家蚕触角GOBP1和GOBP2 基因,将得到的基因与表达载体相连后,在大肠杆菌中表达,得到目
的蛋白,为研究其结构及功能奠定基础。
2、材料与方法
2.1 材料
2.1.1试验材料与质粒菌种
家蚕试验种（由河南云阳蚕桑试验场提供）
大肠杆菌（Escherichia coli）DH10B/测序， PET-30Vector BL-21
2.1.2试剂
DNA限制性内切酶(EcoRⅠ，HindⅢ等)购自于NEB生物公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、2000bp DNA Marker、均购自生物工程科技有限公司；PET-30 vector 购自于Ambion；琼脂糖、胰蛋白胨和酵母抽提物购自Oxoid 公司； EDTA、Tris-base、DNA纯化试剂盒、RT-PCR反应试剂盒、Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit(50) 均购自宝生生物公司；DNA回收试剂盒，质粒提取试剂盒，购自鼎国生物公司；质粒提取试剂为自己配置；其他普通试剂均为国产分析纯。
2.1.3主要仪器
Sigma SK18型冷冻离心机，PTC－200 PCR仪，VILBER LOURMAT凝胶成像分析系统。
2.2培养基与细胞
2.2.1LB培养基
Tryptone 10g
Yeast extract 5 g
NaCl 10 g
先加入950ml超纯水直至溶质完全溶解，用调节PH至7.0，然后定容。
固体培养基(g/L)：在液体培养基中加入1.5%的琼脂粉即可。
2.2.2感受态细胞
有中英联合实验室李沙师姐赠送.
2.3实验方法
2.3.1家蚕触角RNA的提取
(1)取家蚕的触角适量，将其放入液氮中速冻研磨。
(2)取研磨好的样品100mg，加入1mL TRIzol匀浆（要彻底，后转至EP 管）（组织匀浆量＞100mg时分装1mL/每EP管）。
(3)颠倒混匀10下，室温静置5min后，4℃，离心.12000rpm， 15min。
(4)转移上层水相（约400μl ）于另一1.5mLEP管中，加入等体积异丙醇（约400μl ），混匀室温静置10min。
(5)4℃，离心.12000rpm，10min，弃上清。
(6)加入冰预冷的75％乙醇（用DEPC水配）1mL，颠倒混匀，4℃，离心7500g，5min，弃上清。
(7)12000rpm离心30s，用枪头吸去多余水分，空气干燥5～10 min（不能完全干燥）。
(10)加入10～20μl DEPC水中，-80℃放置备用。
2.3.2 RT-PCR方法获得外源核酸片段
RT-PCR反应体系为：
10× buffer 2.5μl
dNTP mix （2mM） 2.5 μl
正向引物1（10pM） 1 μl
反向引物2（10pM） 1 μl
Taq酶（5U/μl） 0.2μl
模板（质粒） 1 μl
加ddH2O至 25 μl
轻轻混匀后进行PCR反应。反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性
1min→ 55℃复性 1min → 72℃延伸 1min，共 30个循环，最后于72℃保温10min，以便延伸完全，设置4℃保存。可电泳检测结果。按照鼎国DNA 会首试剂盒回收目的基因。结果见图（1）。
2.3.3 克隆及测序
2.3.3.1 克隆
将PCR产物连到pGEM-T vector连接体系为：
ddH2O 2μl
2×Buffer 5μl
pGEM-T vector 0.5μl
PCR产物 2μl
T4 DNA连接酶 0.2μl
共10μl，4℃，3小时。按使用说明将回收的PCR 产物克隆到pGEM-T载体, 然后转化大肠杆菌DH10B,蓝白斑筛选：
(1) 取100μl培养液涂于含有胺苄青霉素的LB和X-gal，IPTG的平板上，
进行蓝白斑筛选
(2) 倒置平板于37℃条件下培养18-19h以筛选转化子。
(3) 平板上出现许多蓝斑和白斑，白斑可能是所需的转化子，但要进行酶切或PCR验证。
(4) 在每个平板上分别挑选一个大菌落接种于摇瓶中培养，并进行DNA质粒抽提,酶切或PCR验证。
2.3.3.2测序于序列比对
DNA 的序列测定在北京奥科生物技术有限责任公司进行。结果正确后，选择阳性的克隆提质粒。然后酶切正确的质粒，电泳检测，回收目的基因，为下一步工作打好基础。
2.3.4 质粒抽提
(１) 取5ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到无菌试管中，用牙签接一单菌落并于37℃，200rpm条件下培养过夜。
(２) 将1.5ml培养液倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm 离心2min。
(３) 弃上清，吸去管底部的液体，将管倒置于吸水纸上，尽量吸净附在管壁上的残留液。
(４) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散均匀。
(５) 加200 μl新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。(６) 加入150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，反复颠倒数次，使混合均匀，置冰上3-5min。
(７) 用微量离心机于4℃，12000rpm离心13min。
(８) 取上清于一干净的离心管中，约400μL 。
（9）加等量体积的酚（200μL）∶氯仿（200μL），振荡混合有机相和水相，然后用小离心机于4℃以最大速度离心2 min，将上清约350μL 转移到另一离心管中。
(10) 加入2倍体积的预冷的无水乙醇约700μL于室温下沉淀双链DNA，震荡混合，于室温下放置2min。再-20℃放置10min。
(１1) 离心机于4℃，12000rpm离心8min。
(１2) 弃上清液并将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出。
(１3) 70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，离心5min去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10min。
(１4) 用不含DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液或ddH2O重新溶解核酸沉淀，并贮存于-20℃。
2.3.5 酶切
酶切反应体系为：
ddH2O 4.6μl
10×Buffer2 1 μl
EcoRⅠ 0.2 μl
HindⅢ 0.2μl
克隆质粒 4μl
体系为10μl，37.3℃酶切2：30小时以上。1％的琼脂糖凝胶电泳检
测。结果见图(2)。对表达载体进行双酶切，为基因的表达做准备。
双酶切反应体系为：
PET-30 vector 25μl
EcoRⅠ 1μl
HindⅢ 1μl
10×Buffer2 5μl
ddH2O18μl
体系共计50μl，在37.3℃酶切3小时左右，酶切结束后，可进行酶切验证。
2.3.6 酶连
酶连反应体系为：
ddH2O 1.5 μl
10×Buffer2 1μl
PET-30 vector 2 μl
DNA片断 5μl
T4连接酶 0.5μl
体系为10μl，4℃酶连过夜或16℃酶连3个小时以上。
2.3.7 酶连产物转化
(１) 取100μl已制备好的高效感受态细胞于Eppendorf管中，加入10μl 酶连产物，混匀置于冰上30min。
(２) 于42℃下热击60s。
(３) 置冰上冷却1—2min。
(４) 加入300μl的LB液体培养基，然后置于37℃摇床上250rpm复苏培养1h。
(５) 取100μl培养液涂于含有卡那霉素的LB平板上，进行筛选。(６) 倒置平板于37.3℃条件下培养16h以筛选转化子。
(７) 平板上出现许多白斑，白斑可能是所需的转化子，但要进行酶切或PCR 验证。
(８) 在每个平板上分别挑选一个大菌落接种于摇瓶中培养，并进行DNA质粒抽提,酶切或PCR验证。
2.3.8 连入表达载体后的质粒抽提
质粒提取按照鼎国试剂盒上步骤进行.
2.3.9双酶切检测
双酶切连入表达载体的质粒。
双酶切反应体系为：
提取的质粒DNA 2.0μl
EcoRⅠ 0.5μl
HindⅢ 0.5μl
10×Buffer2 1.0μl
ddH2O 6.0μl 体系共计10μl，在37℃酶切3小时左右，酶切结束后，可进行酶切验证。见图（3）。
2.3.10外源基因的诱导表达: 提取经鉴定了的质粒pET－30GOBP1和
pET－30GOBP1,转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,挑取单菌落置2 mL LB 培养基(含Kan 30μgPmL) 中,37 ℃ 160 rpmin 振荡培养过夜。活化后按1 %(VPV) 接种量转接10 mL LB 培养基( Kan 30μgPmL) ,振荡培养至OD600达0.6左右,加IPTG(异丙基212硫代2β2D2半乳糖苷) 至终浓度为1 mmolPL , 37 ℃,160 rpm 继续诱导5～6 h。收集菌液,8 000 rpm离心5 min ,去除上清。用蒸馏水将沉淀重新悬浮,8 000 rpmin离心5 min ,收集菌体,加入300μL SDS 凝胶加样缓冲液(40 mmolPL Tris2HCl ,pH 618 ,10 %甘油,2 % SDS ,5 % 巯基乙醇,011 % 溴酚蓝) 后剧烈振荡悬浮,煮沸10 min ,离心后取上清,置4 ℃备用(张振臣等,1999 ,2000) 。
3 结果与分析
3.1.电泳图
RT-PCR产物，从左往右依次GOBP1 PBP1 GOBP2 PBP2 2000bp Marker，效果不错
图(1)
酶切克隆后的质粒从左往右依次pGEM-T －GOBP1 pGEM-T －GOBP2 2000bp Marker。
图(2)
图(3) 双酶切的连入表达载体的质粒检测：左至右为 PET-30－GOBP1 PET-30－GOBP2
3.2 测序结果及比较
GOBP1 ATGTGGAAACTAGTTGTCGTTTTGACTGTTAACCTACTCCAGGGAGCGCTGACAGATGTCTACG TCATGAAAGACGTCACTCTGGGGTTTGGACAGGCGCTTGAGCAGTGCAGAGAGGAGAGTCAACT TACCGAAGAGAAGATGGAGGAGTTCTTCCACTTCTGGAATGATGACTTCAAGTTCGAACACAGA GAGCTGGGCTGTGCGATCCAGTGTATGAGCAGACATTTCAACCTCCTCACGGATTCCAGCAGGA TGCACCACGAGAACACCGACAAATTCATCAAGTCCTTCCCGAACGGCGAAATCCTATCACAGAA GATGATAGATATGATACACACGTGCGAAAAAAAGTTTGATTCGGAGCCTGATCACTGCTGGCGT ATTCTAAGAGTGGCTGAATGTTTCAAGGACGCGTGTAATAAGTCCGGATTAGCGCCTTCAATGG AACTGATATTGGCGGAGTTCATAATGGAATCGGAAGCGGACAAATGA
GOBP2 ATGTTTTCGTTTTTGATTTTGGTGTTTGTAGCGTCGGTCGCGGACTCGGTGATCGGTACCGCCG AGGTGATGAGCCACGTCACTGCTCATTTCGGTAAGACCCTTGAGGAATGCCGAGAGGAGTCCGG GCTATCAGTTGACATTTTAGACGAGTTCAAGCACTTCTGGAGTGATGACTTCGATGTGGTTCAT AGAGAGTTGGGCTGTGCCATCATCTGCATGTCCAATAAATTTTCTCTGATGGACGATGACGTCA GGATGCATCACGTCAACATGGACGAGTATATCAAGAGTTTTCCAAACGGGCAAGTTCTAGCAGA
GAAAATGGTAAAATTGATCCACAATTGTGAGAAACAGTTTGATACCGAGACGGATGACTGCACA AGAGTCGTCAAGGTAGCTGCTTGCTTCAAGAAGGACTCCAGAAAAGAGGGCATAGCACCAGAAG TGGCCATGGTTGAAGCAGTTATCGAAAAATACTGA
3.3氨基酸序列
GOBP1 MWKLVVVLTVNLLQGALTDVYVMKDVTLGFGQALEQCREESQLTEEKMEEFFHFWNDDFKFEHR ELGCAIQCMSRHFNLLTDSSRMHHENTDKFIKSFPNGEILSQKMIDMIHTCEKKFDSEPDHCWR ILRVAECFKDACNKSGLAPSMELILAEFIMESEADK
GOBP2 MFSFLILVFVASVADSVIGTAEVMSHVTAHFGKTLEECREESGLSVDILDEFKHFWSDDFDVVH RELGCAIICMSNKFSLMDDDVRMHHVNMDEYIKSFPNGQVLAEKMVKLIHNCEKQFDTETDDCT RVVKVAACFKKDSRKEGIAPEVAMVEAVIEKY
4讨论
该实验以提取的家蚕触角总RNA为模板,从中获得了编码家蚕GOBP1和GOBP2 基因的cDNA 片段通过RT-PCR 扩增出这两种基因.这种PT-PCR是半定量结果,相对RT-PCR的结果被表示成是对照样品的几倍或百分之几.与聚合酶链反应耦联的反转录(RT-PCR)可以扩增胞内RNA用于分析基因表达.该程序是以RNA转录本为模板,使用逆转录病毒的逆转录酶扩增其互补的DNA,然后通过热稳定的DNA聚合酶扩增cDNA.(本实验用的逆转录酶为TaqDNA聚合酶,效果理想).利用这种方法,使用少量的起始摸板(如少至10～100个拷贝的RNA
转录本),就可以检测到基因的表达.将酶连产物克隆在表达载体PET-30 中,让其在E.coli表达,先让宿主菌生长,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因
结合,从而不能进行外源基因的转录及表达,此时宿主菌正常生长.然后向
培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG,阻遏蛋白不能与操纵基因结合,则DNA外源基因大量转录并高效表达,PCR检测结果如图（3）。本实验在进行RT-PCR时，所用的Taq聚合酶可以分别加入各个体系，效果很好。影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素很多，例如启动子强度﹑SD序列﹑转录中止序列﹑SD序列至起始密码子ATG之间的距离﹑目的基因5’端密码子使用频率﹑宿主菌的种类﹑转录出的mRNA的稳定性及诱导条件等。本实验选用了能在大肠杆菌中高效表达的载体PET－30，并采取了具有较低蛋白酶活性的受体菌。本实验所用的大肠杆菌原核表达系统是基因工程四大表达系统之一，其优点是表达产量高、易于操作且成本低。随着分子生物学技术发展，建立在基因重组手段上的异源蛋白表达系统为获得大量目的蛋白提供了方便。到目前为止外源基因进行原核表达仍然是获得大量目的蛋白的最为有效和使用最广泛的表达系统之一，特别是对于在组织和细胞中含量少且不容易获得的蛋白更是一条最佳途径。将外源基因导入大肠杆菌大量表达蛋白质，是蛋白质定位及功能分析研究的基础。
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14．Paul Z. Liu and Thomas C. Kaufman. (2005).even-skipped is not a pair-rule gene but has segmental and gap-like functions in Oncopeltus fasciatus, an intermediate germband insect, Development 132, 2081-2092
第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45 Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.doczj.com/doc/0f4356905.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹 宜2,刘 波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1 材料与方法 1.1 材 料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2 实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备
实验六、基因克隆及序列分析 1.目的片段回收 取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 μl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 μl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 μl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。 2 片段连接反应 采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 μl PCR产物，加入0.5 μl T4 DNA ligase，0.5μl T Easy Vector，2.5 μl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4?C冰箱过夜。 3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。 取2 μl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 μl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 μl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析 DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82. 氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。 脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。 如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。 在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。 正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。
第14卷第2期2004年4月 江苏大学学报(医学版) Journal of Jiangsu University(medicine) Vol.14No.2 Apr.2004 小鼠GITRL基因的克隆和序列分析 王胜军1,2,马 斌1,仝 佳1,许化溪1,杨胜利2 (1.江苏大学医学技术学院免疫学研究室;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212001) [摘 要] 目的:克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法:采用RT PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18 T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果:扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519bp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。 [关键词] GITRL基因;cDNA克隆;RT PCR;调节性T细胞;小鼠 [中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7783(2004)02-0097-04 Cloning and Sequence Analysis of Mouse Glucocorticoid induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand Gene WANG Sheng jun1,2,MA Bin1,TONG Jia1,XU Hua xi1,Y ANG Sheng li2 (1.Department of Immunol ogy,School of Medical Technology,Jiangsu Universi ty,Zhenjiang Jiangs u212001,China; 2.Li fe Science Institute,Jiangs u University,Zhenjiang Jiangs u212013,China) [Abstract] Objective:To clone and analyze the cDNA enc oding mouse glucoc orticoid induced tumor necrosis fac tor receptor ligand(G ITRL)gene,a type transmembrance protein of the tumor necrosis factor(TNF)su perfamily.Methods:The c DNA of GITR L was amplified from total RNA e xtracted from mouse dendritic cells (DC)by RT PC R and inserted into pMD18 T vector,and the sequence of the DNA was analyzed.Results:The c DNA of GITRL has the length of519bp with an complete open reading frame,which encodes a product of173 a mino acid and shares100%homology with the sequence of mRNA for mouse G ITRL in GeneBank.Conclu sion:The cDNA of G ITRL was successfully cloned,which brought a founda tion for further researching on its bio logical function. [Key words] Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand;cDNA cloning;RT PCR;Dendrit ic cell;Mouse 小鼠GI TR(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor)最初是1997年Nocentini等人[1]在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体,由228个氨基酸组成,富含半胱氨酸的重复结构域,但不含DD结构域(death domain),具有许多TNF 受体超家族的特征,被命名为TNFRSF18,随后人类对应的蛋白也被发现[2]。2003年12月Tone[3]和Kime[4]等人同时发现其配体G ITRL,初步研究结果表明GI TRL具有阻断C D4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫抑制功能的作用。本研究从小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)中通过RT PCR扩增出G ITRL的cDNA,并进行序列分析。 1 材料和方法 1 1 材料 RPMI1640及胎牛血清为Gibc o公司产品,小鼠GM CSF、TNF 为Peprotech公司产品,PE标记抗小鼠H 2Kd单克隆抗体及FI TC标记抗小鼠CD11c单克隆抗体为BD Pharmingen公司产品,Trizol及逆转 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300169)和江苏省社会发展资助项目(BS2000026) [作者简介]王胜军(1969-),男,江苏镇江人,副教授,主要从事免疫调节研究。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET 系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。 [主要试剂] 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 [操作步骤] 1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。 PCR反应体系为： 模板（含R基因的重组质粒）1μl 上游引物PR11μl 下游引物1μl dNTP（2.5mmol/L）5μl 10×PCR buffer（含Mg2+）10μl Taq酶1μl ddH2O补至100μl PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）
进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为： pRSETA1μl R基因片段3μl T4 DNA连接酶（5U/μl）1μl 5×buffer2μl ddH2O补至10μl 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。 4、诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 6 5500rpm 15min 收集细胞