实验双向免疫扩散法
【原理】
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。
【实验材料】
0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制)
巴比妥钠缓冲液(μ=0.05，pH=8.6)：巴比妥钠10.30g、巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg6000 4g，加900ml水加温助溶，待冷，转入1000ml容量瓶内，再加水到刻度，测试pH后装瓶待用。
载玻片
打孔器
微量加样器及塑料吸头
湿盒
抗原：人IgG蛋白
抗体：兔抗人IgG免疫血清
【实验方法】
1）将已溶化的0.8%琼脂糖管放90~95℃水浴箱中平衡温度备用；
2）将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂约4mL，使成厚度约1.5~2mm琼脂板；（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑）；
3）琼脂凝固后，用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型，本次试验采用梅花型。梅花型即七个孔构成一组，孔径3mm，孔距4mm；梅花型打孔可以依据模板。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶的边缘打孔或切角标记。打孔完毕后，将载玻片在酒精灯的火焰上过几遍，可防止漏液。4）免疫血清的稀释：取5只干净的小试管，各加入70μL的生理盐水。取70μL免疫血清加入第一支试管，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:2稀释血清；
再从第一支试管中吸取70μL的1:2稀释血清加入第二只试管中，震荡30秒，使其与生理盐水混匀，即为1:4稀释血清；依次操作，即可得到1:8、1:16、1:32的倍比稀释血清。
4）用微量加样器加6~8μL抗原于中央孔中，周围各孔分别各加6~8μL不同稀释度的免疫血清；注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果；
加样时，不要使样品溢出加样孔。
5）作好标记，放湿盒中，湿盒中垫上干净的纱布，用蒸馏水润湿，置37℃温箱，24h后观察结果。
【实验结果判断】
判断家兔体内所产生的抗体效价，以确定后续试验条件。
项目四单相免疫扩散试验 (Single immunodiffusion test) 【实验原理】 单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。 【试剂和器材】 1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。 2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。 3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。 4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。 5．水浴箱、水平台。 【步骤和方法】 1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。 2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。 3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。 标准抗原孔 待检血清孔 图1-4单相免疫扩散试验 4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。将待检血清用生理盐水1:50稀释。按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。 表1-3 血清稀释表 稀释倍数12.5 25 50 100 200 IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.2 5．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。 【结果判定】 1．精确测量各孔沉淀环直径。 2．绘制标准曲线：以各稀释度参考血清孔的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。以1:12.5~1:200稀释参考血清的沉淀环直径为9、8、7、6、5mm为例制作的标准曲线见图1-5。 3．根据待检血清标本的沉淀环直径，从标准曲线上查出相应的IgG含量，再 乘以血清稀释倍数，即为待检血清中的IgG含量。 【注意事项】 1．由于琼脂厚度和浓度、加样孔的大小对结果有较大影响，条件应予统一。
实验一双向免疫扩散试验 一、实验目的 1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤 2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术 二、实验原理 在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。 三、实验仪器和试剂 1、仪器设备 载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器 2、试剂和材料 （1）生理盐水 （2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解 （3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清 四、实验步骤 1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。 2、打孔： 在凝固的琼 脂糖胶上用 打孔器或吸 嘴按图 1 打 梅花孔（孔径 约3mm，孔距 4mm），用针 头小心挑去琼脂。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。 3、稀释免疫血清：取5 支0.5mL 的离心管，各加入10μL 生理盐水。如图2 所示，取10μL 免疫血清加入1 号管中，吸打使其与生理盐水混匀，即为1︰2 稀释血清；再从1
可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，与相应的抗体相比，抗原分子小（<20pm）,单位体积内所含抗原量多，具有较大的反应面积。为了使抗原抗体之间比例适合，不使抗原过剩，故一般均应稀释抗原，并以抗原最高稀释度仍能与抗体出现沉淀反应为该抗体的沉淀反应效价（滴度）。 免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。 单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h－48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。 双向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。 另外沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。 实验材料 1．材料和试剂 （1）PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液 巴比妥钠10.3 g 巴比妥 1.84 g 硫柳汞100 mg（防腐剂） 蒸馏水加热溶解并定容至500ml （2）1%预复琼脂（或琼脂糖） 1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。 （3）1%琼脂糖凝胶 1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
双向扩散法—抗原分析 【原理】 双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。 【材料】 生理盐水1%琼脂管（每管约4ml） 载玻片 打孔器及打孔模板 微量加样器及塑料吸头 抗体及抗原1、2、3、4、5、6。 湿盒 【方法】 1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。 2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。3．凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。 4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。 5．作好记录，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。 【结果】 说明： （1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。 （2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。 单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）—正常人群IgG正常值检测 【原理】 在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或IU/ml）。 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。 【材料】 1．示教部分： 2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2‰NaN3） 标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产） 参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产）
琼脂扩散实验原理 一、琼脂扩散实验的基本过程 1、实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。 2、材料与试剂 传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉， 生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。 3、实验步骤 （1）．预复琼脂玻板的制备 将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。 （2）．凝胶板的制备 溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。 梅花型： （3）．免疫扩散及结果观察 将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25℃中，一般保温2 4～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。 免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。 如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以 作比较。 4、标本的保存 为了保存标本，可染色处理，步骤如下： （1）用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。 （2）浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。 （3）打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。 （4）用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背
实验七、琼脂扩散试验 一、实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。 二、实验原理 可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。 三、材料与试剂 传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。 四、操作步骤 1、将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml 加入平皿内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固后按如下图方式打孔。（注意打孔完毕要封底） 2、加样。中间孔加标准抗原，外周孔加被检血清及阳性血清（如要测被检血清的效价，外周孔可倍比稀释后依次加入）。 3、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。 结果判断：阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时，受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与阳性对照沉淀线融合。阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。 五、注意事项 1、每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。 2、打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。 六、实验报告 1、说明环状沉淀试验检测结果； 2、画出双向琼脂扩散试验中你所观察到的沉淀线，并对其进行简要说明。 3、思考题 （1）影响琼脂扩散试验结果的因素有哪些？ （2）若试验结果观察不到沉淀线，可能原因有哪些？
实验六双相免疫扩散试验 一．实验目的 1.复习巩固免疫化学的基本知识。 2.熟练掌握免疫扩散法的操作步骤。 二．实验原理 抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，当二者发生特异性反应时，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度
比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。 本实验用于检测免疫成功与否及所产生的抗体的效价，抗体效价以出现明显沉淀线时的抗体的最高稀释度为判定终点。一般来说，当效价≥1:16时（可在1:64以上），即可放血收集血清。 三．实验用品 1.待测血清（抗体）。 2.0.4%BSA（抗原）。 3.琼脂粉、生理盐水。 4.载玻片、吸管、滴管、打孔器、湿盒等。 四．实验操作 1.制备琼脂凝胶：生理盐水配制浓度为12g/L的琼脂，完全溶化至澄清。 2.浇板：将载玻片置于水平台上，吸取琼脂加在玻片上，盖满、平整、无气泡 3.打孔：待琼脂凝固后，按下图打孔。 图1 打孔示意图 4.加样：中心孔加入抗原，1-6孔所加血清的稀释度分别为： 1:1，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，每孔加样10μl。 5.扩散：将加好样的琼脂板放入湿盒中，室温放置1-3d观察结果。 五．实验结果 24h后肉眼观察可见只在1号孔和中心孔之间产生了乳白色沉淀线，其它孔都之间都未出现沉淀线。
图2 扩散结果示意图 六．分析讨论 1．本次实验出现了沉淀线，但是只有1号孔和中心孔之间产生了乳白色沉淀线，其它孔都之间都未出现沉淀线，说明免疫成功，但所产生抗体的效价≥1:1且＜1:8，抗体效价过低，需加强免疫再做鉴定才能作后续实验。 2. 本次实验中的反应为沉淀反应，虽然发生机制与凝集反应基本相同，但 是沉淀反应的沉淀原分子小，单位体积内总面积大，故在定量 试验时，通常稀释抗原。 3．注意事项：①用琼脂浇载玻片时，载玻片必须保持水平位置。打孔时不要将琼脂打穿。 ②每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须 不使样品溢出孔外。加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线 的形成。 ③反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性， 时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。 ④试验前应做预试验，初步确定抗体的稀释度。
实验 8 单向琼脂免疫扩散试验 一、 目的 了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。 原理 将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。 材料 1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白 2. 抗体：抗人IgG抗体 3. 3%琼脂凝胶、 4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。 方法 1. 抗体琼脂板的制备 （1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。 （2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。 （3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。 2. 稀释参考血清和待测血清; （1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。 参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64 IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182 （2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。 3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。 4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。用同样方法吸取10ul已稀释好的待测血清，每份标本加二个孔。 5. 反应将加样的琼脂板平放在搪瓷湿盒中，置37反应24~48h。 结果观察 取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。用标尺测其沉淀环直径并记录。 标准曲线的绘制以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。 待测标本Ig含量的计算 : 以待测标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即得该标本Ig的含量 注意事项 1. 该试验为定量试验，因此，对各种影响因素，如参考蛋白的标准、抗体浓度、琼脂的质量与浓度、免疫板的厚度与均匀程度等，必须严格控制。 2. 制备琼脂板时，温度不宜过高，以免使抗体变性失活，但亦不宜太低，以免使琼脂凝固不均。 3. 稀释抗血清、参考血清和加样时均需用微量加样器，加样量要准确，且每个样品加两个孔。 4. 测量沉淀环直径务虚准确，若有误差，再乘以稀释倍数，则误差可成倍的增加。 5. 标准曲线测定必需同时制作，不可一次作成，长期应用。
实验 9 双向琼脂扩散试验 目的 了解双向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。 原理 将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此，通过双向免疫扩散试验，可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（抗体），可鉴定抗原性物质性或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。主要用于分析抗原或抗体成分定性鉴定；抗原、抗体的纯度以及抗体效价的测定。本实验以检测血清甲胎蛋白（AFP）为例。 材料 1. 1.2%生理盐水琼脂。 2. 待检血清、肝癌病人AFP阳性血清（或脐带血）。 3. AFP诊断血清（抗AFP抗体）。 4. 载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器、吸管等。 方法 1. 琼脂板的制备将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂3.5ml，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器按图打孔，孔径3mm，孔距5mm，挑出孔中琼脂。 2. 加样于中央孔加入AFP诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP阳性对照，2、3、5、6孔分别加入待检血清。（不同样本应更换吸头） 3. 反应将琼脂板放入湿盒内置37温箱中，24h后取出观察结果。 结果观察 观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1、4两孔（AFP阳性血清）与中央孔（抗AFP抗体）之间应出现清晰的乳白色沉淀线。其余各孔 则根据与中央孔之间有无沉淀线的特征判 断结果。如图所示，2孔待检血清标本与中 央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产 生的沉淀线互相融合，则表示阳性；3、5、 6孔与7孔间无沉淀线，为实验阴性。 注意事项 1. 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀 线的形成。 2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。 3. 加样时抗体、阳性血清及每份待检标本应各用一支加样器（或更换吸头），以免混淆，影响试验结
双向琼脂扩散试验 一、实验目的 1、掌握双向琼扩试验的原理和用途 2、掌握双向琼扩试验操作方法 3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线 二、原理 血清学反应： ?凝集反应 ?沉淀反应 ?补体参与的反应 ?中和反应 凝集反应：颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的可溶性性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在，经过一定时间，成肉眼可见的凝集团块参与凝集反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素 沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在条件下，即可形成肉眼可见的沉淀物沉淀物只在抗原抗体比例合适时才出现 补体参与的反应：补体结合试验是根据补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独同抗原或抗体结合的特性，用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合中和反应：针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗
体与病毒结合后可以中和病毒的感染性（病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性）?终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。（中和试验具有很强的特异性，是检测病中和试验具有很强的特异性，毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体）双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散，当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。】
沉淀试验——双向免疫扩散试验 一、目的要求 1. 掌握双向免疫扩散试验的原理和用途； 2. 熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。 二、实验原理 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀线，称为沉淀试验（precipitation）。在生理条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化膜，成为亲水胶体。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化膜变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 如果抗原成分不纯，免疫动物后可以产生针对不同抗原成分的多种抗体，于是就形成多条沉淀线，如图2-1所示。 图2-1双向免疫扩散试验原理示意图 双向免疫扩散试验（double agar immunodiffusion test）：将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔内，由于抗原和抗体各自向四周扩散，故称双向琼脂扩散试验。若抗原
与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合
形成抗原抗体复合物，由于该复合物的体积大于琼脂的微小孔隙，于是不能扩散，并逐步聚集在一起形成白色沉淀线。每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。由于抗原抗体在琼脂内的扩散受到浓度、分子量大小与表面电荷的影响，所以沉淀线可以出现在抗原孔与抗体孔之间的不同位置。当抗体浓度过高时，沉淀线就靠近抗原孔，为前带；相反，则沉淀线靠近抗体孔，为后带。如果抗原与抗体的比例合适，则沉淀线位于两孔中间，为等价带，如图2-2所示。 图2-2 抗原-抗体结合的沉淀带形成原理示意图 三、实验用途： 沉淀试验广泛应用于病毒抗原、细菌毒素或寄生虫抗原等的诊断（图2-3），以及各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定等。 四、材料：
琼脂扩散试验 利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应。琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。 单向琼脂扩散试验是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。 双向琼脂扩散试验是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上，待其凝固后，在琼脂板上打孔，将抗原、抗体分别注入小孔内，使两者相互扩散。如果抗原、抗体相互对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线。双向琼脂扩散法可用来分析溶液中的多种抗原。一对抗原、抗体系统只能形成一条沉淀线，不同的抗原抗体系统在琼脂中扩散的速度不同，可在琼脂中形成不同的沉淀线。本法主要是用于检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺点是需要时间过长，灵敏度不高。 琼脂免疫扩散试验 材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。 操作方法 1．称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。 2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。 3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。 4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6．以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。 7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。结果判定 1．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
沉淀实验——双向琼脂扩散实验 内容提要：利用双向琼脂扩散试验测定不同浓度的鸡传染性法氏囊病病毒抗原药物扩 散速率，观察实验结果并且总结 关键词：双向琼脂扩散试验琼脂凝胶配制制板打孔封底加样稀释抗原响因素 引言： 目的：掌握双向琼脂扩散试验的基本操作和临床应用。 实验原理：琼脂的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移，合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀，沉淀的产生组织抗原抗体复合物的自由运动，沉淀带行程一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允许不同的分子通过。 实验仪器和药品：Nacl、蒸馏水、琼脂粉、电炉、平皿、硫柳汞、打孔器、电子秤、 酒精灯、微量移液器、微量反应板、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）。 实验内容及步骤： 1.琼脂凝胶的配制：取8g Nacl溶解于100ml蒸馏水中，加优质琼脂粉1g，电炉缓 慢加热使之彻底融化。 2.制板：将清洁的平皿置于水平桌面上，每个平皿分别倒入加热融化的1%琼脂约 10ml，使其厚度大约为3mm，注意切勿产生气泡。置于4℃保存（需保存较长时 间时加入1%硫柳汞1ml） 3.打孔：冷凝后打孔，打孔器内径约3mm。按图1在固定的位置用打孔器垂直打孔， 用7号针头挑去孔中琼脂。 4．封底：将琼脂平板置于酒精灯上微微加热，使孔底琼脂微融而封住孔底。 5．加样：用微量移液器在中央孔加入已知的诊断抗原，外周孔加入待检血清，图2。置于37℃培养箱中反应24h，观察实验。注：（加样至孔满为止，不可外溢。待孔内液体渗入凝胶后即可放入温盒中。温盒约37℃，一般保存24-48h，观察抗原抗体产生的沉淀线）