活细胞骨架染色--实时观察3D细胞培养微环境与细胞迁移的互作用
2D细胞外基质(ECMs)的物理特性会影响到细胞的粘附动态和形态,但是3D细胞外基质的局部微环境对细胞的影响却知之甚少。美国的科研人员构建了几种3D胶原基质,研究其微结构的变化对于调节3D状态下的细胞粘附动态和细胞迁移的影响。细胞外基质中有各种成束的纤维会加强局部可粘位点的坚固性,并且可以通过ECM/粘附偶联点增强细胞的粘附稳定性,并且高度柔软的网状联合促进了粘附的收缩力。3D粘附的动力学由局部的ECM的强度和整合素/ECM还有II型肌球蛋的收缩白共同调节。不同于2D迁移,3D的细胞迁移不仅受ECM孔径大小影响。
科研人员需要观察活细胞的在成束的纤维中细胞前沿的突出点的形态变化,和细胞运动的轨迹。使用LifeAct标记细胞的F-actin能够不影响细胞功能和行为的情况下对细胞进行观测。研究人员发现细胞会将细胞前进的边缘沿着成束的纤维长边移动。具有接触导向的作用,这一点在纤维和细胞前进边缘平行时尤为明显。而纤维母细胞在不同的ECM中也显示出了类似的特性,是将纤维拉向细胞自身的同时将伪足向前延伸,并迁移的。
Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions
Andrew D. Doyle,Nicole Carvajal, Albert Jin,Kazue Matsumoto& Kenneth M. Yamada
Nature Communications 6, Article number: 8720 doi:10.1038/ncomms
(一)实验材料
1)细胞: fibroblast (gift from NIDCR/NIH)
2)试剂: LifeAct-TagGFP2 质粒(ibidi,Germany)
Phenol red-free DMEM (Hyclone)
FBS (Hyclone)
L-glutamine (GIbco)
Anti-collagen I ( Millipore,1:200, Cat# ABT-123)
3)仪器:电转仪(Bio-Rad Gene Pulsar TM)
(二)实验步骤
1、LifeAct-GFP转染
使用0.4cm的电击杯,设定电压为170V, 960uFd,持续时间17-22μs。
2、collagen I 预染
●5ml 的3mg/ml的collagen1在室温固化
●之后,胶置于50mM的硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中孵育10min
●室温避光条件下使用灌流管逐渐用含有NHS脂染料的硼酸盐溶液逐渐替换之前的缓冲
液并孵育1小时。
●保持染料一直处于灌流的状态,并且在孵育用TRIS溶液冲洗10分钟,并用PBS冲洗数
小时移除没有结合的染料
●使用200mM的盐酸溶解已凝固的胶知道所有的胶溶解
●以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述胶溶液4小时
实验前,用标记过的collagen I替换2-4%的未标记的collagenI,并和细胞混匀,开始试验。
(三)实验结果
如图所示:表达EGFP-LifeAct的fibroblast(绿色或灰色)在FB4 ECM(红色)中的活细胞成像实验。从时间序列的拍摄结果可以看出,细胞一直是沿着纤维的方向,将actin富集到细胞的丝状伪足(白箭头)中,控制细胞的迁移方向。星号代表了一条胶原纤维起止位置,青色的线作为其位置的参照物表明,细胞是通过将纤维拉向自己的方式来向前移动的。
生物制品生产用动物细胞制备及检定规程Requirements for Preparation and Control of Animal Cell Substrates Used for Production of Biologics 本规程适用于生产和/或检定疫苗等生物制品的细胞培养,其中包括二倍体细胞、传代细胞和原始细胞培养。本规程对这些细胞的性质、质量及安全性检定提出了明确要求。 A 对各类细胞培养总的要求 1 细胞库的建立 来自人或动物的细胞,已经通过全面检定,并得到国家药品管理当局批准,方可用于生物制品生产及检定。 1.1原始细胞库 由一个原始细胞群体,发展成细胞系(株)或经过克隆培养而形成拘泥的细胞群体,通过检定证明适用于生物制品生产及检定。为了保证能持续使用而建立原始细胞库。目的是使得制品每一生产周期,都能提供一个已标定好的相同质量的细胞源。因此,在特定条件下由有一定数量、成分一致的细胞,按一定量均匀分装于安瓿,于液氮或-100℃以下冻存备用,即为原始细胞库。 1.2主细胞库(MCB) 取原始细胞种子,通过相应方式进行细胞传代,增殖一定数量细胞,将所有细胞均匀混合成一批,定量分装安瓿,保存于液氮或-100℃以下备用。这些细胞必须以其自身的特定质控要求进行全面检定,全部合格后即为主细胞库,为建立工作细胞库用。 1.3工作细胞库(WCB) 工作细胞库的细胞由主细胞库细胞传代扩增而来。主细胞库之细胞经传代增殖,达到一定代次水平的细胞,全部合并成一批均质细胞群体,再按要求的细胞数量分装安瓿,保存于液氮或-100℃以下备用。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批产品。此时传代的水平必须在该细胞用于生产限制最高代次之内。工作细胞库细胞,必须按该细胞的检定要求,逐项进行全面检定,合格后方可用于生产。 1.4生产用细胞培养 取出冻存的工作细胞库中一个或多个安瓿,混合后培养,传递一定代次后供生产制品使用。其代次不得超过对该细胞用于生产的最高限制代次。从工作细胞库取出的细胞种子增殖出来的细胞,不再回冻保存和再用于生产。 1.5体外培养细胞龄的计算 二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算,以每个培养容器细胞群体细胞数为基础,每增加一倍作为一世代,即1瓶细胞传2瓶(1:2分种率)再长满瓶为一世代;1瓶传4瓶(1:4)为二
传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、实验准备 器材 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管(1个)、胶头滴管(9个)、离心管(9个)、带塞培养瓶(不定个)、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶,大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶(一)、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌: 种类:小玻璃瓶、弯头吸管、滴管(3个)、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶,细菌过滤器接口管 药品:5%盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml (1)浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5%盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min,水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质,并消除其弱碱性。 (镜头一:实验人员将器皿放进加有5%盐酸溶液的盆内,并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的) (2)刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 (镜头二:实验人员刷洗器皿,使用正规的清洗方法,并烘干,只示范其中2--3种即可,实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法) (3)酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干,以免造成酸浸液稀释,影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作
用,操作过程需戴防护用具。 (镜头三:带好橡胶手套将清洁液加入到盆中,让后进行酸浸,并以字幕的形式显示浸泡时间) (4)冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗,吸管需冲洗10min,器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上,不留任何酸浸液残迹,然后用蒸馏水漂洗2~3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中,烘干后的玻璃器皿要求干净透明,无油烟,不能残留任何有害物质及化学药品等。 (镜头四:自来水冲洗,蒸馏水清洗,烘干一起完成,在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿,只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗,洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干,并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间) (5)包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后,先应严格包装,然后再行消毒灭菌处理,以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 (镜头五:实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范,然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌) (实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法,示范操作步骤,只示范一次即可,在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示)2、橡胶制品清洗消毒 种类:玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法:0.5mol/L NaOH煮沸15分钟,流水冲洗,0.5mol/L HCl煮沸15分钟,流水冲洗,自来水煮沸2次,蒸馏水煮沸20分钟,50℃烤干备
微生物学总结 绪论: 一、名词解释: 微生物:一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些个体微小,构造简单的低等生物。 二、简答、论述: 1、微生物的五大共性: ⑴体积小,面积大;⑵吸收多,转化快;⑶生长旺,繁殖快;⑷适应强,易变异;⑸分布广,种类多。 2、巴斯德和科赫对微生物学的贡献: 巴斯德: ⑴彻底否定了“自生说”。(曲颈瓶实验) ⑵免疫学——预防接种。(鸡霍乱病) ⑶证明发酵是由微生物引起的。 ⑷发明巴氏消毒法。 科赫: ⑴证实炭疽病菌是炭疽病的病原菌。 ⑵发现了肺结核病的病原菌。 ⑷用固体培养基分离纯化微生物。 ⑸配制培养基。 原核生物: 根据外表特征把原核生物粗分为6种类型:细菌、蓝藻(蓝细菌)、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体 一、名词解释: 原核生物:指一大类细胞核无核膜包裹,只存在称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物。 细菌:是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂繁殖和水生性较强的原核生物。 糖被:是包被与某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的透明胶状物质。分为荚膜、微荚膜、粘液层和菌胶团。 芽孢:某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造,称为芽孢。 伴孢晶体:少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时,会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体,称为伴孢晶体。是毒性蛋白,苏云金芽孢杆菌可作为消灭昆虫的菌剂,就是利用了该性质。
菌落:将单个微生物细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面(有时在内层),当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下时,该 细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆,即菌落。 放线菌:一类主要呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。 蓝细菌:一类进化历史悠久、革兰氏染色阴性、无鞭毛、含叶绿素a、藻胆素、类胡萝卜素(但不形成叶绿体)、能进行产氧性光合作用的 大型原核生物。 细菌L—型: 是细菌在某些环境条件下所形成的变异型,是遗传性稳定的细胞壁缺损细菌,在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌 落。 细菌形成L型大多染成革兰阴性。 古生菌的细胞壁:古生菌如产甲烷杆菌、极端嗜盐菌、极端嗜热菌其细胞 壁含假肽聚糖。 中介体:是部分细胞膜内陷、折叠、卷曲形成的囊状物,多见于革兰阳性菌。其功能类似于真核细胞的线粒体,故亦称为拟线粒体 菌毛:许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌菌体表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物,与细菌的运动无关。 产生芽胞的都是革兰阳性菌。芽胞不是细菌的繁殖方式 支原体:一类无细胞壁、能独立生活的最小型原核生物。 支原体特点: 细胞很小,多数直径为250nm,故光镜下勉强可见,能通过细菌滤器。 无细胞壁,G-,形态易变,对渗透压敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。 细胞膜含甾醇,比其它原核生物的细胞膜坚韧。 菌落小,在固体培养基上呈特有的“油煎蛋”状。 以二分裂和出芽等方式繁殖 能在含血清、酵母膏和甾醇等营养丰富的加富培养基上生长。 对抑制蛋白质合成的抗生素(四环素、红霉素等)和破坏含甾体的细胞膜结构的抗生素(两性菌素、制霉菌素等)都很敏感。 衣原体:有细胞壁,但缺肽聚糖,对作用于肽聚糖的青霉素、溶菌酶等不敏感。G- 有核糖体。以二分裂方式繁殖 缺乏产生能量的酶系,须严格细胞内寄生,称“能量寄生物”。 不能用普通培养基培养,须在培养基中加入活的鸡胚等进行活体培养。 立克次氏体:细胞较大,光镜下清晰可见,不能通过细菌滤器。 有细胞壁,G-
细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要:近年来,动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一,动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养,推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词:动物细胞培养技术,生物制药,培养条件,人工培养。 自1885 年,Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点,被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境, 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状,着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国
细胞传代培养的原理及操作步骤 (一)原理:细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 (二)细胞传代培养具体操作 1、细胞:贴壁细胞株 2、操作步骤 1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天最好换液 2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。 5. 去上清液,加入与细胞悬液等量的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒;培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,离心。 3.去上清,加入培养基,吹打,然后移入培养瓶中,用培养基清洗冻存管,清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基,放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期;次日换液。
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分,涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物,用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视,显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展,在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外,随着人类社会经济发展,如果没有基于科技进步的大力开发,能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标,人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展,社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物,只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见,要进行这些产品的生产,无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平,除了获得高生产能力的细胞株外,生物反应器是重要的核心技术,必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中,细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一,以我国生物医药等领域产业化来说,与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看,西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段,细胞工程研究规模已经达到1000L以上,基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下,我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模,100L的培养技术还不稳定,长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样,生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术,它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点: l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目,这些项目有的已购买设备,但需要维修,有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入,需要大量的用于生产的生物反应器,传统生物技术的生物反应器一般体积较大(几十M3到上百M3),而现代生物技术所需的反应器装置体积较小,但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展,迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此,必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场,或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造,这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展,需要性能更高的生物反应器,例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势,如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
实验4 细胞骨架的显示及观察 姓名:李思露 学号:131140040 一、实验目的 1.掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。 2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。 二、实验原理 1.细胞骨架:指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、 细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架,包括微 管(microtubule,MT)、微丝(microfilament,MF)、中间纤维(intermediated filament,IF)。 2.微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约 呈放射状向胞质四周扩散,主要确定膜性细 胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋 白有α和β两种。αβ异二聚体沿纵向聚 合成丝,原丝成环状排列形成微管的壁。微管 不稳定,对低温(冷冻)、高压等物理因素及 秋水仙素(微管断裂剂)等化学因素敏感。紫 杉醇可以和微管蛋白多聚体结合,抑制微管解 聚。 3.微丝:真核细胞内是主要由肌动蛋白(actin)组 成的直径为5~7nm的骨架纤丝。主要分布在细胞 质膜的内侧,作用是确定细胞表面特征、并与细胞 运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白 分为α、β和γ三种类型,不同种类细胞中肌动蛋 白组成不同。肌动蛋白单体为球形,依次连接成链, 两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松 弛素B为微丝断裂剂。 4.中间纤维:直径介于微丝和微管之间(7~11nm)、由多种不同蛋白组成的细胞骨架
(1)了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。 (2)了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响,以便趋利避害。 (3)鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。 6. 显示细胞骨架的常用方法:考马氏亮蓝染色法、免疫荧光染色法、鬼笔环肽标记法。 (1)考马斯亮蓝染色法原理及特点 原理:用去垢剂Triton X-100处理细胞适宜 时间,可以溶解膜脂,并与大部分非骨架蛋白 疏水区结合而将其溶解,剩下的纤维状细胞骨 架蛋白比较稳定而不被溶解,然后用蛋白染料 考马斯亮蓝染色即可显示其结构。 特点:非特异蛋白染色,不能区分微管、微丝、 中间纤维 (2)免疫荧光染色法原理及特点 原理:用TritonX-100处理固定处理过 的细胞,可增加细胞膜通透性,使抗体 能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接 着用荧光素标记的抗骨架蛋白抗体便可通 过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法显示 骨架。 特点:特异显示各种骨架蛋白 (3)鬼笔环肽标记法原理及特点 原理:鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白, 因此,用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示 微丝。 特点:灵敏,能特异显示微丝。 三、 实验材料、试剂及用品 (一) 材料: 洋葱 (二) 试剂 (1)M-缓冲液。 (2)6mM 磷酸盐缓冲液(pH6.8)。 (3)含1%TritonX-100的M-缓冲液。 (4)用M-缓冲液配制的3.0%戊二醛。
培养基的配置:基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置:DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套(2.5小20 d、200 pl> 1ml),酒精灯1盏,液器1台,斜架1台, 酒精喷壶 1 个,酒精棉球缸 1 个,污缸 1 个, 常规耗材:培养瓶(50 cm 2),定量移液管(5ml、10ml),枪头(1ml、200小 10 d),培养皿,6/24/48/96孔板,医用脱脂棉球,保种管 所需试剂:gibco高糖培养基,胎牛血清,双抗,DMSO,胰酶,苯扎溴氨,75% 酒精…… 实验前准备: 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内,用酒精喷壶喷洒实验台面,并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏,首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边,待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内,点燃酒精灯,将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖,分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上,瓶口对准酒精灯,且放在距离酒精灯最近的位置,瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶,瓶口在酒精灯上消毒2-3 次,旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧,把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边,取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次,然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液,悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管,在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上, 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次,悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内,将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放,在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试 剂及污缸等,关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养,旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水,且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h,瓶盖拧紧后拿出培养箱,置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
微生物学与免疫学习题汇总 1.微生物、三大类型微生物、列举6种原核细胞型微生物 2.免疫的概念 3.免疫系统的三大功能 4.抗原的概念 5.抗原的两个重要特性 6.抗原免疫原性的本质 7.抗原特异性:概念、结构基础、抗原表位的概念、类型 8.影响机体对抗原免疫应答的类型和强度的因素 9.抗原的分类 10.非特异性免疫刺激剂 11.抗体与Ig的概念 12.Ig的基本结构 13.Ig的水解片段 14.Ig的血清型 15.Ig的生物学功能 16.人工制备的抗体的特点 17.补体系统的概念及其组成 18.补体三条激活途径的异同 19.补体激活的调节机制 20.补体系统的生物学作用 21.C3的生物学功能 22.细胞因子的概念、共同特点、分类 23.细胞因子的生物学活性 24.细胞因子的受体、细胞因子的临床应用 25.MHC、HLA复合体与HLA分子以及MHC限制性的概念 26.HLA复合体的定位﹑结构及其编码的产物 27.HLA-I﹑II类抗原的分子结构﹑分布和主要功能 28.免疫器官、免疫细胞和免疫组织的概念、分类、功能
29.B淋巴细胞在免疫系统中的角色 30.BCR的胚系基因以基因片段形式存在,如何经基因重排才能编码表达功能性BCR 31.BCR多样性的机制:B细胞的发育阶段,期间的主要事件 32.B细胞表面的主要标志有 33.B细胞的分类 34.B细胞的功能有 35.抗原提呈细胞的定义及种类 36.树突状细胞的表面标志及生物学功能 37.以郎格汉斯细胞为例说明APC在迁移成熟过程中生物学特性的变化 38.外源性抗原及内源性抗原的抗原提呈过程 39.T细胞识别抗原的方式和活化 40.CD4+T细胞介导细胞免疫应答的效应机制 41.CD8+CTL细胞杀死靶细胞机制 42.抗体应答的概念,B细胞对抗原的识别和抗原递呈B细胞的激活机制;免疫应答的规 律;抗体介导的免疫效应 43.B细胞活化的两个信号;黏附分子的作用;免疫力维持的机制 44.BCR介导的信号传导通路 45.TD-Ag 和TI-Ag引起的免疫应答 46.B细胞的记忆的产生和维持及在医学上的意义 47.免疫应答 48.免疫耐受 49.免疫应答的三个阶段 50.T细胞、B细胞、巨噬细胞在免疫应答中的作用 51.体液免疫应答的一般规律 52.免疫调节包括那几个方面 53.超敏反应的概念、分型 54.Ⅰ﹑Ⅱ﹑Ⅲ、IV型超敏反应的特点、发生机制及其常见疾病 55.凝集反应、沉淀反应的定义及其基本类型 56.间接免疫荧光法和ELISA的双抗夹心法及间接法的基本操作步骤 57.检测体液免疫和细胞免疫的常用试验方法
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化,使之重新生长,进入细胞周期,进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后,可进入细胞周期,重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前,水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基,放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温,由液氮中取出冻存的细胞,迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,注意管口处高于水面,以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内,以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞,约1min后冻存管内液体完全溶解,用酒精喷拭冻存管的外壁,立即拿入超净台内。 注:解冻到0度时(即冻存管里还有最后一点冰)立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来,之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液,置于已放入细胞完全培养基的离心管中,吸取1ml培养液加入冻存管,将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次,使冻存液与完全培养基充分混匀,尽量减少冻存液中DMSO 的浓度,减轻细胞损伤。 离心:1000rpm,室温离心3min。 注:细胞复苏后最好等几分钟再离心,因为冻存前加了胰酶消化,对细胞造成一定损伤,复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后,倒掉上清液,缓慢操作,不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基,反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基,细胞悬液加入培养瓶内,左右前后轻轻摇动培养瓶,把细胞摇均匀,将培养瓶放入37℃,5%CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养,换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下,冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大,因此,必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时,需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多,容易忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型,日期,人名。
细胞有丝分裂过程中微丝、微管、中间纤维这些细胞骨架 是如何动态调控的? 有丝分裂,又称为间接分裂,特点是有纺锤体和染色体出现,子染色体被平均分配到子细胞,这种分裂方式普遍见于高等动植物。有丝分裂过程是一个连续的过程,为了便于描述人为地划分为六个时期:间期,以及前、前中期、中期、后期和末期这5个分裂期。细胞骨架是指真核细胞中由微管、微丝和中间纤维组成的高度动态变化的蛋白质纤维网络结构。大量研究结果表明,细胞骨架在细胞周期进程中扮演着重要角色,尤其是微管骨架和微丝骨架直接参与有丝分裂器的组装及胞质分裂的发生。 在讨论微管,微丝,中间纤维这些细胞骨架在有丝分裂过程中的变化前,要明确在细胞分裂过程中,哪些细胞结构由骨架组成。微管主要以纺锤丝存在,变化就是纺锤丝从细胞两极不断延伸,形成动粒微管和极微管,将染色体拉向细胞两极。微丝可以形成细胞分裂环,参与细胞分裂。中间纤维参与核膜中核纤层的构成,变化就是在分裂前期解聚,在末期聚合形成核膜。 1.微管 微管、微丝是分布在细胞质基质中蛋白纤维网架系统,微管是由微管蛋白组装成的长管状结构,在细胞内呈网状或束状分布,参与纺锤体、中心体、神经元轴突等结构。 图1 染色体运动机制示意图 1.1中心体复制 中心体与微管装配和细胞分裂密切相关,由一对位于细胞中央的中心粒和周围的无定型物质构成,中心粒成圆筒状,圆筒壁由9组三联管构成,分α和β微管蛋白,圆筒的周围有γ蛋白等。中心体连同四射的微管构成“星体”。中心体在间期的G1期末开始复制,S期结束,G2期开始向两级分开。 1.2纺锤体组装及分裂极确立
间期时,微管与胞质中可溶性微管蛋白池相对较慢地交换微管蛋白。有丝分裂开始时,间期的微管网络分解,并被新的纺锤体微管群所代替,这种新的纺锤体微管群动态变化速率是间期细胞骨架中的物管动态变化速率的4-100倍[1]。间期复制的中心体在前期由马达蛋白驱使由中间移向两极。然后负责正向运动的马达蛋白将纺锤体拉长,这样两个中心体逐渐分离。当核膜解体时,两对中心粒已到达两极,两对中心粒之间已经形成了完整的纺锤体微管,即在两者之间形成了纺锤体,同时确定了分裂极。 1.3染色体移动 纺锤体主要由中心体发出的微管和微管结合蛋白蛋白组成,每根微管都具有极性,负极的一端插入纺锤体极,正极一端从极处向外伸出,有丝分裂过程中纺锤体能够将姐妹染色单体拉向两极[2]。有丝分裂前中期纺锤体微管向细胞核内部侵入,与染色体的着丝点结合,牵引染色体运动。中期染色体排列到赤道面上,极面观染色体呈辐射状排列。 从中心体发出的微管有三种:动粒微管、极体微管、星体微管。动粒微管,连接在着丝点上,着丝点上具有马达蛋白,负责将染色体牵引到纺锤体上。星体微管,末端结合有马达分子,负责两极的分离,同时确定纺锤体纵轴的方向。极体微管,在纺锤体中部重叠,重叠部位结合有马达分子,负责将两极推开。 图2 纺锤体 1.4染色体的分离 染色体的分离是在微管与马达分子的共同作用下实现的。有丝分裂后期染色体分离过程存在后期A和后期B两阶段的假说,后期A指染色体向两极移动的过程,这个过程中连接染色体的微管在着丝点处去组装而缩短,在分子马达的作用下染色体向两极移动。后期B指两极间距离拉大的过程,这个过程中这个过程中极体微管延长,结合在极体微管重叠部分的马达蛋白提供动力,推动两极分离;且星体微管因为去组装而缩短,结合在星体微管正极的马达蛋白牵引两极距离加大。后期A的可能机制:微管蛋白与动粒蛋白有亲和性,微管的正端与动粒的外层可以直接接触,并在此发生去组装。在分子马达的作用下,驱动微管上的动力蛋白向两极移动,从而带动染色体移动。后期B的可能机制:极性微管由于在正端聚合而延长,这时位于两极的极性微管搭桥处的微管重叠部分的马达蛋白提供动力,推动重叠部分的微管滑动,使两极分离。另外,锚定于细胞膜下骨架上的星体微管也会发生去组装而缩短,使两极距离进一步加大。
《微生物学》试卷 一、名词解释(每题5分,共35分) 1、同步生长: 2、光复活作用: 3、干扰素: 4、朊病毒: 5、鉴别培养基: 6、抗原: 7、抗生素: 二、选择题(每题1分,共10分) 1.下列为选择培养基的是( ) A.克氏双糖铁琼脂培养基 B.动力一吲哚一尿素培养基 C.碱性蛋白胨水培养基 D.葡萄糖发酵管 琼脂培养基 2.不宜冷藏的细菌是( ) A.流感嗜血杆菌 B.百日咳鲍特菌 C.牛布鲁菌 D.脑膜炎奈瑟菌 E.金黄色葡球菌 3.患伤寒病后,带菌者最常见的带菌部位是( ) A.胰腺 B.十二指肠 C.胆囊 D.肠系膜淋巴结 E.直肠 4.结核分枝杆菌常用的染色法为( ) A.吉姆萨染色法 B.革兰染色法 C.抗酸染色法 D.瑞氏染色法 E.金胺O 染色法 5.军团菌的传播途径为( ) A.接触传播 B.呼吸道传播 C.输血传播 D.性传播 E.粪-口传播 6.肺炎支原体的主要致病作用是( ) A.吸附于细胞受体,破坏粘膜细胞 B.内毒素 C.外毒素 D.特殊荚膜抗吞噬 E.入侵粘膜细胞,繁殖后溶解细胞 7.传播流行性斑疹伤寒的媒介昆虫是( ) A.人虱 B.鼠蚤 C.螨 D.蝉 E.蚊 8.噬菌体在医学上的用途,下列错误的是( ) A.用于抗病毒感染的治疗 B.检测标本中未知的细菌 C.用于细菌的分型 D.分子生物学重要的实验工具 E.用于细菌感染的治疗 9.构成菌体成分并在细菌生命活动中占重要地位的盐是 ( ) A.铁 B.磷 C.硫 D.钙 E.镁 10.常用于测量病毒大小的单位是( ) A.纳米(nm) B.微米(μm) C. 毫米(mm) D.厘米(cm) E. 以上都不是 三、判断题(正确的打“√”,错误的打“×”,每题1分,共10分) 1.所有成熟的病毒颗粒均由壳体 + 核心 + 包膜结构组成。( ) 2.有隔多核的菌丝产生帚状分枝的分生孢子梗是曲霉属在形态上的典型特征。( ) 密 线 封 层次 报读学校 专业 姓名
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞,包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。 生产非重组制品所用的细胞基质,系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质,系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产杂交瘤制品的细胞基质,系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。 一、对生产用细胞基质总的要求 用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定,须具有如下相应资料,并经国务院药品监督管理部门批准。 (一)细胞系/株历史资料 1.细胞系/株来源资料 应具有细胞系/株来源的相关资料,如细胞系/株制备机构的名称,细胞系/ 株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。 人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及健康状况及病原体检测结果的相关资料。 动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、 地域来源、年龄、性别、供体的一般健康状况及病原体检测结果的相关资料。 如采用已建株的细胞系/株,应具有细胞来源的证明资料。应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得,且应提供该细胞在该机构的详细传代记录,包括培养过程中所使用的所有原材料的详细信息,如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。 2.细胞系/株培养历史的资料 应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,外源插入序列,筛选细胞所进行的任何遗传操作或筛选方法、在动物体内传代过程以及细胞生长特征、培养液成分等。同时还应具有细胞鉴别、内源及外源因子检查结果的相关资料。
兽医微生物学 绪论及第一章细菌的形态与结构 1、微生物:是存在于自然界的一大群体型微小、结构简单、肉眼直接看不见,必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍,甚至数万倍才能观察到的微小生物。 2、微生物的种类:三型八大类(三菌四体一病毒) ①真核细胞型微生物:细胞核有核膜和核仁,细胞器完整,如真菌。 ②原核细胞型微生物:仅有原始核,无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。 ③非细胞型微生物:是最小的一类微生物。无典型的细胞结构,只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA 或RNA。病毒属之。 3、微生物的特点 ·体积小、面积大; ·代谢能力强,代谢类型多; ·生长繁殖快,容易培养; ·易变异,适应强; ·种类多,分布广。 4、细菌的基本形态 细菌按其外形,主要有:球菌、杆菌、螺旋状菌。 ①球菌 菌体呈球形或近似球形,根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间排列状态不同,可将球菌分为以下几种:单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。 ②杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。 杆菌的形态:短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等;按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等。 ③螺旋菌:弧菌、螺菌。 5、科赫法则 ·特殊病原菌在同一疾病中查见,健康者中不存在; ·该病原菌能被分离培养得纯种; ·该纯培养物接种至易感动物,能导致同样病症; ·自实验感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养。 6、细菌的衰老型或退化型:指在不良环境或老龄期时,细菌会出现与正常形状不一样的个体。若将其重新置于正常培养环境时可恢复正常状态。 7、细菌的多形性:指处于衰老型或退化型状态的细菌即使置于适宜的环境中生长,其形状也与正常的不一致,如嗜血杆菌。 8、菌落:单个细菌在适当的固体培养基表面或内部,经过一段时间培养后,生长繁殖出数量巨大的菌体,形成肉眼可见、有一定形态的群体。可用于细菌的分离、纯化、计数和鉴定。 9、菌苔:各“菌落”相互连接形成一片。 10、细菌活的非可培养状态(VBNC):指细菌处于不良环境条件下,细胞缩成球形,用常规方法培养不能生长繁殖,但仍是活的一种特殊存在形式,在一定条件下可复苏,并仍具毒性。 11、细菌的结构 ·基本结构:细胞壁、细胞膜、细胞质、核体。 ·特殊结构:荚膜、S层、鞭毛、菌毛、芽胞。 12、磷壁酸的功能 ·形成表面抗原决定簇的成分; ·提高膜结合酶的能力(使细胞壁形成负电荷环境,以利于吸附镁离子,维持酶活); ·保证革兰氏阳性致病菌(如A族链球菌)与其寄主间的黏连; ·构成噬菌体的吸附位点。
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程 本规程适用于人用生物制品生产/检定用动物细胞基质,包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产/检定的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。 生产非重组制品所用的细胞基质,系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质,系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产的细胞基质,系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。 一、对生产用细胞库细胞基质总的要求 用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定,须具有如下相应资料,并经国务院药品监督管理部门批准。 (一)细胞系/株历史资料的要求 1.细胞系/株来源资料 应具有细胞系/株来源的相关资料,如细胞系/株制备机构的名称,细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。 人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。 动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。 如采用已建株的细胞系/株,应从具有一定资质的细胞保藏中心获取细胞,且应提供该细胞在保藏中心的详细传代过程,包括培养过程中所使用的原材料的相关信息,具有细胞来源的证明资料。 2.细胞系/株培养历史的资料 应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,是否有外源添加序列,以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检查结果的相关资料。 应提供细胞培养液的详细成分,如使用人或动物源成分,如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、制备方法及质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。 (二)细胞库的建立 细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的、能持续稳定传代的细胞种子。
细胞培养的流程,从购买试剂、分装,到无菌操作、实验、观察的过程? 对于新手来说,细胞培养真是太难了,很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到,因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌,试剂的购买、配制、分装,细胞的分离,无菌操作,培养细胞的观察,实验的设计,及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高,要求非常严格。 如果你正在培养细胞,或曾经培养过细胞,你一定有很多的经验值得大家分享,你一定有你自己的一套培养细胞的流程,从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此,你不妨说说你的细胞培养流程,以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此,我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者! 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错,我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了,解决困难耗费了大量地时间,可惜呀! 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程,作起来不易,要真正详细的写出来示人更难!书上的规范和标准很多,但作起来每人都有自己的方法,适宜就好。 我看还没有人跟帖,我就先说一点,从最初阶段开始:(自己的做法) (一)仪器的清洗 总的分为两大类:可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液(由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液) 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子,离心管等塑料器皿。消毒过程:自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜(不少于6h)----→自来水冲洗15-20遍----→蒸馏水洗3-5遍,烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子,虑器等,先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜,自来水冲洗,5%HCl濅泡三○min,流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存,使用前高压消毒灭菌,我科室主要使用铝制饭盒分装器具,挺方便的,用前高压。 今天暂说一点,以后有机会再续,望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道,现在知道为什么没有别的战士跟贴了么?我怎么也耗了几十分钟打的字,你就这样打击别人的信心,还有可能往后面延续么!再说,经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了,您的抱怨我也接受!并且跟您补上一分! 每个斑竹给分的标准有一定的差别,但是可以肯定的是:我们有自己的加分原则,大原则是不变的!比如:版内讨论得很多的东西,重复发帖一般不予以加分! 您的这个帖子属于改范畴! 感谢您对细胞版的支持!如果有问题可以直接pm我们! 再次感谢!再多说点啊! 呵呵接着说呀,很好,很有帮助,我是新手,要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗: 对于玻璃器皿(如移液管、盖玻片之类)可先用酸液浸泡24h以上,再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍,除去残留酸液,再用双蒸水冲洗3-5遍,彻底洗净后放入不锈钢筒中,双层牛皮纸扎口,高压灭菌20min,烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液(重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL)配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净,临用时再次用清水冲洗3-5遍,再用双蒸水漂洗3次,洗净后瓶口盖上锡箔纸,外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min,与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子,也要在用完后及时洗净、