脑肿瘤动物模型的研究 动物模型是研究肿瘤发病机制和检验各种治疗方法的有力武器，本文就脑肿瘤动物模型的历史发展和应用前景作一综述。 脑肿瘤目前仍是严重威胁人类健康和生命的疾病，而肿瘤实验动物模型的建立为研究其发病机制、生物学特性和检测各种治疗方法提供了一种高模拟性工具。自上世纪以来，先后建立了化学物质诱发脑肿瘤模型、病毒诱发模型、同种以及异种移植模型，随着现代分子生物学技术的发展，转基因动物模型又将成为人们研究的热点。 1.早期脑肿瘤动物模型及其局限性 1．1 自发性脑肿瘤动物模型 脑肿瘤在哺乳动物中的发病率不一，有报道狗为0.1-0.5%，SD大鼠（7803只）为0.44%，但另一组41000只SD大鼠中仅发现38例中枢神经系统肿瘤，在灵长类动物中更为罕见，曾解剖14000只恒河猴和1247只猕猴尸体，未发现一例脑肿瘤[1]。由于发病率低，加之自发瘤的隐匿性及荷瘤动物生存期短的特点，自发瘤模型难以用于临床。 1．2 化学物质诱发模型 早期使用甲基胆蒽注入鼠脑实质内可成功诱发出脑肿瘤，其中大部分为胶质瘤和脑膜肉瘤。在20世纪70年代，开始使用一种合成的致癌物质N-亚硝基脲及其衍生物乙基亚硝基脲（ENU）等进行肿瘤诱发实验。Kostener[2]等将50㎎/㎏的ENU给受孕20天的大鼠一次性静脉注射后，子代中均出现了中枢神经系统肿瘤，但ENU对成年鼠诱发脑肿瘤率较低。亚硝基脲类物质诱发的脑肿瘤在部位、类型、诱导时间以及恶性程度等方面均有很大差异。 1．3病毒诱发模型 由于发现病毒与脑肿瘤的发病存在一定的关系，一些学者试图使用病毒进行脑肿瘤诱发实验，核糖核酸病毒（Rous肉瘤病毒）和脱氧核糖核酸病毒（腺病毒）均可诱发脑肿瘤。Bigner[3]等把浓缩的Rous肉瘤病毒（0.01ml）注射到一种新生犬脑内，经一段潜伏期后全部发生胶质瘤或肉瘤，而且在动物体内并未发现子代病毒，这说明病毒的致瘤机理可能与其复制无关。中国生物治疗网https://www.doczj.com/doc/031726087.html,杨教授特别指出，肺癌的早期症状也有人将AD12病毒直接注入到出生后24小时的鼠脑实质内，经过数月的潜伏期后就能发生脑肿瘤，其中大部分为髓母细胞瘤。Tabuchi[4] 则把感染Rous病毒的纤维母细胞接种到猴的右额叶内，73%发生了肿瘤，主要是肉瘤。病毒诱发的脑肿瘤可在同种动物中连续传代，经过克隆后可制成生物特性稳定的模型，但其致瘤周期不一，诱发瘤性质差别较大，而且病毒不宜保存，对人也有一定的伤害作用，从而限制了其应用。 2．脑肿瘤移植模型 同种移植模型较多用于胶质瘤的研究。将诱发的鼠脑胶质瘤进行体外细胞培养，形成稳定的细胞系，如C6，9L，BT4A等，再将这些细胞植入同种大鼠脑内，可得到同种移植胶质瘤模型。脑肿瘤同种移植模型虽能提高肿瘤的模拟性和统一性，但动物脑瘤与人脑瘤相比，在遗传学、细胞动力学和生物学方面均存在显著的差异，因而人们将目光更多地投向脑肿瘤异种移植模型。 由于免疫排斥反应的存在，早期多将肿瘤移植于动物免疫缺陷区，如豚鼠眼前房、仓鼠颊囊、兔角膜和鸡胚绒毛膜等，还有学者采用药物、X线照射等方法抑制动物免疫反应[5]。直到1968年由于免疫缺陷动物的发现，才真正开创了脑肿瘤异种移植动物模型的时代，这些动物包括T淋巴细胞功能缺陷的裸小鼠、裸大鼠，B淋巴细胞功能缺陷的CBA/N小鼠以及T、B淋巴细胞联合缺陷的Lasat小鼠、SCID小鼠等。目前对于脑肿瘤移植的方法还存在不同意见，主要包括：脑内移植、肾包膜下移植和皮下移植。脑内移植最接近肿瘤的人体生长环境，但其操作复杂，动物感染及死亡率高。近来有学者[6]采用立体定向技术将浓缩的肿瘤
（1）丁香园总结： 瘤子长不出无非两方面原因，老鼠或者细胞。关于裸鼠，楼上已有描述，接种部位和接种年龄。一般来说，左侧前肢靠近心脏，血供会比较丰富，容易生长新血管。 虽然文献都报道在腋窝注射，但如果局部皮下组织致密，会相对容易形成浓聚的小包块，容易达到有效的细胞浓度。裸鼠周龄不要小于四周，否则动物可能不能耐受，过 早死亡，也不可大于六周，否则免疫力会增强，不容易形成肿瘤。如果以上都不能成瘤，实验室之前又没有固定protocol，动物可以尝试NOD/SCID。细胞数量每个细胞株不同而有不同剂量，恶性程度高，有些胶质瘤，4次方就已经足够了，有些难长的， 恐怕7次方都嫌不够。但一般达到2×10的7次方就不能再往上加，因为细胞悬液已 经达到饱和状态，再往上增加细胞可能在注射时针管会对细胞有物理损伤。细胞悬液 大概是一个注射点150微升左右。另外，还可以添加matrigel，理论上可以促进成瘤。 裸鼠种植瘤需注意： 1、肿瘤细胞的状态 2、细胞的数量:每只注射 2X106-107 3、裸鼠的选择：5-8周龄 4、种植部位：血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。 （2）具体操作解析： 1、能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问题，但最高不要超过 1*107 2、接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1 小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错 的 3、成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也 不大好摸出来。
人胃腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 动物：／c(／)裸小鼠，鼠龄6～1 0周，体重l5～25 g，雄性。饲养在无特殊致病菌、空气洁净的净化工作台内，室内恒温、恒湿，定期消毒。笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸气灭菌，并在无菌条件下适时更换。 方法：收集培养的823细胞(癌细胞在含10% 小牛血清的1640 培养液中，于2恒温孵育箱中培养，常规传代。)在细胞培养至对数期时，用1640制成约2×l07个／细胞悬液，取0．2(4x106个823细胞/只)注入裸小鼠颈部皮下或者背部皮下，每组接种3只鼠，当皮下移植瘤长至直径为l 3左右时取出移肿瘤（大约在10d左右），及时放入含无血清培养液的平皿中，A再在超净工作台内修剪肿瘤组织，去除脂肪，结缔组织及坏死肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤2次，将瘤组织切成约l ×l ×2的小块，加入适量的备用。 以戊巴比妥经腹腔注射麻醉裸鼠，常规消毒背部肩胛区，（切开局部皮肤）用无菌套管针抽吸准备好的23大小瘤块，将其接种于裸鼠背部肩胛区皮下，建立祼鼠皮下移植的人体胃癌祼鼠模型。作鼠间传代(2只／代)。 移植瘤生长特性：胃癌细胞接种后的第三天即可见到裸鼠接种处皮下出现结节，直径约1．5，质地较硬，在以后的几天中，上述皮下结节没有继续增大，此阶段为肿瘤细胞生长的潜伏期(7-10d左右)。随后，裸鼠皮下的肿瘤结节开始缓慢生长．体积逐渐增大。大概(25-30d)传代后荷瘤鼠皮下移植瘤的生长情况与初代移植瘤相近。 A具体操作： 1一般要求 需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后，用新吉尔灭(1∶1000)或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因，应予注意在高温季节操作时，应注意降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。 常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位；肌肉接种则用大腿肌肉；腹水型接种于腹腔。2瘤块的制备 接种用的瘤块应选择接种后7－10d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤(消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内，剪成2－33的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其它营养液，以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块，接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短，从一个瘤块所取的材料一般应在30内接种完。 3瘤细胞悬液的制备 如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种。具体方法为，在无菌操作下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1∶3－1∶4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2。整个操作应在30内完成。 停止给予受试物之次日(或停止给予受试物后1－5d)处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重。如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。应当减少剂量重新试验。
SMP-QC-01-022 1.目的：为了加强原料药杂质管理，确保上市药品质量。 2.适用范围：本公司生产的原料药产品。 3.责任者：QC、QC负责人、QA负责人、质量受权人。 4.内容： 4.1杂质的定义及分类 4.1.1定义：任何影响药品纯度的物质均称为杂质。。 4.1.2分类： ?按化学特性分类：有机杂质、无机杂质、有机挥发性物质。
SMP-QC-01-022 ①有关物质 -起始原料 -中间体、畐寸产物 -降解产物 -聚合物 -异构体 ②多晶型杂质 (2 )无机杂质 -无机盐 阴离子 阳离子 -重金属催化剂 -过滤介质、活性炭 (3 )有机挥发性物质 残留溶剂 ?按来源分类：有关物质(反应前体、中间体、副产物、降解产物等) 、其它杂质、外来物质。 ?按结构分类：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物。 4.2杂质的检测方法 ?原子吸收分光光度法：检查金属杂质 ?毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两
个特定杂质 SMP-QC-01-022 ?色谱法：液相色谱法，检查有机杂质的主要方法 薄层色谱法，作为液相色谱法的补充 气相色谱法：检查挥发性杂质 ?热分析法：检查不同晶型的杂质（影响生物利用度和稳定性） ?拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射 ?生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量） 4.3杂质的控制 431残留溶剂控制 ?标准起草过程中，应针对所用到的有机溶剂进行检查； ?建议采用了顶空进样方式和程序升温梯度洗脱的方法； ?应注意供试品溶液的配制，要求供试品在溶剂中溶解； ?方法学试验应进行回收试验，确认是否有基质干扰； ?采用标准加入法，该方法可减少基质干扰，提高方法的准确度。 4.3.1.1残留溶剂检测的常见问题 ①共出峰干扰 ②热降解干扰 ③基质效应的影响 ④药品溶解性的影响 ⑤溶剂介质的影响
厄洛替尼二线单药治疗肺癌36例疗效观察 王森，李琦，陈运芳 驻马店市中心医院肿瘤科，河南驻马店463000 摘要：目的观察厄洛替尼（特罗凯）单药治疗晚期肺癌的疗效及不良反应。方法36例晚期非小细胞肺癌一线化疗失败患者口服厄洛替尼150mg/d至肿瘤进展或出现不可耐受的不良反应，评价其近期疗效、不良反应及生活质量、无进展生存期及总生存期。结果36例患者中PR8例（22.22%），SD15例（41.66%），PD13例（36.11%），有效率（CR+PR）为22.22%；疾病控制率（CR+PR+SD）为72.22%。肿瘤进展时间为2 11个月，中位无进展生存期为5.9个月；中位生存期为11.6个月。主要的不良反应为皮疹、皮肤瘙痒、恶心、腹泻，多为Ⅰ Ⅱ度，对症处理后可缓解。结论厄洛替尼单药二线治疗非小细胞肺癌疗效好、不良反应轻。 关键词：厄洛替尼；二线；非小细胞肺癌 中图分类号：R734．2文献标识码：B文章编号：1672-3422（2012）07-0098-02 目前铂类与紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨等第三代化疗药物两药联合已经成为晚期非小细胞肺癌标准一线化疗方案，但大多数晚期非小细胞肺癌患者在初次化疗后病情进展，因此二线治疗方案已经成为目前研究的焦点。厄洛替尼是一种小分子表皮生因子受体酪氨激酶抑制剂（EGFR/TKI），对HERl/ EGFR有选择性抑制作用，已被多个国家批准用于进展期NSCLC的二线治疗［1］。2009至2011年驻马店市中心医院肿瘤科应用厄洛替尼晚期非小细胞肺癌患者36例，取得较好疗效，报告如下： 1资料与方法 1．1资料本组非小细胞肺癌患者36例，均为2009至2011年驻马店市中心医院肿瘤科应用一线治疗失败的晚期非小细胞肺癌，男21例，女15例。年龄46 78岁，中位年龄68岁。其中ⅢA期6例，ⅢB期13例，Ⅳ期17例，均经病理组织学和（或）细胞学检查确诊。其中腺癌25例，鳞癌11例。1．2治疗方法应用厄洛替尼150mg/d，饭前1h 口服。连续服用直至发现肿瘤进展或者出现患者不可耐受等不良反应。 1．3疗效及毒性评价标准近期疗效参照WHO 关于实体瘤评价标准统一进行制定，分为完全缓解（CR），部分缓解（PR），稳定（SD）和进展（PD）。毒性反应按WHO关于急性与亚急性毒性反应评价标准分为0 Ⅳ级。临床受益反应（CBR）标准：止痛药用量减少50%，疼痛程度减轻50%，体力状况评分改善≥20分，体重增加≥7%；持续4周以上的临床改善，并且无任何一项指标恶化。采用欧洲癌症研究和治疗组织简体中文版的生活质量调查核心问卷QLQ－C30和肺癌专用问卷QLQLCl3对生活质量和症状进行评价。2结果 2．1近期疗效36例患者中PR8例（22.22%），SD15例（41.66%），PD13例（36.11%），有效率（CR+PR）为22.22%；疾病控制率（CR+PR+SD）为72.22%。肿瘤进展时间为2 11个月，中位无进展生存期为5.9个月；中位生存期为11.6个月。2．2生活质量及症状缓解治疗后全身症状（乏力、食欲、睡眠、疼痛）改善超过50%，其中乏力改善最显著（70%）。肺癌相关症状（咳嗽、呼吸困难、胸痛、咯血）改善超过50%，其中咳嗽改善最显著（64.3%）。症状改善时间均在用药1个月内，以第1、2周为主。生活质量改善超过50%。 2．3不良反应主要的不良反应为皮疹及消化系统反应，36例患者均未发现有骨髓抑制和外周血像改变。1例患者用药后第8周发现间质性肺炎，轻度呼吸困难，予大剂量皮质激素及头孢他啶抗感染治疗后症状缓解。 3讨论 近年非小细胞肺癌的二线治疗越来越受到关注。厄洛替尼为喹唑啉胺于2007年3月在中国上市，商品名为特罗凯，它与表皮生长因子受体酪氨酸激酶区ATP结合的亲和力高、特异性强。检索近年大样本量随机对照研究显示：厄洛替尼用于既往已化疗失败的非小细胞肺癌患者，中位生存期为6.7 8.2个月，无疾病进展生存期为9.9 12.1周，RR 率8.9 12%，DCR率35% 40%。目前发现不吸烟、女性、腺癌，特别亚洲人群和肺泡癌患者为厄洛替尼的优势获益人群［2－3］。 本组36例患者的治疗结果提示厄洛替尼可能更加适合国人。此外本组试验还证实厄洛替尼对患者咳嗽、咯血、胸痛和气促等症状方面均有好的 · 89 ·医药论坛杂志2012年7月第33卷第7期J Medical Forum Vol．33No．7July2012
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用 王全凯1，杨全会2，郭静2，谢广云1，崔涛1，许荣焜2，许建宁1* 1. 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050 2. 中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005 摘要：目的建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物制剂疗效的观察。方法将人原发肝癌手术新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌组织裸鼠移植瘤动物模型；于同体移植后第15 天连续ig给予长科制剂（CKBM），通过观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，测定瘤体体积和质量、抑瘤率以及进行组织病理学观察，初步评价CKBM的抗肿瘤疗效。结果人肝癌组织裸鼠移植瘤保持了人肝癌组织特性，并能通过同体移植传代；观察发现CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤率达45.71%，对癌细胞生长有一定的抑制作用。结论在成功建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型基础上，观察发现CKBM具有一定的抗肿瘤疗效。 关键词：肝癌；裸鼠；移植瘤；动物模型；抑瘤率 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0398 - 05 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.018 Establishment and application of implantation model of human hepatocellular carcinoma in nude mice WANG Quan-kai1, YANG Quan-hui2, GUO Jing2, XIE Guang-yun1, CUI Tao1, XU Rong-kun2, XU Jian-ning1 1. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 2. Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China Abstract:Objective The human hepatocellular carcinoma model was established by implantation in BALB/c nude mice. Its characteristics were certified in the model which was used for the observation of antitumor efficacy. Methods Human hepatocellular carcinoma were sc implanted to BALB/c nude mice for the establishment of the implantation model of the human hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice. The nude mice were exposed to the pharmaceuticals from CK Life Sciences Limited by ig on day 15 after the implantation to find out its healing efficacy through the animal reflecting, the occurring time, volume, weight of tumors, the rate of tumor inhibited, and pathological histology. Results The characteristics of human hepatocellular carcinoma could be kept with passaging by autograft. The tumor inhibiting rate of the pharmaceuticals was 45.71%, showing the certain inhibitory effect on growth of tumor cells. Conclusion A certain antitumor efficacy of the pharmaceuticals made by CK Life Sciences Limited is found out on the basis on the human hepatocellular carcinoma model in nude mice established successfully. Key words: hepatocellular carcinoma; nude mice; implanted tumor; animal model; tumor inhibitory rate 人类肝癌的基础和临床实验研究多数都借助于实验动物模型。目前，以人肝癌组织移植裸鼠建立的动物移植瘤模型是最接近人类肝癌的整体实验模型，是肝癌基础和临床实验研究理想的动物模型。人肝癌组织裸鼠移植瘤模型是指把人肝癌组织块接种于裸鼠皮下建立的实验动物模型，常用于筛选抗肿瘤药物和制剂、实验性治疗和抗肿瘤机制研究[1]。基于为肝癌实验和临床研究以及药物筛选提供体内实验系统的目的，本研究建立了人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物长科制剂（CKBM）疗效的观察。 1材料与方法 1.1实验动物 BALB/c（nu/nu）裸小鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。饲养于中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学部 收稿日期：2013-06-03 作者简介：王全凯（1977—），男，北京人，主管技师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132199 E-mail: kylewang@https://www.doczj.com/doc/031726087.html, *通信作者许建宁，硕士生导师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132592 E-mail: jnx999@https://www.doczj.com/doc/031726087.html,
文章编号:100025404(2003)0420287204论著人CHG25胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析 徐承平,卞修武 (第三军医大学附属西南医院病理学研究所,重庆400038) 提 要:目的 建立人脑胶质瘤裸鼠脑内原位移植动物模型并探讨其生物学特性。方法 采用瘤细胞悬液接种法,将人脑CHG25胶质瘤细胞接种于裸鼠大脑实质内。分别于接种后8、14、19、24和30d处死动物并行病理检查、胶质纤维酸性蛋白免疫组化、染色体核型分析及透射电镜检查。结果 肿瘤移植成瘤率为100%,肿瘤生长稳定,肿瘤病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型。结论 本移植瘤模型能作为研究胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。接种后14d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。 关键词:胶质瘤;动物模型;原位移植;裸鼠 中图法分类号:R2332;R732352;R730.264 文献标识码:A Establishment of orthotopic implantation model of human CHG25glioma cell line in nude mice and analysis of its biological features X U Cheng2ping,BI AN X iu2wu(Institute of Pathology,S outhwest H ospital,Third Military Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o establish an orthotopic im plantation m odel of human glioma in nude mice and investi2 gate its biological features.Methods The human CHG25glioma cells were inoculated into brains of nude mice.The animals were sacrificed at day8,14,19,24and30after inoculation.The tum ors were examined with light micro2 scope,electron microscope,kary otype analysis and immunohistochemical stain for glial fibrillary acidic protein.Re2 sults G liomas were formed in100%in nude mice,and the growth of tum ors was stable.The tum ors showed the m orphological of human glioma with the immunophenotype.Conclusion The glioma m odel in nude mice is a reliable animal m odel for the study of the tum origenesis and biological characteristics and therapy.The14th day af2 ter inoculation might be suitable for experimental study. K ey w ords:glioma;animal m odel;orthotopic im plantation;nude mice 恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一,其侵袭性强、发病率高、位置特殊、预后差,严重威胁着人类健康。建立一个可靠的胶质瘤异种移植瘤模型,是研究胶质瘤生物学特性和各种体内实验研究的基础。近年研究表明,肿瘤的原位移植(Orthotopic im2 plantation)动物模型是目前最为理想而可靠的肿瘤模型[1],但在脑部进行胶质瘤的原位移植瘤实验难度较大。为此,我们采用本室已建立的人脑恶性胶质瘤细胞系CHG25细胞接种于免疫缺陷动物裸鼠脑内,建立了一种人脑胶质瘤原位移植动物模型。 1 材料与方法 111 胶质瘤细胞来源及培养 人脑间变性星形细胞瘤细胞系CHG25由本室建立[2],按本 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970268) 作者简介:徐承平(1972-),男,重庆市涪陵人,硕士研究生,医师,主要从事肿瘤诱导分化治疗和血管生成方面的研究。电话:(023)68752246 通信作者:卞修武,E2mail:bianxiu wu@https://www.doczj.com/doc/031726087.html, 收稿日期:2002203212;修回日期:2002208209室常规方法培养,即用含10%小牛血清(河南郑州产品)的RP2 MI1640(Hyclone公司)完全培养基,另添加适量HEPES、双抗(100UΠml青霉素及100μgΠml链霉素)、3%谷氨酰胺,置37℃、5%C O2混合气体孵箱中培养,细胞换液时间为1～2d,每3～5d传代1次,传代前用0125%胰酶消化。 112 瘤细胞悬液的制备 取对数生长期的单层培养CHG25细胞以0125%胰酶消化,收集细胞,离心去上清,用无菌生理盐水离心洗涤2次,将细胞悬浮于生理盐水中,台盼蓝染色细胞活力测定大于90%,并进行细胞记数,调整细胞浓度为2×106Πml,置于冰上备用。接种细胞量1×104Π只。 113 实验动物和接种方法 使用本校实验动物中心引进的近交系雌性BA LBΠc nuΠnu 无胸腺裸小鼠14只,体重15～20g。鼠龄5～7周,饲养于SPF 级无菌净化室内。接种部位为裸鼠右侧大脑尾状核。整个接种过程在层流超净台中进行。裸鼠经1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,俯卧位固定头颅,75%酒精消毒头顶部皮肤后,接种部位的确定参照文献[3]并作适当修改,即在裸鼠额部距颅中线右侧215mm,冠状缝前1mm处先用直径为1mm的牙科钻小心钻穿颅骨,然后用吸有5μl瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑实质中,进针深度为针尖距颅骨表面315mm,注射前 782 第25卷第4期2003年2月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.25,N o.4 Feb.2003
吉非替尼、厄洛替尼治疗非小细胞肺癌疗效、不良反应及药物经济学比较石磊 发表时间：2019-08-13T10:21:20.080Z 来源：《健康世界》2019年7期作者：石磊 [导读] 目的：研究比较吉非替尼、厄洛替尼治疗非小细胞肺癌疗效、不良反应及药物经济学学。 石磊 北京四季青医院药剂科 100089 摘要：目的：研究比较吉非替尼、厄洛替尼治疗非小细胞肺癌疗效、不良反应及药物经济学学。方法：选取2016年至1月至12月在我院接受治疗的100例非小细胞癌患者（NSCLC），随机分为A组和B组，A组服用吉非替尼，每天250mg，B组服用厄洛替尼，每天 150mg。比较两组患者的治疗疗效、不良反应，并进行药物经济学的比较。结果：两组患者的治疗疗效和不良反应无明显差异，不具有统计学意义（P＞0.05），对比两组药物治疗费用和费用疗效比差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。结论：吉非替尼、厄洛替尼对NSCLC患者的治疗疗效相当，不良反应发生率相当，但吉非替尼比厄洛替尼花费更少，减少患者的经济负担。 关键词：吉非替尼；厄洛替尼；非小细胞肺癌；比较 目前，我国肺癌的发生率有逐年增高的趋势，肺癌也成为临床治疗中最为常见的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌是肺癌中比较多的癌种，在临床中常见的治疗方法是应用靶向药物进行治疗，其中表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药（ECFI-TKI）吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）最为常用。本次研究选取了在我院接受治疗的100例非小细胞癌患者，研究对比了两种药物的疗效和不良反应发生情况，并进行药物经济学评价，来为NSCLC患者找到即有效又经济的治疗方案。 1资料和方法 1.1 临床基本资料 本次研究选取2016年1月至12月在我院接受治疗的100例非小细胞肺癌患者，随机分为A组（n=50）和B组（n=50），A组服用吉非替尼，B组服用厄洛替尼。吉非替尼商品名易瑞沙，批准文号：H20040767，为阿斯利康制药有限公司生产；厄洛替尼商品名特罗凯，批准文号：H20060108，美国Schwarz Pharma公司生产。A组患者中男性23例，女性27例，年龄36-78岁，平均年龄（57.12±4.13）岁，鳞癌16例，腺癌28例，其它6例；B组患者中男性24例，女性26例，年龄35-79岁，平均年龄（57.82±2.73）岁，鳞癌16例，腺癌27例，其它7例，对比两组患性别、年龄、癌型差异，无统计学意义（P＞0.05）。本次研究入选患者均符合《美国国家综合癌症网非小细胞临床肺癌临床指南中》对非小细胞肺癌的诊断标准[2]，接受过至少一个疗程的放化疗，且这一个疗程距本次研究开始超过一个月，并排除其它恶性肿瘤的存在。 1.2 方法 A组每天口服吉非替尼，每次250mg，每日一次，服药时间为每天早上；B组口服厄洛替尼，每次150mg，每日一次。服药时间均为每天早上饭后2h服用，直到疾病进展或出现不能耐受的反应。 1.3 评价指标 临床疗效评价：完全缓解，病灶缩小≥75%，且维持时间大于4周；部分缓解，病灶缩小≥50%，且维持时间大于4周，稳定，病灶缩小≥25%，且维持时间大于4周，进展，病灶缩小＜25%，有效率=（完全缓解+部分缓解）/总病例数。 药物经济学评价，本组仅药物资料费用不同，所以本次研究仅计算药费。治疗费用=治疗药品的费用+缓解不良反应药品的费用，费用疗效比=治疗费用/有效率。 1.4统计学方法 所有数据均采用SPSS20.0进行分析，计数资料（%）表示，X^2检验；计量资料应用平均值±，标准差（x±s），计量资料组间比较采用独立样本t检验。差异具有统计学意义（P＜0.05）。 2结果 2.1临床疗效对比 两组患者有效率无明显差异，不具有统计学意义（P＞0.05）。详见表1 3讨论 肺癌是我国肿瘤死亡原因的第一位，严重威胁着人们的生命安全。非小细胞肺癌可细分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等几种，其生长较为缓慢，扩散相对较慢，但发现时一般处于中、晚期，5年生存率很低[3]。 吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）是临床中使用较为广泛的靶向抗癌治疗药物，与传统的抗癌药物相比，效果更显著，且副作用更低[4]。吉非替尼和厄洛替尼的主要不良反应为消化道反应（主要为腹泻）和皮肤反应（瘙痒、皮疹、皮肤干燥），且反应较为平
1.细胞准备： 1.1用PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次， 然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得200μL 悬浮液里面含有1×107个细胞。总共需要细胞: 18（只）*200ul*1.2=4.32ml×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。 2.裸鼠准备： 2.1 3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞1×107/200μ L。每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2 )/2(D表示肿瘤的长径, d 表示肿瘤的短径)。（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G） 2.2 当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。对照组，TO901317组，DADS组。 每天（每天给药？会不会太频繁？可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有TO901317 的蓖麻油200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。连续注射两周。（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了） 腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。 2.3每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。照相结束后，用剪刀将每个肿瘤分成 3 份，一份用来提取总RNA，一份用来提取组织内总蛋白质，这两份组织放到冻存管里，冻于液氮罐中，第三份用来做免疫组化，因此，该样本须置于4%的多聚甲醛（有毒，小心配置）固定剂中进行固定。 备注： 1. 裸鼠饲养情况裸鼠有专门的SPF饲养动物房，买裸鼠前动物住的盒子、垫料、水和饲料要消毒。提前准备好，一般送裸鼠的单位会配备专门的SPF箱子，接到裸鼠后在专门裸鼠动物房进行交接。这个有个通风台也要提前消毒预备好。裸鼠到达目的饲养地后一般是饲养1-2周才开始试验，这也是国际上的通行规定。盒子要每2-3天消毒一次，根据裸鼠的排泄情况而定，所以要有替换的盒子。一般来说各个医院的动物房这些盒子比较紧缺，需要提前计算好。别到时候需要更换的时候找不到盒子。 2.动物接种数量根据你离心后细胞计数的数量。然后是用多少的液体稀释，一般是PBS。如果你培养后经 过离心收集到的细胞总数是1*108次方。也就是10*107次方/5×106个= 20个。那你可以稀释到4ml，每次给予0.2ml，正好可以接种20只裸鼠。根据肿瘤细胞的类型和你所给予的干预情况，一般接种3周瘤子可以达到0.5-1.2cm左右。 用左手揪起来一块皮，然后在揪起来的皮和身体之间那里注射，就是皮下而不是皮内了 先把针头插进去，然后挑起来，看清楚不是体内而是皮下，也没有戳穿皮肤，然后再开始注射 裸鼠的皮皱皱的，很容易揪起来一块，如果不麻醉就是用手拎着注射针头很容易戳到别的地方 放在4度30~40分钟对细胞活力影响不大。用哪种液体悬浮细胞也都行，用无血清培养基效果可能会好一点点。 应该是用PBS或HANKS液处理的,建议不要用无血清培养基或者其他培养液.里头成分复杂: 1,虽然裸鼠免疫缺陷,但是培养基成分复杂,有时还会有致敏原什么的,引起不必要的麻烦. 2,只要能够维持一定的渗透压,持续一个小时肯定是没有问题的,这点PBS或HANKS液就够了,而且影响因素少. 裸鼠对于实验环境又很敏感，特别是在给予药物处理之后。 不知道大家给药的灌胃器或注射器是否消毒？药液是否无菌过滤？ 3、操作是否严格
原料药质量研究中无机杂质的控制 审评三部审评五室傅萍蒋煜 20060418 摘要：通过对药物无机杂质的引入途径、种类以及控制方法的讨论，以期申请人关注对原料药无机杂质的研究。 关键词：质量研究无机杂质 任何药物的非己成分均为该药物的杂质，按理化性质一般可将杂质分为三类：有机杂质、残留溶剂及无机杂质。目前申请人在研究过程中多将注意力集中在有机杂质和残留溶剂考察上，容易忽视对无机杂质的考察。由于无机杂质对药物的有效性、纯度、安全性等具有一定影响，应给予一定的重视。 一、引入途径和种类 无机杂质多由生产过程中引入，在贮存过程中引入的可能性相对较小，一般包括以下几种途径：1、起始原料引入，特别是复杂的原料（有机物），可从该起始原料的合成路线、中间体检测报告得出信息；2、反应过程中的副产物或未反应完全的试剂，如：钠盐、硫酸盐、氯化物、硫化物等；3、生产过程所用的金属器皿、管道以及其他不耐酸、碱的金属工具，则可能引入砷盐，以及铅、铁、铜、锌等金属杂质。 从上述过程来看，无机杂质一般是已知和确定的，包括试剂、配位体、催化剂、重金属、无机盐、其它杂质（例如：过滤介质、活性碳等）。按性质可分为信号杂质（或指示性杂质）和有害杂质。信号杂质本身一般无害，但其含量的多少可反映药物的纯度水平，如氯化物、硫酸盐；有害杂质对人体有害，可在体内蓄积，主要指砷盐、重金属等。下表是ICH和美国药典对杂质种类的划分以及进一步细分。
表一：ICH和美国药典对杂质种类的划分以及进一步细分 二、杂质检查 通常来看，如果在生产过程中可能引入无机杂质时，则应进行针对性研究，由于药物降解产生无机杂质的可能性相对较小，在稳定性研究中一般可不做考察。 （一）无机阴离子 中国药典纳入的无机阴离子包括硫酸盐、氯化物、硫化物、氰化物、磷酸盐、含磷物质、氰酸盐、碘化物、碘酸盐、硝酸盐、氟化物、溴化物、硫代硫酸盐等。 硫酸盐、氯化物：信号杂质，多用于不能以其他更直接的方法控制确切的杂质时，考察样品纯度是否达到一定要求，不作为质量标准的普遍要求。中国药典纳入的几种药物限度分别为：丙磺舒（氯化物0.018%）、磷酸咯萘啶（氯化物0.0.3%）、富马酸亚铁（硫酸盐0.2%）。 硫化物：有毒杂质，应注意药典附录硫化物检查法中标准硫斑固定为5μg的硫(s)，供试品的量应与之匹配。中国药典纳入的几种药物限度分别为：黄凡士林（0.00017%）、对氨基水杨酸钠（0.001%）。 氰化物：有毒杂质，药典收载中纳入两种方法，可以检出达到痕量级。中国药典纳入的碘解磷定限度为0.0005%。 （二）金属离子与重金属 中国药典纳入的金属离子包括碱金属，碱土金属、铜、锌、镍、铅、铁、硒、砷盐等。对重金属的检查不同于对单一金属离子的检查，后者是具有针对性的。 硒：毒性杂质，主要来源于生产工艺，如某些甾体激素类药物，在生产中使用了二氧化硒脱氢，可能引入该杂质。中国药典纳入的醋酸曲安奈德限度为0.005%。
2017版CSCO肺癌指南 2017 年4 月22 日，中国临床肿瘤学会（CSCO）指南发布会在广州举行。CSCO 副理事长、吉林省肿瘤医院院长程颖教授就《CSCO 原发性肺癌诊疗指南》2017 年更新版进行了解读。 那么，2017 版《CSCO 原发性肺癌诊疗指南》中究竟更新了哪些内容？又是基于哪些证据呢？让我们一起来看一下。 在影像和分期诊断部分、病理学诊断部分以及随访部分，内容没有变化。 分子分型部分的更新 在基本策略中，非鳞癌除了EGFR 和ALK 融合基因检测外，新增加了耐药后行二次活检对继发耐药T790M 进行检测，不能行组织学检测的患者可行血液ctDNA T790M 检测（I 类证据）。 可选策略中，增加了ROS1 融合基因RT-PCR 检测（从IIA 类提到IB 证据）。更新ROS1 检测方法，主要是基于
吴一龙教授牵头的东亚ROS1 阳性患者的II 期研究，入组127 例病人，其中中国患者74 例，使用RT-PCR 方法，阳性患者使用克唑替尼治疗。其中CR 14 例，PR 74 例，ORR 69.3%，PFS 13.4 个月，ROS1 成为克唑替尼治疗有效的第二个分子类型。 基于病理类型，分期和分子分型的综合治疗部分的更新 1. 非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的更新 （1）不可手术的IIIA 或IIIB 期NSCLC PS 0-1 者新增加了同步放化疗证据。证据来自于王绿化教授的III 期研究，比较依托泊甙/ 顺铂和紫杉醇/ 卡铂同步放化疗随机对照研究，3 年OS 率分别是41.4% 和26.0%，因此推荐依托泊甙/ 顺铂为IIIA 或IIIB 期不能手术患者的优选同步放化疗方案。 （2）IV 期EGFR 突变患者的一线治疗 PS 0-3 分者，按照上市时间，在基本策略里推荐吉非替尼，埃克替尼，厄洛替尼和阿法替尼，其中阿法替尼是今年增加的证据。可选策略里，PS 0-1 分者增加了联合化疗循证医学依据。此推荐基于JMIT 研究，EGFR 突变患者使用
人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立 于宁;李张昱;高鑫;郭剑锋;陈四方;朱宏伟;叶永造;谭国伟 【期刊名称】《中华神经医学杂志》 【年(卷),期】2016(015)006 【摘要】目的建立裸鼠的人脑胶质瘤细胞原位移植双色荧光模型. 方法体外培养转染有增强型红色荧光蛋白(ERFP)的人U87细胞(ERFP-U87),制成细胞悬液后接种于表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的裸小鼠脑部右侧尾状核区域,活体成像系统上动态观察肿瘤的生长,4周后HE染色移植瘤组织切片,荧光显微镜下观察肿瘤细胞与宿主基质细胞的关系. 结果表达EGFP的裸鼠在活体成像系统下可见全身组织器官均带有绿色荧光.接种ERFP-U87细胞后1周于移植部位可见红色荧光,且随时间的增加而增强.HE染色移植瘤组织显示肿瘤细胞较正常细胞深染,核大,可见分裂相及多核;荧光显微镜下观察可见肿瘤组织与宿主基质分别呈现红、绿色荧光,肿瘤组织与鼠脑组织界限不清,可见肿瘤发生血管,正常内皮细胞形成血管,部分管壁有肿瘤细胞包绕,肿瘤组织中呈现绿色荧光. 结论双色荧光胶质瘤动物模型可作为胶质瘤基础研究的理想模型.%Objective To establish the double fluorescent animal models of orthotopic transplantation of human glioma cells into nude mice and provide dynamic observation of occurrence and development of gliomas.Methods Human U87 cells were transfected with enhanced red fluorescent protein (ERFP) and then inoculated into the right caudate nucleus of nude mice with enhanced green fluorescent protein (EGFP).Dynamic observation of tumor growth was carried out by in vivo imaging.HE staining was performed on the