第24卷第6期分析测试学报V ol.24N o.6
2005年11月FENXI CESHI XUE BAO(Journal of Instrum ental Anal y sis)133～137综述
量子点的光学特征及其在生命科学中的应用
邹明强1,杨蕊2,李锦丰1,马吉湘1,王楠1
(1.中国检验检疫科学研究院,北京100025;2.吉林大学化学学院,吉林长春130023)
摘要:量子点是近几年发展起来的新型纳米材料,是直径在1～100nm的一类半导体纳米粒子,具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性,可以很好地用于荧光标记,可以成为一类理想的生物荧光探针。虽然其研究起步较晚,但因其独特的光学和电子学性质而成为人们关注的一个热点。本文概述了量子点基本知识及特性、量子点的制备方法、标记方法以及在生命科学尤其在免疫分析、快速诊断中的应用进展及前景展望。
关键词:量子点;纳米粒子;荧光标记
中图分类号:Q657.39文献标识码:A文章编号:1004-4957(2005)06-0133-05
S p ectral Pro p erties of Quantum Dots and Its A pp lications to Life S cience
Z OU M in g-q ian g1,Y ANG Rui2,LI Jin-fen g1,M A Ji-x ian g1,W ANG Nan1
(1.Chinese Academ y of Ins p ection and Quarantine,Bei j in g100025,China;2.C olle g e of Chem istr y,
Jilin Universit y,Chan g chun130023,China)
Abstract:Quantum dots(QDs),w ith a diam eter of1～100nanom eter in size,as a s p ecific kind of nano p arti2 cles new l y develo p ed in recent y ears,p rovide an extrem el y g ood fluorescent si g nal and then can w ell be used for fluorescent labelin g,also as an ideal biocon j u g ated fluorescent p robe for bioanal y sis,because of their u2 ni q ue o p tical and electronic p ro p erties,such as broad ex citation s p ectrum,narrow em ission s p ectrum,g ood tune and ne g lectable o p tical bleach p henom enon etc.Althou g h its research and a pp lication have j ust been ex2 p lored,QDs have drawn g reat attention of scientists in m an y fields.Its basic know led g e and characters,s y nthe2 sis,labelin g a pp roach,recent p ro g ress and p ros p ect of the p otential a pp lications to life science,es p eciall y to immunoassa y and ra p id dia g nostic anal y sis are review ed in this p a p er.
K e y words:Quantum dots(QDs);Nano p articles;F luorescent labelin g
量子点,即一种特殊的纳米微粒,也称纳米量子点,又称半导体量子点(q uantum dot,QD)或半导体纳米微晶体(sem iconductor nanocr y stal),以其优良、独特的光学特性及特殊的光电性质,对光电转换、传感、显示、生物成像等方面具有重要的影响,在生命科学、分析科学、材料科学、免疫医学、检验检疫等传统及新兴领域逐渐发挥出越来越大的作用。
在过去的十几年里,针对纳米尺寸晶体材料的研究,已经发展成为一门多领域交叉的新型学科[1～5]。纳米晶体材料最显著的特点表现为它们的物理、化学性质与其相应体相材料具有显著差异[6]。人们期待通过精确合成各种尺度的纳米晶体,再以其为结构构筑单元实现进一步的复合和组装,来强化材料的光、电、磁等各类性能,并实现材料间性能的集成。随着研究的逐步深入,将量子点用于生物标记,在药物筛选、细胞示踪、流式微流控芯片免疫分析、快速诊断增敏等方面的研究与应用,正蕴涵着突破性的潜能,已成为分析科学中一个新兴的、前沿的、最为活跃的研究领域。
1量子点的基本特性
量子点是一种由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在1～100nm之间的纳米晶粒,目前以CdS、CdS e、CdT e、ZnS等的研究为多。
纳米量子点具有类似体相晶体的规整原子排列,而普通纳米微粒的原子排布通常是杂乱的。由于量
收稿日期:2004-12-10;修回日期:2005-07-11
基金项目:国家质检总局科技项目(2003IK057;2004IK033)
作者简介:邹明强(1964-),男,北京市人,研究员,博士,T el:010-********,E-m ail:m in gq ian g z@https://www.doczj.com/doc/061475898.html,
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子尺寸效应的存在,量子点的光学及电学性质强烈依赖其尺寸。此外,量子点具有大的比表面积,其表面原子数目已经与内部晶格的原子数目相当,因此这种材料的表面结构与材料本身性能关系密切。通过化学方法合成量子点,并对量子点进行适当的表面修饰能够明显地提高其化学、光学及催化性质[7]。量子点独特的性质基于它自身的量子效应,当颗粒尺寸进入纳米量级时,尺寸限域将引起尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应和表面效应,从而派生出纳米体系具有常观体系和微观体系不同的低维物性,展现出许多不同于宏观体材料的物理化学性质,在非线形光学、磁介质、催化、医药及功能材料等方面具有极为广阔的应用前景,同时将对生命科学和信息技术的持续发展以及物质领域的基础研究产生深刻的影响[8]。
与传统的有机荧光染料相比,量子点具有以下特点:(1)具有宽的激发波长范围及窄的发射波长范围,即可以使用小于其发射波长10nm的任意波长的激发光进行激发,这样就可以使用同一种激发光同时激发多种量子点,发射出不同波长的荧光。而荧光染料的激发光波长范围较窄,需要多种波长的激发光来激发多种荧光染料,给实际工作带来了很多的不便。(2)量子点的发射峰窄而对称,重叠小,而荧光染料发射峰不仅宽,而且不对称,拖尾严重,互相重叠严重,容易互相干扰,给分析检测带来难以解决的难题。(3)量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来调谐,可以任意合成所需波长的量子点,大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布。(4)量子点的荧光强度及稳定性是普通荧光染料的100倍左右,几乎没有光褪色现象,可以对所标记的物体进行长时间的观察。(5)生物相容性好,尤其是经过各种化学修饰之后,可以进行特异性连接,对生物体危害小,可进行生物活体标记和检测,而荧光染料一般毒性较大,生物相容性差。由于上述诸多优点,对量子点的合成制备、修饰以及在各个领域的应用研究都取得了突破性进展。
2半导体量子点的制备
制备纳米材料的方法很多,总体上可分为物理方法和化学方法两大类。物理方法包括蒸气冷凝法、气相沉积、溅射沉积、低温等离子法和机械粉碎等,该法可制得粒径易控的纳米粒子,但因所需设备昂贵而限制了它的广泛使用;化学方法主要有溶胶凝胶法、微乳法、LB膜法、泡囊法、化学沉淀法、醇解法、回流法、水热法等[9,10]。
目前用有机相合成半导体量子点的工艺已经比较成熟,基本上实现了商品化。用有机相合成的量子点一般是立方晶体,荧光效率可以达到30%～50%,表面修饰后的量子点甚至可以达到80%,但是这种方法制备的量子点上包裹着大量的疏水基团,如果要将其溶于水中,就要进行一系列的处理,方法很繁琐,并且极有可能造成量子点的团聚,丧失荧光效应。另外,用有机相合成时,实验条件要求相对比较苛刻,大多数的过程都要在手套箱中完成,并且对实验人员的身体伤害比较大,同时也造成了一定的环境污染。
用水相合成与用有机相合成相比,无论是在价格上,还是在生物亲和性上都占有绝对的优势。然而,需要克服的难题是如何提高量子效率,如CdT e的水相合成,通常量子效率都是不够理想的。为了提高量子效率一般采用对粒子进行后处理的方法,常见的处理方法有:选择性沉积、选择性光蚀或者表面修饰,近期的文献中一般都采用表面修饰[5]。Cd2+与巯基化合物中的巯基具有很强的配位结合能力,可以根据这一性质实现在水溶液体系中合成高产量的量子点[11]。将含有稳定剂巯基丙酸的CdC l2溶液的p H值调到11.2,再用高纯的N2气将该溶液在密闭体系中脱氧、保护,然后在适当的搅拌速度下,向上述溶液中加入新制备的无氧NaHT e溶液[12]。将此反应液加热到96℃,回流2h,即可得到尺度较均一的CdT e纳米粒子溶液,而不需进行尺度分离[9]。
3标记方法
量子点用于荧光标记一般通过偶联的方式与生物分子结合,偶联的方法主要有两种。一种是共价结合法,即通过化学反应将量子点表面进行羧基、氨基或环氧基等官能团化的修饰改性,使之能与生物分子中的氨基或羧基结合实现偶联(图1)[13,14]。该方法虽然操作步骤相对复杂一些,但结合牢固,可用于较复杂的研究体系,如抗原-抗体对间的识别、活体标记及特异性标记等,显出一定的优越性。另一种是静电吸附方法,带电荷的量子点可以与带相反电荷的生物分子通过静电相互作用吸附偶联[15,16],该方法适用于简单体系。
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图1量子点与生物分子通过化学键合方式偶联示意图
F i g .1S chem atic dia g ram of combination of QD w ith biolo g ical m olecular b y chem ical bondin g
图2ZnS/CdS e 核壳结构量子点与蛋白分子偶联示意图F i g .2S chem atic dia g ram of the ZnS -ca pp ed CdS e QD
covalentl y cou p led to a p rotein m olecular
4量子点的应用
半导体量子点研究的开创可以追溯到20世纪70
年代,而真正用来进行生物分子的标记而取得突破性
的进展应该是近几年的事。研究初期,量子点都是在
有机溶剂中制备的,由于制备条件比较苛刻,反应步
骤也比较复杂,成本较高,给推广应用带来了一定的
困难。因此,研究直接在水中合成量子点的方法对于
其在生物医学研究中的应用具有重要意义。
1998年,A.P.Alivisatos [4]和S.M.N ie [5](图2)两个
研究小组提出用半导体量子点作生物荧光标记的最初
构想,并由此引发了制备及修饰量子点的革命。
Alivisatos 等制备了CdS e -CdS 的核-壳结构的量子点,
其表面经不同基团修饰后,可以通过静电引力、氢键作
用或特异的配体-受体相互作用来控制量子点与生物分子之间的相互作用,并用其作为荧光探针对鼠组织细
胞进行标记。而N ie 等采取另外一种思路,通过表面官能团化技术使量子点表面具有亲水性基团(HS —CH 2COOH ),靠化学键合实现与生物分子的偶联,通过光致发光可检测出与生物分子相结合的量子点。
2001年,张春阳等人对量子点标记的天花粉蛋白(QDs -T CS )进行研究,首次将量子点应用于中药研究领域[17]。他们研究了QDs -T CS 的光谱学性质及其酶活性变化,并利用双光子激发激光扫描荧光显微镜观察了QDs -T CS 在T CS 靶细胞(JAR )内的分布情况。
与此同时,随着量子点制备及表面修饰技术的提高,生物学家们开始热切地专注于利用量子点标记来研究生物现象[18],使研究者们对量子点在生物医学领域的研究及应用产生了极大的兴趣。N.V.K otov 等人发现量子点与含苯丙氨酸的血清蛋白偶联后,荧光得到增强,这一现象归结为共扼苯丙氨酸的天线效应[19]。量子点标记抗体后,利用抗原-抗体间的特异性识别,可以将不同荧光量子点修饰在底物上,并对底物进行示踪。将底物注射到小鼠体内,可以通过观察小鼠器官的荧光颜色及强度,判断底物的走向和选择性,进行活体跟踪[20,21]。
随后,量子点的进一步研究更多地集中于细胞生物学方面。Wu 等人[22]成功地用荧光免疫法标记了细胞,证明量子点标记抗体能够特异的识别亚细胞水平的分子靶点。他们用量子点标记的羊抗鼠I g G 作为二抗,结合抗H er2单克隆抗体观察到了乳腺癌细胞表面的H er2。用抗生物素蛋白(avidin )交联具有不同发射光谱特征的量子点,配合生物素连结的二抗和特异性单抗,可同时识别细胞表面的H er2和核抗原,也能同时识别胞浆微管蛋白和核抗原。Jaisw a 等人[23]用量子点对活细胞进行标记,进入细胞的量子点探针不影响细胞的形态和繁殖过程中的信号传递以及运动情况,培育12天仍然可看到细胞内的量子点荧光。用这种标记方法,可以无侵害地对许多种细胞进行长达12天以上的标记,开辟了一条深入研究细胞活动的新途径。利用这些进展,人们可以达到长期观察和追踪被不同颜色量子点标记的活细胞的目的。B.Dubertret 等人以CdS e 量子点为标记物考察了蟾蜍卵细胞的分裂过程,获得了细胞组织分化信息[24]。S.M.S im on 等人用不同荧光的量子点标记活细胞,证明细胞可以在量子点标记后长期存活,而且荧光不会褪色。W.W.W ebb 等人用多光子光谱研究了量子点的生物成像,
验证了标记活
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体组织的可能性,为量子点在细胞导入技术中的应用奠定了基础[25]。量子点可以用来标记细胞及亚细胞级别的生物结构,标志着以量子点为荧光手段研究生物现象的时代已经来临[26]。
最近,利用量子点标记、基于免疫学原理的方法也成功地用于细菌的检测。李等人[27]用量子点作荧光标记物,结合免疫磁分离技术,采用蓝色发光二极管(LE D)激发光源、CCD为检测器的便携式光谱仪进行大肠杆菌O157∶H7的测定。如目标分析物O157∶H7存在,则被O157∶H7单抗涂层的磁微球捕获,之后O157∶H7抗原与生物素化的O157∶H7抗体发生免疫反应而结合,形成“三明治”双抗体夹心式的复合物,经过磁分离后,靠亲和力使亲和素化的量子点与免疫复合物结合即标记了荧光,用便携式光谱仪测定荧光强度。实验表明,在1×103～1×107CFU/m L范围内,荧光强度与待测的O157∶H7浓度成比例,从而实现大肠杆菌O157∶H7的定量测定。该方法比普通FIT C标记方法的检出限至少低100倍,分析时间总计不超过2h,方法灵敏、特异、快速。可以相信,随着研究的不断深入,量子点在多种类型有害因子的快速诊断检测中的应用会逐渐趋于成熟。
5应用前景
QD最有前途的应用领域是作为荧光探针来标记生物体系。与传统的荧光探针相比,纳米晶体的激光光谱宽,且连续分布,而发射光谱呈对称分布且宽度窄,颜色可调,即不同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光,并且光化学稳定性高,不易分解。如果能解决不同材料的量子点偶联问题,就可以用量子点代替很多荧光染料分子,从而在细胞器定位、信号转导、原位杂交、胞内组分的运动和迁移等研究中发挥巨大作用。
QD可以加入到几微米大小的聚合物微球中,不同荧光强度、不同颜色的量子点,以一定的比率可制成荧光编码微球[28],因此其荧光标记功能大大拓展。例如,在微球中嵌入不同配比的橙、绿、蓝3种颜色的量子点,当用同一激发光源激发时微球形成多种不同颜色,因此可以进行多色的光学编码。假如有10种强度,6种颜色的不同量子点,可以制成(106-1)个特定编码的荧光微球。就是说理论上可以在同一样品上检测100万种不同组分。人类基因组大约只有3～4万个基因,因此很容易利用发光量子点编码微球进行标记实现对人类全基因组的检测,因此可望用此技术对基因疾病做出快速诊断[29]。目前有关研究才刚刚开始,潜在的应用将十分广阔。
成像和光谱测定结果表明,量子点编码的微球是高度均一和重现的,编码和目标信号能在单个水平上被同时读出,因此这种光学编码技术为基因表达研究、药物高通量筛选开启了一扇新的大门。因此有理由相信QD可以成为药物筛选的有力工具,有可能将肽标靶的量子点应用于药物运输。这种标靶方法最近已被成功地用于把由脂质和DNA组成的超微粒子运输到肿瘤脉管系统中[30]。
借助红外光的强穿透能力,如果将某些在红外区发光的量子点标记到组织或细胞内的特异组分上,用红外光作激发光源,QD即可对组织内部进行示踪,达到诊断的目的。目前这方面已有成功的应用实例[18],相信类似的研究应用将会层出不穷。
QD在生物芯片研究中同样可以大有作为[31～34]。如应用于DNA分析的生物芯片或兽药残留蛋白芯片,由于受目前荧光探针性能的限制,一次通常只能将一种(或很少几种)标记了荧光探针的蛋白质与芯片作用,因此很难实现多个蛋白质的一次性分析研究。如果使用了量子点荧光标记,则可将欲研究的各种蛋白质用一系列不同大小、不同材料、光谱特性各自不同的量子点或量子点微球标记,更重要的是可以用同一波长的光激发,从而可以同时检测所有标记的蛋白质与芯片上的蛋白质之间的相互作用。可见,QD的引入,会使现有生物芯片方法的效率大大改善。
结合流式细胞术(flow c y tom etr y,FCM),将量子点标记用于微流控芯片免疫分析的研究则更是一个方兴未艾的方向,目前这方面的研究及应用已开始起步[35～37]。由于微流控芯片具有可以重复使用、成本低廉、高通量等优点,如果结合量子点编码微球的优良光学特性并基于免疫分析技术,则无疑在未来的应用中大显身手。仿照FCM原理,使“载有”待测组分特异性配体(如抗体)的量子点微球在微流控芯片的微通道中排成一列流动,一个一个地通过检测区,选用一种激发光源即可实现与配体特异性结合的目标待测组分(如药物残留、病毒、或细菌等)的多因子同时分析,达到快速诊断及检测的目的,这一技术将成为又一个可与生物芯片一争高低并更具应用潜力的技术平台。尽管QD作为生物荧光标记物还
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存在着一些问题,如稳定的、发光效率高的QD的制备条件较为苛刻,其生物可相容性、大分子可接近性还有待于进一步提高等等,但随着研究的不断深入,人们对QD的性质将有更深刻的认识,其制备工艺也会不断改善。可以预言,以分析科学为基础,以微机电加工技术为依托,以生命科学为研究对象,以前沿的材料科学、纳米生物技术等为先导,量子点的研究将交叉、融合众多领域的知识成果,势必形成一种共性的、集成的微全分析技术。相信纳米量子点标记在未来的医学快速诊断、食品安全检测控制,尤其在检验检疫领域会有广泛应用。
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