碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮的影响因素
郝冬亮
(中国环境管理干部学院中荷水处理示范研究培训中心，河北秦皇岛066004)
摘要：采用《水质总氮的测定过硫酸钾氧化紫外分光光度法》(HJ636—2012)进行水中总氮测定，方法简单、灵敏度高，但在测定过程中，试验用水、药品品质、药品配制温度控制、试剂的
存放时间、器皿洗涤等环节都会造成实验数据异常。为此，对过硫酸钾的品质选择、过硫酸钾配制
中温度的控制、配制好过硫酸钾的存放时间等进行了探讨。另外，测定中器皿的洗涤也更为严格，不但需要常规的清洗干净，还需要在(1+9)盐酸中24h浸泡。
关键词：总氮;碱性过硫酸钾消解;紫外分光光度法
中图分类号：TU991文献标识码：C文章编号：1000－4602（2014）12－0148－03
Influence Factors of Alkaline Potassium Persulfate Digestion UV
Spectrophotometry for Determination of Total Nitrogen
HAO Dong-liang
（Sino-Dutch DemonstrationＲesearch and Training Centre for Water Treatment，Environmental
Management College of China，Qinhuangdao066004，China）
Abstract：The Water Quality—Determination of Total Nitrogen—Alkaline Potassium Persulfate Di-gestion UV Spectrophotometric Method（HJ636－2012）is simple with high sensitivity in determination of
total nitrogen in water．However，test water，chemicals quality，chemicals preparation temperature con-
trol，reagent storage time，ware washing and so on would cause abnormal experimental data in the process
of determination．Therefore，potassium persulfate quality selection，temperature control for potassium
persulfate preparation，storage time of prepared potassium persulfate and so on were discussed．The ware
washing is more stringent，needing regular cleaning and soaking in（1+9）hydrochloric acid for24
hours．
Key words：total nitrogen；alkaline potassium persulfate digestion；ultraviolet spectrophotome-try
国家环境保护标准中，总氮测定采用碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法，该法操作简单、灵敏度高、所需设备少、试剂相对简单，但是该法对空白值要求高（A b＜0．030）［1］，质控不当，数据常常出现异常。笔者通过试验，分析了国标法———碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法测定总氮中的一些影响因素并进行了改进优化。1实验部分
1.1仪器与试剂
仪器：UV2000紫外可见分光光度计（单光束），10mm石英比色皿，LDZX－30KBS手轮式自动型不锈钢立式压力蒸汽灭菌器。
试剂：硝酸钾（GＲ），过硫酸钾（GＲ），氢氧化钠（AＲ）。
第30卷第12期2014年6月
中国给水排水
CHINA WATEＲ＆WASTEWATEＲ
Vol．30No．12
Jun．
2014
1.2实验原理及方法
见参考文献［1］。2结果与分析
2.1
实验用水对测定结果的影响
在HJ 636—2012中，对实验用水明确要求为
“无氨水”。实验初期，采用的都是管道输送的供基本教学使用的去离子水，测定的空白值见表1。可见，去离子水的空白吸光度值明显超出HJ 636—2012的质控要求。后用娃哈哈纯净水替代，空白吸光度值完全达标。陈瑛等实验证明，新鲜制备的蒸
馏水或去离子水基本能满足实验要求［2］
，可能是本实验室新鲜制备的去离子水在管道输送中被氮污染源二次污染导致不能达到总氮测定的质控要求。邱才英等研究表明，超纯水较去离子水和蒸馏法制备
得到的无氨水都更优［3］
，这点和表1数据一致。
表1
不同实验用水的空白值Tab．1Blank values of different experimental waters
在HJ 636—2012中，无氨水的制备相对较繁
琐，超纯水机在多数实验室是常规设备，建议使用超
纯水或娃哈哈纯净水作为实验用水，有蒸馏设备的实验室也可以参考HJ 636—2012进行无氨水的制备。
2.2过硫酸钾对测定结果的影响
过硫酸钾的品质是碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮核心影响因素，其品质的好坏，直接决定空白吸光度及数据是否达标。相关资料显示，多数国产厂家过硫酸钾的空白吸光度值直接超出HJ 636—2012质控要求［4 6］。实验之初，采用某厂过硫酸钾（GＲ），标准曲线吸光度及相关系数异常（见表2和图1），经反复调整始终不能达到要求，后购进国药集团化学试剂（GＲ），空白吸光度值和标准曲线相关系数完全达到HJ 636—2012质控要求（见表2和图2）。有些文献也提出可以对纯度不高的过硫酸钾进行提纯以达到HJ 636—2012质控要求
［6］
，由于实验室条件限制以及过硫酸钾对50?以上温度的不稳定性，建议优先选用合格的国药集
团化学试剂或进口过硫酸钾。相对于进口试剂，国药集团化学试剂物美价廉，所测数据也完全满足HJ 636—2012质控要求。
表2不同厂家过硫酸钾（G Ｒ）空白吸光度值
Tab．2
Blank absorbance of different potassium persulfates
图1某厂过硫酸钾（G Ｒ）总氮标准曲线Fig．1
Total nitrogen standard curve of potassium
persulfate from a plant
图2国药集团化学试剂（G Ｒ）总氮标准曲线
Fig．2
Total nitrogen standard curve of chemical reagent
from Sinopharm
第30卷第12期中国给水排水www．watergasheat．com
2.3过硫酸钾配制温度控制对结果的影响
HJ636—2012中碱性过硫酸钾溶液配制方法：40．0g过硫酸钾溶于600mL水中，另取15．0g氢氧化钠溶于300mL水中。待氢氧化钠溶液温度冷却至室温后，混合两种溶液定容至1000mL。过硫酸钾常温下不易完全溶解，为促进其溶解往往需要加热。有文献显示，过硫酸钾在60?甚至50?就会分解［7］。加热温度最好控制在50?以内，既利于促进过硫酸钾溶解，又可减少高温对过硫酸钾氧化能力的损失。且氢氧化钠在溶解过程中会放出大量热而导致配制过程中过硫酸钾氧化能力的损失，鉴于此，两种药品（过硫酸钾和氢氧化钠）最好分别配制，待氢氧化钠溶液冷却至室温后再混合定容，以避免不必要的损失。
2.4玻璃器皿的洗涤对测定结果的影响
玻璃器皿不同洗涤方法下的空白样测定结果见表3，可见，实验所用玻璃器皿在去污粉清洗的条件下空白吸光度＞0．030，HJ636—2012的质控要求当空白试验的校正吸光度A b＞0．030时，应检查器皿的污染状况。相关文献显示，在总氮测定中，常规的玻璃器皿洗涤标准无法满足［4］，通常用于总氮测定的器皿在常规洗净的前提下，还需在（1+9）盐酸溶液中浸泡24h再用无氨水涮净后才可使用。表3中在去污粉清洗后再用（1+9）盐酸浸泡24h后，空白吸光度完全符合HJ636—2012的质控要求。建议每次测定后，所有的玻璃器皿在清洗干净后，直接浸泡到（1+9）盐酸溶液中。
表3玻璃器皿不同洗涤方法下空白样平行值
Tab．3Blank sample parallel value
3结语
①无氨水制备繁琐，可以用超纯水或者娃哈哈纯净水代替，空白吸光度完全符合质控要求。
②过硫酸钾是本监测方法的关键环节，其品质的好坏直接影响结果是否达标。虽然有文献报道通过重结晶提高过硫酸钾的纯度来达到实验要求，但是过硫酸钾对温度较为敏感，为了减少误差，可以直接选用能够达到质控要求的国药集团化学试剂，经费充足的甚至可以购买进口过硫酸钾。在过硫酸钾的准备环节中要控制好配制过程中溶液的温度，建议不要超过50?，以避免对其氧化能力造成影响从而影响测定结果。
③还要注意所有仪器、器皿的清洗问题。保证所有的比色管在（1+9）的盐酸中24h浸泡。石英比色皿用前浸泡15min即可，浸泡时间过长会导致比色皿开胶。
参考文献：
［1］HJ636—2012，水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法［S］．北京：环境科学出版社，2012．［2］陈瑛，漏华强，张群．提高紫外分光光度法测定水中总氮方法精确度的研究［J］．绍兴文理学院学报：自然科
学版，2003，（8）：67－69．
［3］邱才英．碱性过硫酸钾—紫外分光光度法测定废水中总氮［J］．现代商贸工业，2012，（10）：182－184．
［4］方熠．水质中总氮测定的影响因素分析［J］．广州化学，2012，37（3）：14－17．
［5］曹轶，仪军，刘晓荣，等．过硫酸钾消解—紫外分光光度法测定水中总氮的几点注意事项［J］．山东化工，
2011，40（11）：40－41．
［6］杨森泉．提纯过硫酸钾以满足总氮测定要求［J］．广东化工，2013，40（5）：45－46．
［7］张宪伟．国标法测定总氮过程中若干常见问题的探讨［J］．科学观察，2012，（3）：64－65．
作者简介：郝冬亮（1977－
），男，山西太原人，
硕士，讲师，从事环境科学与工程研究。
E－mail：haodongliang1314@163．com
收稿日期：2013－12－08
www．watergasheat．com郝冬亮:碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮的影响因素第30卷第12期
第20章 吸光光度法 思 考 题 1. 什么叫单色光复色光哪一种光适用于朗伯－比耳定律 答：仅具有单一波长的光叫单色光。由不同波长的光所组成光称为复合光。朗伯--比耳定律应适用于单色光。 2. 什么叫互补色与物质的颜色有何关系 答：如果两种适当的单色光按一定的强度比例混合后形成白光，这两种光称为互补色光。当混合光照射物质分子时，分子选择性地吸收一定波长的光，而其它波长的光则透过，物质呈现透过光的颜色，透过光与吸收光就是互补色光。 3. 何谓透光率和吸光度 两者有何关系 答：透光率是指透射光强和入射光强之比，用T 表示 T = t I I 吸光度是吸光物质对入射光的吸收程度，用A 表示，A εbc =，其两者的关系 lg =-A T 4. 朗伯-比耳定律的物理意义是什么 什么叫吸收曲线 什么叫标准曲线 答：朗伯--比耳定律是吸光光度法定量分析的理论依据，即吸光物质溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度之间的定量关系。数学表达式为 lg A T εbc =-= 吸收曲线是描述某一吸光物质对不同波长光的吸收能力的曲线，即在不同波长处测得吸光度，波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图即可得到吸收曲线。 标准曲线是描述在一定波长下，某一吸光物质不同浓度的溶液的吸光能力的曲线，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图即可得到。 5. 何谓摩尔吸光系数质量吸光系数两者有何关系 答：吸光系数是吸光物质吸光能力的量度。摩尔吸光系数是指浓度为 mol ·L ，液层度为1cm 时，吸光物质的溶液在某一波长下的吸光度。用ε表示，其单位 11cm mol L --??。 质量吸光系数是吸光物质的浓度为1g 1L -?时的吸光度，用a 表示。其单位 11cm g L --?? 两者的关系为 εM a =? M 为被测物的摩尔质量。 6. 分光光度法的误差来源有哪些 答：误差来源主要有两方面，一是所用仪器提供的单色光不纯，因为单色光不纯时，朗伯—比耳定律中吸光度和浓度之间的关系偏离线性；二是吸光物质本身的化学反应，其结果同样
上海百贺仪器科技有限公司提供ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｈｋ．ｃｎ 紫外分光光度法测定蛋白质含量 摘要： 考马斯亮兰G250与蛋白质结合，在0－1000ug/ml范围内，于波长595nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质含量的测定。考马斯亮兰G250 与蛋白质结合迅速，结合产物在室温下10分钟内较为稳定，是一种较好的蛋白 质定量测定方法。 1.实验部分 1.1仪器与试剂： Labtech UV POWER紫外分光光度计；玻璃比色皿一套；考马斯亮蓝G250； 牛血清蛋白；超纯水。 1.2试液的制备： 牛血清蛋白标准溶液（1000ug/ml）的制备称取100mg牛血清蛋白置100ml 容量瓶中，加入超纯水溶解并定容。 考马斯亮兰G250试剂称取100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml95％的乙 醇后，加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1升。 2.结果与讨论 2.1校正曲线的绘制 准确吸取1000ug/ml牛血清蛋白标准溶液0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml 分别加入到6只10ml试管中，然后用超纯水补充到0.1ml，各试管分别加入5ml 考马斯亮兰G250试剂，混合均匀后，即可依次在595nm处测定吸光度。以浓度 为横坐标，吸光度为纵坐标绘制校正曲线如下图，校正曲线方程为 A=0.613556C+0.001008，R=0.9994。
上海百贺仪器科技有限公司ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｈｋ．ｃｎ 2.2精密度 配制0.6mg/ml牛血清蛋白的考马斯亮兰溶液连续进样6次，得到吸光度的 相对标准偏差。 表1精密度测定结果 次数123456RSD% A0.26260.26220.26200.26280.26290.26260.13 2.3稳定性 取1mg/ml牛血清蛋白标准溶液每十分钟测定一次，50分钟内的吸光度变化 如下表2。 表2稳定度测定结果 时间（min）A1A2A3A平均 00.55110.55230.55160.5517 100.52040.51840.51680.5185 200.49100.49010.49030.4905 300.47650.47160.47210.4734 400.45240.44750.44400.4480 500.39820.39350.40310.3983 3.结论 该方法测定快速、简便，干扰物少，是目前灵敏度较高的蛋白质含量测定 的紫外分光光度法。
用紫外分光度计测定溶液的浓度 一、实验材料与仪器 罗丹明B，蒸馏水，紫外分光度计，10ml比色皿（2个），250ml容量瓶，烧杯，移液管，比色管（若干） 二、实验步骤 ①用称量纸称取0.0025g的罗丹明B，放入烧杯中加入适量的蒸馏水 溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，然后转入250ml容量瓶中，贴上标签待用（此时的溶液的溶度为10mg/L）。 ②取5支25ml的比色管，用量液管分别加入1.00，2.00，3.00，4.00， 5.00ml的已配好的罗丹明B溶液。然后加入蒸馏水稀释至10ml， 此时的比色管中溶液的浓度分别为1,2,3,4,5mg/L。 ③打开紫外分光光度计，预热30分钟，让机器稳定下来，然后以蒸 馏水作为参比溶液，加入比色皿中（适量），然后用吸水纸把比色皿表面的溶液吸干，放入五联池中，盖上盖，在电脑界面上点击，“基线”图标，进行消除基线，由于罗丹明B的最大吸收峰为554，故把波长扫描范围定在400~650nm。 ④消除基线后，取出盛参比溶液的比色皿，把未知浓度的溶液加入 比色皿中，用紫外分光光度计进行测定。 三、数据处理与matlab绘图 x=1:5; y=[0.242 0.507 0.788 1.044 1.254] p=polyfit(x,y,1);
xi=0:6; yi=polyval(p,xi); plot(x,y,'ob',xi,yi,'r') ylabel('吸光度值') xlabel('罗丹明B 的浓度(mg/L)') 01234 56-0.20 0.2 0.4 0.6 0.811.2 1.4 1.6 罗丹明B 的浓度(mg/L)吸光度值 实际值点拟合曲线
紫外-可见分光光度法测有色溶液最大吸收波波长 一、实验目的 1.学习紫外-可见分光光度法的原理； 2.掌握紫外-可见分光光度法测定的实验技术； 3.了解掌握U-3010型紫外-可见分光光度仪的构造及使用方法。 二、实验原理 1.紫外-可见吸收光谱法(称紫外-可见分光光度法)以溶液中物质的分子或离 子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析法。根据最大吸收波长可做定性分析；根据朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）可做定量分析。紫外-可见分光光度法定性分析原理：根据吸收曲线中吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状进行定性分析。 2.紫外-可见分光光度法定量分析原理，根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入 射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 3.仪器由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装 置。 三、仪器与试剂 日立U-3010型紫外-可见分光光度仪；吸量管；乙醇；待测溶液；烧杯等。 四、实验步骤 1.接通电源，启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器，预 热半小时。 2.在工作接口上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：650nm，终 点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描） 3.将两个均装有无水乙醇的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描。 4.基线做好后，按下面的顺序进行操作：做Baseline→换样（换上待测样品置 于Sample池）→进入Analysis Method对相关的参数进行设定→Sample命名→Ready→Measure进行测量，寻找待测溶液的最大吸收波长，再在最大吸收波长处分别测定待测溶液的吸光度。
紫外可见分光光度法 含量测定
精品文档 【含量测定】照紫外-可见分光光度法(附录V A)测定。 1.仪器与测定条件：室温：____℃相对湿度：____% 分析天平编号：；水浴锅编号：； 紫外可见分光光度计编号：； 2.对照品溶液的制备： 取西贝母碱对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1ml含_______mg的溶液，即得。 3. 供试品溶液的制备： 取本品粉末(过三号筛)约______g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液40ml，置80℃水浴加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液至刻度，摇匀,即得。 4.标准曲线的制备： 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1.0ml，置25ml具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0ml，精密加水5ml、再精密加0.05％溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05g，用0.2mol／L氢氧化钠溶液6ml使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至100ml，即得)2ml，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。 5.测定法： 照紫外-可见分光光度法 (附录Ⅴ A），在nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含西贝母碱的重量，计算，即得。 6.结果与计算 6.1 标准曲线制备： 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
紫外分光光度法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3.掌握TU-1901紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。 二、实验原理 1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 紫外光：10-400 nm 可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉) 特点：带光谱、分子光谱 应用：定性分析 最大吸收波长; 定量分析：朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法) a.定性分析原理： 吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状 b.定量分析原理： 根据朗伯-比耳定律： A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。 定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 c. 仪器组成部件: 各种类型的紫外 可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、 吸收池、检测器和信号显示记录装置。 2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理： (1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。 (2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。 (3)有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260 (A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度(mg/mL)=F* A280*D*1/d
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正
【含量测定】照紫外-可见分光光度法(附录V A)测定。 1.仪器与测定条件：室温：____℃相对湿度：____% 分析天平编号：；水浴锅编号：； 紫外可见分光光度计编号：； 2.对照品溶液的制备： 取西贝母碱对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1ml含_______mg的溶液，即得。 3. 供试品溶液的制备： 取本品粉末(过三号筛)约______g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液40ml，置80℃水浴加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液至刻度，摇匀,即得。 4.标准曲线的制备： 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1.0ml，置25ml具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0ml，精密加水5ml、再精密加0.05％溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05g，用0.2mol／L氢氧化钠溶液6ml使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至100ml，即得)2ml，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。 5.测定法： 照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA），在nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含西贝母碱的重量，计算，即得。 6.结果与计算 6.1 标准曲线制备：
对照品批号 纯 度 S 对照品来源 干燥条件 对照品称重W 对(mg) 各浓度点稀释倍数f 对 溶液浓度C 对(ug/ml) 吸光度A 对 线性回归方程 A=( )C ＋/-（ ） r ＝（ ） 计算公式： W S C f ?= 对对对 C 对= 6.2 样品测定： 水分Q 取样量W 样（g ） 样品稀释倍数f 样 样品吸光度A 样 样品平均吸光度A 样 浓度C(ug/ml) 含量X （%） 平均含量X （%） 计算公式：() %100Q 110W f C X 6 ?-???= 样样 样 X 1= X 2= 7.本品按干燥品计算，含总生物碱以西贝母碱(C 27H 43NO 3)计，不得少于0.050％。 结果: 规定 检验人： 检验日期： 复核人： 复核日期:
第20章吸光光度法 1?什么叫单色光？复色光？哪一种光适用于朗伯一比耳定律？ 答：仅具有单一波长的光叫单色光。由不同波长的光所组成光称为复合光。朗伯--比耳定律应 适用于单色光。 2?什么叫互补色？与物质的颜色有何关系？ 答：如果两种适当的单色光按一定的强度比例混合后形成白光，这两种光称为互补色光。当 混合光照射物质分子时，分子选择性地吸收一定波长的光，而其它波长的光则透过，物质呈现透过光的颜色，透过光与吸收光就是互补色光。 3?何谓透光率和吸光度？两者有何关系？ 答：透光率是指透射光强和入射光强之比，用T表示T=X 10 吸光度是吸光物质对入射光的吸收程度，用A表示，A b e，其两者的关系 A lgT 4.朗伯-比耳定律的物理意义是什么？什么叫吸收曲线？什么叫标准曲线？ 答：朗伯--比耳定律是吸光光度法定量分析的理论依据，即吸光物质溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度之间的定量关系。数学表达式为 A lgT be 吸收曲线是描述某一吸光物质对不同波长光的吸收能力的曲线，即在不同波长处测得吸 光度，波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图即可得到吸收曲线。 标准曲线是描述在一定波长下，某一吸光物质不同浓度的溶液的吸光能力的曲线，吸光度 为纵坐标，浓度为横坐标作图即可得到。 5?何谓摩尔吸光系数？质量吸光系数？两者有何关系？ 答：吸光系数是吸光物质吸光能力的量度。摩尔吸光系数是指浓度为1.0 mol L,液层度为1em 时，吸光物质的溶液在某一波长下的吸光度。用&表示，其单位L mol 1 cm 1。 质量吸光系数是吸光物质的浓度为1g L 1时的吸光度，用a表示。其单位L g 1 cm 1 两者的关系为 e M a M为被测物的摩尔质量。 6. 分光光度法的误差来源有哪些？ 答：误差来源主要有两方面，一是所用仪器提供的单色光不纯，因为单色光不纯时，朗伯一比耳定律中吸光度和浓度之间的关系偏离线性；二是吸光物质本身的化学反应，其结果同样
紫外分光光度法测定未知物 1.仪器 1.1紫外分光光度计（UV-1801型）；配石英比色皿（1cm）2个 1.2容量瓶（100mL）：10个；容量瓶（250mL）1个 1.3吸量管（10mL、5mL）：各1支 1.4移液管（20mL、25mL、50mL）：各1支 2.试剂 2.1标准溶液（1mg/mL）：维生素C、水杨酸、苯甲酸、山梨酸、邻二氮菲分别配成1mg/mL的标准溶液，作为储备液。 2.2未知液：浓度约为（40~60ug/mL）。（其必为给出的五种物质之一） 3.实验操作 3.1比色皿配套性检查 石英比色皿装蒸馏水，以一只比色皿为参比，在测定波长下调节透射比为100%，测定其余比色皿的透射比，其偏差应小于0.5%，可配成一套使用。 3.2未知物的定性分析 将五种标准储备液均稀释成10ug/mL的试液（配制方法由选手自定）。以蒸馏水为参比，于波长200~350nm范围内扫描五种溶液，绘制吸收曲线，根据所得到的吸收曲线对照标准谱图，确定被测物质的名称，并依据吸收曲线确定测定波长。五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参考考考考附图附图附图附图。。。。 3.3未知物定量分析 根据未知液吸收曲线上测定波长处的吸光度，确定未知液的稀释倍数，并配制待测溶液3份，进行平行测定。 推荐方法 3.3.1维生素C含量的测定：准确吸取1mg/mL的维生素C标准储备液50.00mL，在250mL容量瓶中定容（此溶液的浓度为200ug/mL）。再分别准确移取1、2、4、6、8、10mL上述溶液，在100mL容量瓶中定容（浓度分别为2、4、8、12、16、20 ug/mL）。准确移取20.00mL维生素C未知液，在100mL容量瓶中定容，于
1. 目的：建立用紫外分光光度法检测药品质量的标准操作规程，保证标准操作。 2. 引用标准：《中华人民国药典》（2015年版四部）通则。 3. 围：本标准适用于用紫外分光光度法进行的检测。 4. 责任人： QC检验员对本标准的实施负责，QC主管负责检查监督。 5. 容： 5.1定义：紫外分光光度法是通过被测物质在紫外光区的特定波长处或一定波长围光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法，本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。 5.1.1. 定量分析通常选择在物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或百分吸收系数计算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定。 5.1.2. 对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光区无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或在杂质的吸收峰处该化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。 5.2 原理：物质对紫外辐射的吸收，是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区（200~400nm）或可见光区（400~760nm）产生吸收。通常使用的紫外分光光度计的工作波长围为190~900nm，因此又称紫外-可见分光光度计。紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯·比耳（lambert-Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为： A=lg 1 =ECL T
式中：A 为吸光度 T 为透光率 E 为吸收系数 C 为溶液浓度 L 为光路长度 若溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应的吸收系数为百分吸收系数，以E１％ 表示。若溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，１ｃｍ 则相应吸收系数为摩尔吸收系数，以ε来表示。 5.3. 仪器： 5.3.1. 紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。 5.3.2.为了满足紫外—可见光区全波长围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。 5.3.3.单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚焦透镜或反射镜等组成，色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~400nm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或透射光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。 5.3.4.检测器有光电管和光电倍增管二种。 5.3.5.紫外分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同，可分为单光束和双光束分光光度计二类。单光束分光光度计有些仍为手工操作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸收度，操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但适用于单波长的含量测定。双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光路，使光分成样品（S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分离成两光路对应信号，信号的比值直接用记录仪记录，双光束分光光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求准确起见，仍宜用固定波长测量方式。 5.4. 紫外分光光度计的检定：
紫外－可见分光光度法 思考题和习题 1．名词解释：吸光度、透光率、吸光系数(摩尔吸光系数、百分吸光系数)、发色团、助色团、红移、蓝移。 吸光度：指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。 透光率：透过透明或半透明体的光通量与其入射光通量的百分率。 吸光系数：单位浓度、单位厚度的吸光度 摩尔吸光系数：一定波长下C为1mol/L ，l为1cm时的吸光度值 百分吸光系数：一定波长下C为1%(w/v) ，l为1cm时的吸光度值 发色团：分子中能吸收紫外或可见光的结构单元，含有非键轨道和n分子轨道的电子体系，能引起π→π*跃迁和n→ π*跃迁， 助色团：一种能使生色团吸收峰向长波位移并增强其强度的官能团，如-OH、-NH3、-SH及一些卤族元素等。这些基团中都含有孤对电子，它们能与生色团中n电子相互作用，使π→π*跃迁跃迁能量降低并引起吸收峰位移。 红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后，吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）；吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移） 2．什么叫选择吸收？它与物质的分子结构有什么关系？ 物质对不同波长的光吸收程度不同，往往对某一波长(或波段)的光表现出强烈的吸收。这时称该物质对此波长(或波段)的光有选择性的吸收。 由于各种物质分子结构不同，从而对不同能量的光子有选择性吸收，吸收光子后产生的吸收光谱不同，利用物质的光谱可作为物质分析的依据。 3．电子跃迁有哪几种类型？跃迁所需的能量大小顺序如何？具有什么样结构的化合物产生紫外吸收光谱？紫外吸收光谱有何特征？ 电子跃迁类型有以下几种类型：σ→σ*跃迁，跃迁所需能量最大；n →σ*跃迁，跃迁所需能量较大，π→π*跃迁，跃迁所需能量较小；n→ π*跃迁，所需能量最低。而电荷转移跃迁吸收峰可延伸至可见光区内，配位场跃迁的吸收峰也多在可见光区内。 分子结构中能产生电子能级跃迁的化合物可以产生紫外吸收光谱。 紫外吸收光谱又称紫外吸收曲线，为分子光谱，属于连续的带状光谱，是以波长或波数为横坐标，以吸光度为纵坐标所描绘的图线。在吸收光谱上，一般都有一些特征值，如最大吸收波长(吸收峰),最小吸收波长(吸收谷)、肩峰、末端吸收等。 4．Lambert-Beer定律的物理意义是什么？为什么说Beer定律只适用于单色光？浓度C 与吸光度A线性关系发生偏离的主要因素有哪些？ 朗伯－比耳定律的物理意义：当一束平行单色光垂直通过某溶液时，溶液的吸光度A 与吸光物质的浓度c及液层厚度l成正比。 Beer定律的一个重要前提是单色光。也就是说物质对单色光吸收强弱与吸收光物质的浓度和厚度有一定的关系。物质对不同的单色光选择吸收，具有不同的吸收能力，非单色光吸收强弱与物质的浓度关系不确定，不能提供准确的定性定量信息。
紫外-可见分光光度法标准操作程序 1 简述 紫外-分光光度法是通过被测物质在特定波长处或一定波长长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。本法的在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。 定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或百分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰化合物无吸收，则可用本法作检查。物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的。因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区(200-400nm)或可见光区(400-850nm)产生吸收。通常使用紫外分光光度计的工作波长范围为 190-900nm，因此又称紫外-可见分光光度计。 紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯－比尔（Lambert-beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：Ａ=log1/T=ECL 式中Ａ为吸光度； Ｔ为透光率； Ｅ为吸收系数； Ｃ溶液浓度； Ｌ为光路长度。 如溶液的浓度（Ｃ）为1%（g/ml），光路长度(L)为1cm，相应的吸收系数为百分吸收系数，以E表示。如溶液的浓度(C)为摩尔浓度(mol/L)，液 层厚度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。 2 仪器 紫外-可见分光光度计：主要由光源、单色器，样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。 可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯-为了满足紫外 和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。 单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~400nm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或透光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。 检测器有光电管和光电倍增管二种。 紫外-可见分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同可分为单光束和双光束 分光光度计二类。单光束分光光度计有些仍为手工操作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸收度，操作比较费时，用于绘制吸收
实验一紫外分光光度法测定苯甲酸 一、实验目的 学习、了解紫外分光光度法原理 了解紫外分光光度计的结构和使用方法 二、实验原理 当辐射能（光）通过吸光物质时，物质的分子对辐射能选择性的吸收而得到的光谱称为分子吸收光谱。分子吸收光谱的产生与物质的分子结构、物质所在状态、溶剂和溶液的PH等因素有关。分子吸收光谱的强度与吸光物质的浓度有关。表示物质对光的吸收程度，通常采用“吸光度”这一概念来量度。 根据朗伯－比尔定律，在一定的条件下，吸光物质的吸光度A 与该物质的浓度C和液层厚度成正比。即A＝ LC 因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出该溶液浓度，这就是紫外－可见分光光度计的基本原理。 在碱性条件下，苯甲酸形成苯甲酸盐，对紫外光有选择性吸收，其吸收光谱的最大吸收波长为225nm。因此，采用紫外分光光度计测定苯甲酸在225nm处的吸收度就能进行定量分析。 三、仪器与主要试剂 TU-1810紫外可见分光光度计1cm石英比色皿 0.1M氢氧化钠溶液 苯甲酸(AR) 四、实验步骤 1、苯甲酸标准溶液的制备 称取苯甲酸(105℃烘干)100mg,用0.1M氢氧化钠溶液100ml溶解后,转入1000ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度.此溶液1ml含0.1mg 苯甲酸. 2、制作苯甲酸吸收曲线,选择最大吸收波长 ①移取苯甲酸标准溶液4.00ml于50ml容量瓶中,用0.01M氢氧化钠溶液定容,摇匀,此溶液1ml含苯甲酸8ug. 以氘灯为光源,用0.01M氢氧化钠溶液作为参比,改变测量波长(从210-240nm)测量8ug/ml苯甲酸的吸光度. ②以波长为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制苯甲酸的紫外吸收曲线,并找出最大的吸收波长 (是否是225nm). 3﹑样品的测定 ①取10.00ml苯甲酸样品,放入50ml容量瓶中,用0.01M氢氧化钠
紫外-可见分光光度法简介 紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)，它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。 按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。 紫外--可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。 吸收光谱 描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖
于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为：式中的A 叫做吸光度；I0为入射辐射强度；I为透过吸收层的辐射强度；（I/I0）称紫藤为透射率T；ε是一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。 紫外-可见分光光度计 有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。②单色器[1]。它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。③试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为0.5～10厘米。④检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。 扫描的特点。⑤显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
紫外-可见分光光度法 紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸收度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmim。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。 仪器的校正和检定 1.波长由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。常用汞灯中的较强谱线237.83nm、253.65nm、275.28nm、296.73nm、313.16nm、334.15nm、365.02nm、404.66nm、435.83nm、546.07nm与576.96nm，或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正，钬玻璃在波长279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm、418.5nm、460.0nm、484.5nm、536.2nm与637.5nm处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，使用时应注意；近年来，尝试由高氯酸狄溶液校正双光束仪器，以10%高氯酸溶液为溶剂，配置含氧化狄（Ho2O3）4%的溶液，该溶液的吸收峰波长为241.13nm,278.10nm,287.18nm,333.44nm,345.47nm,361.31nm,416.28nm,451.30nm, 485.29nm,536.64nm和640.52nm。 仪器波长的允许误差为：紫外光区±1nm,500nm附近±2nm 2.吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，
一、实验目的： 了解朗伯-比尔定律的应用，掌握邻二氮菲法测定铁的原理；了解分光光度计的构造；掌握分光光度计的正确使用方法；学会吸收曲线的绘制和样品的测定原理。 二、实验原理 邻菲啰啉是测定微量铁的较好试剂。在pH＝2～9 的条件下，邻菲啰啉与Fe2+生成稳定的橙红色配合物，其反应式如下： Fe3+能与领二氮菲生成淡蓝色配合物（不稳定），故显色前加入还原剂：盐酸羟胺使其还原为Fe2+。。 三、仪器及试剂 紫外可见分光光度计、铁标准溶液：含铁0.01mg/mL、0.1%邻菲罗啉水溶液、10%盐酸羟胺水溶液、1mol/lNaAc缓冲溶液（pH4.6）。 四、实验步骤 1．吸收曲线的绘制和测量波长的选择 吸取0.0mL和6.0mL 铁标准溶液分别注入两个50 mL容量瓶中，依次加入5mlNaAc溶液，2.5ml盐酸羟胺溶液，5ml邻菲罗啉溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用1cm比色皿，以试剂空白为参比，在440~560nm之间，每隔0.5nm测吸光度。然后以波长为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。 2、标准曲线的绘制
分别吸取铁的标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml于6只50ml容量瓶中，依次分别加入5ml醋酸－醋酸钠缓冲溶液，2.5ml盐酸羟胺溶液，5ml邻菲罗啉溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10分钟，在其最大吸收波长下，用1cm比色皿，以试剂溶液为空白，测定各溶液的吸光度，以铁含量(mg/50ml)为横坐标，溶液相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 五、实验记录及数据处理 波长/nm 吸光度 标准溶液（0.01g/L）未知液容量瓶编号 1 2 3 4 5 6 7 吸取的体积0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 吸光度A （1）绘制曲线图。
紫外分光光度法检测规程 目的： 5. 程序： 5.1. 定义：紫外分光光度法是通过被测物质在紫外光区或可见光区的特定 波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的 方法，本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。 5.1.1. 定量分析通常选择在物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或百分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定。 5.1.2. 对已知物质定性可用吸收峰波长或吸收度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光区无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或在杂质的吸收峰处化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。 5.2. 原理：物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产 生的， 因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区（200-400nm）或可见光区（400-850nm）产生吸收。通常使用的紫外分光光度计的工作波长范围为190—900nm，因此又称紫外—可见分光光度计。紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯·比耳（lambert—Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为： A=lg 1 =ECL T 式中：A 为吸收度 T 为透光率 E 为吸收系数 C 为溶液浓度 L 为光路长度 如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应的吸收系数为百分吸收系数，以E１％ １ｃｍ 表示。若溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应吸收系数为摩尔吸收系数，以ε来表示。
紫外分光光度法测定未知样含量 (含方案、公式、标准误吸收光谱图) 1.仪器 1.1紫外可见分光光度计(T6型)； 1.2石英吸收池(1cm)：2只； 1.3比色管（50mL）10支； 1.4吸量管5mL：2支。 2.试剂 2.1苯甲酸标准溶液(0.1mg/mL)； 2.2未知液：浓度约为40～60ug/mL。 3.实验操作 3.1吸收曲线的绘制 3.1.1标准苯甲酸吸收曲线绘制 在一支50mL比色管中由2.1配制成浓度为0～10ug/mL范围内的溶液，以水定容，并摇匀。于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次测定吸光度，再次根据最大吸收波长，附近间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线，从曲线上确定苯甲酸的最大吸收波长（作为定量测定波长）。 附图：苯甲酸的吸收曲线。 3.1.2标准水杨酸吸收曲线绘制 在一支50mL比色管中由2.1配制成浓度为0～10ug/mL范围内的溶液，以水定容，并摇匀。于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次吸光度，再次根据最大吸收波长附近，间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线，从曲线上确定水杨酸的最大吸收波长（作为定量测定波长）。 附图：水杨酸吸收曲线。 3.1.3未知液吸收曲线的绘制 准确吸取含苯甲酸的未知液若干体积（5mL）于一支50mL比色管中，以水定容并摇匀。以蒸馏水为参比，于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次吸光度，再次根据最大吸收波长，附近间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线。（观察3.1.1和3.1.2各自所得吸收曲线有什么相同之处？这说明了什么问题？对于一个未知样品如何利用分光光度法进行定性？）附图：未知液的吸收曲线。 3.2吸收池配套性检查 石英吸收池装蒸馏水，于定量测定波长处，以一个吸收池为参比，测定并记录另一吸收池的吸光度（其偏差应小于0.5%，可配成一套使用，否则更换）作为校正值。 3.3校准曲线的绘制及未知样含量的测定 准确移取与未知样相同的物质的标准溶液若干体积于50mL比色管中，以水定容，制成一系列相同体积不同浓度的标准溶液（0～10ug/mL），在最大吸收波长处，以水为参比，测定各自吸光度。由实验数据计算回归方程及相关系数，以浓度（ρ/ ug·mL-1）为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标绘制校准曲线。 在相同条件下，测定样品稀释液（配制方法同3.1.2）的吸光度，代入回归方程计算出样品稀释液的浓度。试样平行测定三份。 4.结果计算 根据未知液的稀释倍数，求出未知溶液中水杨酸的含量。