2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。
GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。
北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地
亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。
下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
2.实验器材
2.1实验材料：
含GFP融合质粒，Top10菌株
2.2实验试剂：
质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2M NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；
转化：0.1M预冷CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；
GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；
疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；
离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，
Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）)
Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0) SDS-PAGE电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等
2.3实验仪器
高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。
3.实验方法
3.1质粒提取
1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；
2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；
3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；
4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；
5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；
6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm 离心8min，弃上清；
7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；
8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；
9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。
3.2感受态细胞的制备以及转化
1.取1.5mL Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；
2.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；
3.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；
4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；
5.42℃热激90s；
6.立即放在冰上3-5min；
7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；
8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。
3.3扩大培养
1.取含GFP 质粒的Top 10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；
2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL 的LB 液体培养基，100ng/ml 的Amp 和4mg/ml 的阿拉伯糖）37℃，200rpm 振荡培养至对数生长期（约3-4h ）；
3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mL LB 液中（Amp 工作浓度 100ng/ml ，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml ），37℃，200rpm 培养过夜。 3.4细胞破碎
1.将培养好的细菌3000g 离心10min ，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；
2.用30mL Lysis Buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA )悬浮沉淀；
3.向悬浮液中加15mg 溶菌酶，混匀后室温溶解10min ；
4.400W 功率下，超声处理10min ；
5.将破碎液9000g 离心15min ，紫外灯观察，留上清备用；
6.选取合适的浓度破碎(NH 4)2SO 4沉淀GFP ；一般(NH 4)2SO 4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP 沉淀量达最大附：(NH 4)2SO 4浓度与含量表，体积为10ml ；
7.向上清中加5.28g (NH 4)2SO 4，充分溶解，室温放置20min ，9000rpm
(NH 4)2SO 4饱和度
10% 20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
(NH 4)2SO 4（g ） 0.56
1.14 1.76
2.43
3.13 3.9
4.72
5.61
6.62
离心15min，转移上清至另一试管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用；
3.5疏水作用层析
1.将沉淀的GFP，用10mL 2M(NH4)2SO4/Lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）
2.用3倍体积平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；
3.将步骤1中的上清液上柱，用3倍柱体积的Washing Buffer
（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；
4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；
5.将收集液透析过夜。（3号样品）
3.6离子交换层析
1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min，弃去沉淀（4）；
2.用3倍体积的Start Buffer(A液)平衡柱子；
3.将步骤1中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的Start Buffer洗柱子；
4.梯度洗脱GFP，梯度液：Start Buffer(A液)、Elution Buffer(B液)，紫外灯观察，GFP快流出来时，准备收集
5.将收集液透析过夜(透析液为A液)。
3.7凝胶过滤纯化GFP
1.将透析袋置入含PEG10000的培养皿中，浓缩至体积约2mL；
2.用3倍柱体积的20mM Tris-HCl，pH7.0平衡柱子；
3.将步骤1中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外灯检测，GFP快流出时收集备用。
3.8 SDS—PAGE
将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。
1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。
2.分离胶的制备
按下列成分配制分离胶：
各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为浓缩胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层20%乙醇封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的乙醇，用滤纸吸干凝胶顶端的乙醇。
3.浓缩胶的制备
按下列成分配制2mL 5%的积层胶：
ddH2O
30%丙烯酰胺混合液1.0M Tris(pH6.8) 10%SDS
10%过硫酸铵TEMED 7.35mL 1.3mL 1.25mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL
ddH2O
30%丙烯酰胺混合液1.5M Tris(pH8.8) 10%SDS
10%过硫酸铵TEMED 8.2 mL 6.68mL 5.0mL 0.1 mL 0.1 mL 0.04 mL
各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。
4.待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。
5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。
6.样品在浓缩胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且
开始泳出胶底面，关闭电源。
7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇，0.05%考马斯亮蓝，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色45min，之后取出凝胶并回收染色液，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色1h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察结果并拍照。（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行SDS-PAGE。）
思考题
1.实验纯化效果如何？如果要得到较纯的GFP，你会采用哪些方法进一步纯化？
答：实验纯化效果请见实验结果分析。
2.SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分？它们有什么作用？为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸？
答：SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白质变形，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。
3.常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？
答：交联葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。
4.离子交换层析后，交换剂用什么方法再生后可以继续使用？
答：
5.简述疏水层析的原理和主要步骤。
答：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面
某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其他方法不易纯化的蛋白质。主要步骤有：首先用高盐溶液平衡柱子，使柱子暴露出疏水基团，然后在蛋白质过柱子后，最后换用低浓度盐溶液洗脱。
第7单元第2章现代生物技术 一、选择题 1. 下列应用实例与必须采用的生物技术，搭配错误的是应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 2. 在克隆哺乳动物的过程中，常用到（） A．发酵技术B．胚胎移植技术 C．人工授精技术D．转基因技术 3. 科学家成功地把人的抗病毒干扰素基因连接到烟草细胞的DNA分子上，使烟草获得了抗病毒能力。这项技术称为（） A．克隆技术 B．嫁接技术 C．组织培养 D．转基因技术 4. 以下有关基因工程的叙述，正确的是（） A．基因工程是细胞水平上的生物工程 B．基因工程的产物对人类都是有益的 C．基因工程产生的变异属于人工诱导变异 D．基因工程育种的优点之一是目的性强 5. 实施基因工程的最终目的是（） A．定向提取生物的DNA B．在生物体外对DNA进行改造 C．定向分离DNA D．定向地改造生物的遗传性状 6. 可以生产转基因食品的生物是一类（） A．提供外源基因的生物 B．转基因动植物 C．获得外源基因的生物 D．转基因微生物 应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 8. 下列生物均是在现代生物技术作用下形成的，其中利用的技术与其他不同的是（）A．巨型小鼠B．抗虫棉花 C．多利羊D．抗虫烟草 9. 可以创造出地球上原先不存在的生物的技术是 A.无性繁殖 B. 克隆 C .基因工程 D 组织培养. 10. “试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是( ) 。A．有性生殖B．无性生殖C．克隆技术 D．基因工程 11. 人奶营养成分的优越性是牛奶永远无法比拟的。最近中国工程院院士李宁教授率领的科研团队将人乳基因导入奶牛中，使之产生人乳化的牛奶。这种生物技术称为A．发酵技术 B．克隆技术 C．转基因技术 D．仿生技术 12. 生物的生殖方式分为有性生殖和无性生殖，下列个体的产生是通过有性生殖形成的是（） A．克隆绵羊B．组织培养的小麦幼苗 C．嫁接的柑橘D．试管婴儿 13. 据英国《每日邮报》 2010年12月26日报道，一位英国妇女在1998年通过试管婴儿技术受孕后，于次年产下两女，并将其余受精卵冷冻保存；11年后，她和丈夫成功利用当初保存的受精卵再获一个千金。“试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是（）。
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地
亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
现代生物学实验技术实验报告 实验一、超薄切片 一、实验目的 学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。 二、实验材料 植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞 三、实验试剂 2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、 Epon812包埋液、蜡油 四、实验器材 离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、 五、实验步骤 1、取材固定：从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞，切取 1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制 的2.5%戊二醛中固定1小时。 2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。 3、1％锇酸固定1小时，然后用缓冲液冲洗三次每次3～5 分钟。 4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－100％－ 100％每级5～10分钟
5、浸透：脱水剂：包埋剂=3：1 1小时 脱水剂：包埋剂=1：3 过夜 6、聚合：45 ℃12h 60 ℃24h 磷酸缓冲液0.2molL-1 PBS 配制 A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至1000ml B液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至1000ml 不同pH磷酸缓冲液的配制 pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 A液(ml) 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml) 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 Epon812包埋液的配制 Epon812树脂20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml
2、支持膜的制备 将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中，放置两三秒后将载玻片垂直取出。用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形，然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中，使膜飘在水面上，选取厚薄合适的膜，将膜放在载网上，以备后面用。 3、切片 首先制刀，将玻璃片制成梯形的刀片，以备切片时使用。将包埋块置于显微镜下进行修整，将其修为最上端为正方体。在切片机上进行切片操作，使切下来的样品片漂浮在水槽中。对切下来的样品块进行染色并观察。 六、注意事项 1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入 固定液中。并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组 织。组织块的大小一般为1mm3。 2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真 空的方法让样品沉入溶液中。 3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。 4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动 作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产 生气泡。
《分子生物学大（综合）实验》课程介绍 课程代码（学校统一编制） 课程名称分子生物学大（综合）实验 英文名称MolecularBiologyBigExperiment 学分：3修读期：第七学期 授课对象：生物科学、生物技术 课程主任：姓名、职称、学位 关洪斌，副教授，博士 课程简介 21世记是生命科学的世记,而分子生物学是带动生命科学的前沿科学。分子生物学是在生物大分子水平上研究细胞的结构、功能及调控的学科,在现代生物学学科发展中的重要性与不容置疑的带头作用是众所周知的。许多重大的理论和技术问题都将依赖于分子生物学的突破。随着分子生物学研究工作的不断深入,相关实验技术方法和技术日新月异的发展。为了适应分子生物学研究工作日益发展的需要,满足培养从事现代生物学研究,尤其是进行分子生物学研究的人才的需要,特设置分子生物学大（综合）实验课程。本课程的教学目标和基本要求是使学习者基本掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法,教学内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。通过本实验可提高学生的动手能力和创造性思维能力,较好地掌握分子生物学实验操作和技能，为今后独立进行科研工作打下坚实基础。 实践教学环节（如果有） 实验内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。 课程考核 实验报告 指定教材 自编 参考书目 1.分子生物学实验指导高等教育出版社施普林格出版社，1999 2.彭秀玲,袁汉英等.基因工程实验技术.湖南科学技术出版社,1997 3.吴乃虎.基因工程原理(上下册).科学出版社,1998 4.F.奥斯伯等著:颜子颖,王海林译.分子克隆实验指南(第二版).科学出版社,1998 5.J.萨姆布鲁克等著:金冬雁,黎孟枫等译.精编分子生物学实验指南.科学出版社,1993
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激
励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。
中国科学院遗传与发育生物学研究所博士研究生入学考试分子遗传学2003年 一、今年是DNA双螺旋模型发表五十周年。请回答以下问题（20分）： 1、在双链DNA分子中A+T/G+C是否等于A+C/G+T ？（4分） 2、DNA双链的两条链中是否含有相同的遗传信息？为什么？（4分） 3、大肠杆菌的基因组DNA的长度约为1100微米。请根据DNA模型估计其基因组的碱基对数目。（4分） 4、如果两种生物基因组DNA在四种碱基的比率上有显著差异，那么预期在它们编码的tRNA、rRNA和mRNA上是否也会在四种碱基的比率上呈现同样的差异？（8分） 二、在一牛群中，外观正常的双亲产生一头矮生的雄犊。请你提出可能导致这种矮生的各种原因，并根据每种原因提出相应的调查研究的提纲（注意整个调查研究工作必须在两个月内完成）。（20分） 三、请给出以下6种分子标记的中文全称、定义、检测方法及其在遗传分析中的特征。（20分） RFLP , microsatellite , STR , SSLP , SNP , InDeL . 四、在普通遗传学中，非等位基因间的相互作用有哪几种？请举例说明其中的两种相互作用？请从分子遗传学和分子生物学的角度对非等位基因间的相互作用的分子机制进行阐述，并举例说明。（20分） 五、有哪些诱变剂可以诱发基因突变？基于突变被辨认的方法，可以将突变分为哪几种类型？哪些类型的突变对功能基因组的研究最有意义？为什么？对一个已完成基因组测序的真核生物，如何构建一个突变体库，以揭示基因组中预测基因的功能？（20分） 中国科学院遗传与发育生物学研究所博士研究生入学考试分子遗传学2002 年 注：1、A卷考生必须回答下列5题，每题20分。 B、卷考生任选四题回答，每题25分。 一、请举出细胞中的各种RNA分子的名称、特征和功能。如何从RNA出发开展功能基因组的研究。 二、真和生物的基因表达控制（control of gene expression）和信号传导（signal transduction）有密切的关系，请举出一个你熟悉的例子分别说明这两个概念的含义及其联系。 三、目前已经有一些现成的软件用来预测基因组全序列中的基因。为了设计这些软件，你觉得哪些关于基因和基因组的分子遗传学知识是必须的？请说明理由。 四、在真核生物中转座子可以分为几种类型？请分述每种类型的结构和特征。如何利用转座子进行分子遗传学的研究和功能基因组的研究。 五、自从克隆的多利羊诞生以来，报界经常传播所谓克隆动物的缺陷，有一种说法是克隆动物会早衰，有人推测早衰的原因可能是：（1）被克隆的体细胞核的染色体端粒变短或（2）被克隆的体细胞核的基因表达程序已经处在发育上成熟的阶段。现在请你从染色体DNA复制的角度作支持第（1）种可能的阐述，并从基因表达调控的角度做反对第（2）中可能的阐述。 中国科学院遗传与发育生物学研究所博士研究生入学考试分子遗传学2001 年 （A卷考生必须回答下列五题，每题20分；B卷考生任选四题回答，每题25分）
实验六、植物种群自疏的内因和外因效应 一、目的 通过阅读文献材料，学习验证型实验设计、结果表达和分析的方法。掌握通过测定不同栽培密度和不同盐度的因子作用下，影响植物种群生长自疏效应的内因和外因的表达方式和强度。 二、原理 生态系统的结构与功能受到来自系统内部和外部的调节与控制，如森林植被过密时会产生自疏作用，间伐后的疏林会很快重新郁闭；生态系统中各营养级间生物的数量关系常常相对稳定等。这类受控的稳态是生态系统借助生物与环境的相互作用，达到稳态的作用结果。 种群在一定的生境条件下，种群数量会增长，但是并不是无限制的增长，会受到种群最大容量的制约，种群内部个体间的竞争会产生自疏作用使种群维持在一定的水平。自疏作用为种内斗争和资源供给状况的综合反映，森林植物、藤壶等是自疏效应的明显例子。 本实验将开展经济作物红麻（Kenaf，Hibiscus cannabinus）的模拟栽培试验。通过设定不同栽培密度，对其进行短时间的栽培试验记录，评价种群密度（内因）对种群自疏效应的影响。 三、材料与仪器： 实验材料：实验室将提供统一购置的红麻种子。种植所需土壤在校区内采集。 仪器：塑料盆4个/组、电子天平、烘箱、标签纸、记号笔等。 试剂： 海盐。 四、实验内容 4.1 试验设计 每个组自行设定不同的幼苗种植株行距处理3组，进行栽培和浇灌。
4.2 观察记录 八周内，每周固定时间对每盆内的作物幼苗进行观察，记录每棵植株的叶片数，以及每个处理的存活株数，每次每个处理需拍照记录1张。 4.3 生物量的测定 第八周将所有植株个体收获，小心地洗净，去除叶片、根上的砂粒泥土，放入烘箱烘干24h后，分成地上部和根部，进行称重。 4.4 分析数据，撰写报告 记录描述不同时间、不同处理的作物幼苗个体叶片数、存活率，以及八周内的生物量积累情况。
实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。
……………………….…………………………………………………………………………………姓名：杜宗飞专业：生物实验技术专业 院校：浙江大学学历：本科……………………….…………………………………………………………………………………手机：×××E – mail：×××地址：浙江大学
自荐信 尊敬的领导： 您好！今天我怀着对人生事业的追求，怀着激动的心情向您毛遂自荐，希望您在百忙之中给予我片刻的关注。 我是生物实验技术专业的2014届毕业生。大学四年的熏陶，让我形成了严谨求学的态度、稳重踏实的作风；同时激烈的竞争让我敢于不断挑战自己，形成了积极向上的人生态度和生活理想。 在大学四年里，我积极参加生物实验技术专业学科相关的竞赛，并获得过多次奖项。在各占学科竞赛中我养成了求真务实、努力拼搏的精神，并在实践中，加强自己的创新能力和实际操作动手能力。 在大学就读期间，刻苦进取，兢兢业业，每个学期成绩能名列前茅。特别是在生物实验技术专业必修课都力求达到90分以上。在平时，自学一些关于本专业相关知识，并在实践中锻炼自己。在工作上，我担任生物实验技术01班班级班长、学习委员、协会部长等职务，从中锻炼自己的社会工作能力。 我的座右铭是“我相信执着不一定能感动上苍，但坚持一定能创出奇迹”！求学的艰辛磨砺出我坚韧的品质，不断的努力造就我扎实的知识，传统的熏陶塑造我朴实的作风，青春的朝气赋予我满怀的激情。手捧菲薄求职之书，心怀自信诚挚之念，期待贵单位给我一个机会，我会倍加珍惜。 下页是我的个人履历表，期待面谈。希望贵单位能够接纳我，让我有机会成为你们大家庭当中的一员，我将尽我最大的努力为贵单位发挥应有的水平与才能。 此致 敬礼！ 自荐人：××× 2014年11月12日 唯图设计因为专业，所 以精美。为您的求职锦上添花，Word 版欢迎 下载。
江苏省南通市2009届高三生物最后冲刺之三 专题三现代生物科技专题 一、选择题 1．以下说法正确的是（） ①发酵工程获得优良菌种的方法有：诱变育种、杂交育种、细胞工程等 ②吞噬细胞和效应B细胞都能识别抗原 ③紫茉莉遗传物质的载体是染色体、线粒体、叶绿体 ④发生过敏反应时，往往会使细胞损伤、破坏和引起支气管痉挛等 A．①②③④B．③④C．②④D．③ 2．如图，在一定时间内使某种动物细胞吸收放射性同 位素标记的氨基酸依次先后出现在图中1、2、3、4、 5部位。在这一过程中分泌蛋白通过的生物膜磷脂分 子层数是（） A．4层 B．3层 C．2层 D．0层 3．下面对生物工程的应用成果说法正确的是（） ①用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备DNA探针可检测肝炎 ②鸡蛋白基因可在大肠杆菌或酵母菌中表达出卵清蛋白 ③在单抗上连接抗癌药物可制成定向消灭癌细胞的“生物导弹” ④利用发酵工程可获得大量微生物的代谢产物即单细胞蛋白 A．①②B．③④C．②③D．①④ 4．运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种，操作过程中能形成愈伤组织的是（） ①植物组织培养②植物体细胞杂交⑧动物细胞培养④转基因植物的培育 A．①②⑧ B．①②④ C．①⑧④ D．①②⑧④ 5．原核生物中某一基因的编码区起始端插入了一个碱基对。在插入位点的附近，再发生下列哪种情况有可能对其编码的蛋白质结构影响最小（） A．置换单个碱基对 B．增加4个碱基对 C．缺失3个碱基对 D．缺失4个碱基对 6．某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你认为错误的 7.有三个盛放葡萄糖液的密封瓶，已知一瓶混有酵母菌，一瓶混有乳酸菌，一瓶只有葡萄糖，
生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <
现代生物技术与人类生活 摘要：现代生物技术是在传统生物技术基础上发展起来的，以DNA重组技术的建立为标志，以现代生物学研究成果为基础，以基因或基因组为核心，生物技术产业以基因产业为核心，并辐射到各个生物科技领域。通过了解现代生物技术的基本概念和主要领域，以及对这些领域中产业的发展现状的分析，人们研究出针对这些问题的一些对策，得出现代生物技术对人类生存和生活带来的影响和结论，并对生物技术未来的发展做一定的展望和预期。 关键词：基因，领域，应用，展望 引言： 现代生物技术是当今世界发展最快、潜力最大、影响最深远的一项高新技术。被视为是 21世纪人类彻底解决人口、资源、环境三大危机，实现可持续发展的有效途径之一。所以世界各国都将生物技术确定为增强国力和经济实力的关键技术之一。我国也十分重视生物技术，并组织力量追踪和攻关。现代生物技术为什么会引起世界各国如此普遍的关注和重视呢？首先，生物技术是解决全球经济问题的关键技术，在迎接人口、资源、能源、食物和环境五大危机的挑战中将大显身手。其次，生物技术将广泛地应用于医药卫生、农林畜牧、轻工、食品、化工、能源和环境等领域，促使传统产业的改造和新兴产业的形成，对人类社会将产生深远的影响。所以生物技术是现实生产力，也是具有巨大经济效益的潜在生产力；是 21 世纪高新技术的核心。 1 现代生物技术在食品工业中的应用 1.1改良微生物的苗种性能 生物技术已用于啤酒酵母的改造，如将α-乙酰乳酸脱羧酚基因克隆到啤酒酵母中进行表达，可降低啤酒双乙酰含量而改善啤酒风味，日本生物技术专家还将霉菌的淀粉酶基因转入酵母中使其能直接利用淀粉生产酒精，省掉了高温蒸煮工序，可节约60%的能源，生产周期大为缩短。 1.2应用于食品酶制剂的生产
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
现代生物技术专题及经典例题解析 二、考点解读： 本讲知识属于现代生物科技及能够联系并应用于生产、生活实际中的技术。近几年的江苏、上海、广东各地的高考题中多次涉及本知识点的考题。概念题的题型一般多为选择题，与生产紧密相关的题及实验设计题多以非选择题形式出现。 生物工程也叫生物技术，是生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性科学技术。包括基因工程、细胞工程、胚胎工程等一系列的现代生物技术，关于基因工程、细胞工程、胚胎工程的材料题是近年来高考的热门知识点。通过对近2年江苏高考题的分析，本部分内容2007年约占26分，2008年约占33分，由此可以看出，本部分属于高考的重点内容之一。复习时要重视生物新技术在生产生活实践中的应用，重视各工程之间的相互关系，这既是科技发展热点课题之一，也是考试命题热点之一。利用已学过的基因工程、细胞工程、胚胎工程知识，对三大生物工程的联系加以融会贯通，提高分析综合与解决实际问题的能力。建议在复习过程中通过案例探究的方法，来提高学生的能力，可以选择现代生物科技的热点信息作为载体，将生物工程问题及必修中的相关知识融为一体，编制成简答题让学生进行训练，从而达到关注社会热点、激发兴趣、巩固知识、提升能力的目的。 三、主干知识整合 (一)基因工程知识小结 1、基因工程的工具 (1)限制性内切酶：生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(限制酶)。限制性内切酶是基因工程中最常用的切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，其中一类可
现代生物学仪器分析在生命科学研究中的应用 生命科学的发展与生物学仪器分析技术的进步密切相关，比如X射线晶体衍射对DNA双螺旋结构的发现起着至关重要的作用，而DNA双螺旋结构的发现奠定了现代分子生物学的基石，使微观世界的大门为我们敞开，让我们得以一窥微观领域的奇妙景象。一代测序技术的问世使人类得以提前完成人类基因组计划，第二代，第三代测序技术的出现，不仅大大降低了测序成本，还大幅提高了测序速度，并且保证了高准确性，为现代生物学的研究提供了强有力的帮助。诞生于上个世纪八十年代的生物质谱技术，为功能基因组，蛋白质组的研究奠定了基础。随着科学技术的发展，更精确，更快速，选择性更高，灵敏度更高的分析仪器以及新的技术和新的方法会不断的涌现出来，从而加速生命科学研究的不断发展。 现代生物学仪器分析中有“四大谱”和“三大法”。生物分子的结构分析最有效的方法就是“四大谱”：紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱和质谱。而生物大分子结构测定的最重要和应用最广泛的“三大法”分为X射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析和冷冻电镜。 紫外可见吸收光谱是通过研究溶液中生物分子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收情况对生物分子进行定性、定量和结构分析的方法。通常我们所说的紫外光谱其波长范围主要是为200～800nm。由于不同物质的分子其组成和结构不同，它们所具有的特征能级也不同，其能级差不同，而各物质只能吸收与它们分子内部能级差相当的光辐射，所以不同物质对不同波长光的吸收具有选择性。紫外可见吸收光谱应用广泛，不仅可进行定量分析，还可利用吸收峰的特性进行定性分析和简单的结构分析。近年来，随着生命科学领域的发展，紫外可见吸收光谱在生命科学领域应用的越来越广泛。比如利用紫外-可见吸收光谱对生物样品的定性分析，鉴定生物样品的种类、纯度等；还可以利用紫外-可见吸收光谱测定生物样品的浓度（蛋白质，核酸等） 红外—拉曼光谱在生命科学领域应用十分广泛，因为拉曼样品用量很少，不需要对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序，不仅操作简单，而且不会损伤样品从而能够获得样品最真实的信息。另外，生物大分子多是处在水溶液中，研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构和性能的关系非常重要。由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且单细