信号激酶AMPK通过组蛋白H2B的磷酸化作用来开启
应激调控的转录过程
哺乳动物单磷酸腺苷--活化的蛋白激酶（AMPK）是一种丝氨酸--苏氨酸蛋白激酶复合体，它是细胞内能量自稳机制的核心调控子。然而，在新陈代谢应激条件下，AMPK如何调控细胞的应答反应？这一机制仍不清楚。我们的研究发现，AMPK激活的转录过程直接关联于相应的染色质及其组蛋白H2B36位丝氨酸的磷酸化作用。AMPK的募集和H2B36位丝氨酸的磷酸化作用内共定位于依赖AMPK激活的基因，包括启动子区和转录区。通过对H2B异位表达，把36位丝氨酸替换成丙氨酸，结果显示在应激条件下，转录作用降低，RNA聚合酶Ⅱ与AMPK依赖型基因结合变少，而且细胞表现出较低的生存率。我们的研究结果表明，AMPK依赖型的H2B Ser36磷酸化作用直接参与转录途径和染色质调控途径，从而使细胞面对应激压力表现出一定的适应性。
信号传导途径通常会涉及到相关蛋白质的级联磷酸化反应，最后在核转录调控作用下结束。然而，这些通路过程的核心激酶并不是直接来调控转录过程。单磷酸腺苷--活化的蛋白激酶（AMPK）即是此类信号激酶的一种，当细胞处于能量胁迫情况下（如养分缺乏或者低氧胁迫），AMPK会被高浓度的底物--单磷酸腺苷所激活。AMPK的活化会开启一系列新陈代谢适应功能来维持细胞的能量体系（三磷酸腺苷的保存）和保持细胞的生存能力。
我们研究了AMPK信号途径中可能直接相关于转录过程的机制。首先，我们仔细研究了AMPK是否广泛地应答于细胞胁迫压力。我们将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行了一系列的胁迫处理，如紫外线照射，γ射线照射，拓扑异构酶抑制剂喜树碱处理，可插入DNA的试剂阿霉素处理，烷化剂甲基硝基亚硝基胍或过氧化氢处理。结果发现，AMPK会被上述任意一种试剂所激活【AMPK活性环结构处的Thr172磷酸化及底物ACCα(乙酰辅酶A--羧化酶--α)磷酸化】（图1A）。LKB1是哺乳动物的三个上游AMPK激酶之一，在生物能的胁迫下它可以激活AMPK途径。当应答于遗传毒性胁迫（紫外线照射）或新陈代谢胁迫作用【糖降解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）处理】，LKB1同样也会激活AMPK途径。（补充部分S1）
然后，我们利用野生型的MEFs以及AMPKα1、AMPKα2共缺失的MEFs （ampkα--/--）来检验应激条件下AMPK是否会影响细胞生存能力。实验结果表明，在受到新陈代谢胁迫（图1B和补充部分S2）、紫外线照射（图1B）或者过
氧化氢处理时，ampkα--/-- MEFs生存能力降低。这说明，当应答于各种新陈代谢胁迫及遗传毒性胁迫时，AMPK会提高细胞的生存能力。
我们的早期研究涉及到AMPK和LKB1在肿瘤抑制物p53依赖型的代谢胁迫及遗传毒性胁迫应答。我们对p53应答基因转录调控过程中的AMPK参与者进行了研究。无论对ampkα--/-- MEFs进行脱葡萄糖处理还是紫外线照射处理，其p21（一个特征明显的p53靶基因）的诱导表达量都表现出降低（图1C和补充部分S3）。特别是在葡萄糖调控的基因表达研究中，p21的表达降低率基本相似与敲除p53基因的效果（图1C）。其他p53依赖型基因，包括reprimo（TP53 dependent G2 arrest mediator candidate）、cyclinG（细胞周期蛋白G）、cpt1c（肉碱棕榈酰转移酶1C），在脱葡萄糖处理的ampkα--/-- MEFs中都有表达量降低的现象。但是，我们的对照基因gapdh（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，house keeping基因），却没有受到影响（图1C和补充部分S4）。我们在人类癌症细胞（HCT116结肠癌）中也观察到一个类似的胁迫依赖型转录缺陷（补充部分S5）。紫外线照射处理引发的细胞转录缺陷都是出现在DNA损伤修复位点下游调控，在lkb1 --/--、ampkα--/--细胞系中Chk1，Rad17，p53的磷酸化作用与对照组野生型的表征相似（补充部分S6）。由此，在细胞培养过程中，LKB1-AMPK信号通路广泛响应于不同的新陈代谢胁迫和遗传毒性胁迫，并且是众多p53依赖型基因极端胁迫诱导表达所必需的，从而提高细胞的生存能力。
图1. AMPK是应激依赖型转录所必需的，定位于应激—应答基因上。（A）当MEFs受到紫外线照射，γ射线照射（IR），喜树碱（CPT）处理，阿霉素（Adr）处理，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)或过氧化氢(H2O2)处理后，细胞内AMPK的活化（AMPKαpThr172）和ACCα磷酸化（ACCαpSer79）的Western blot。MEFs在UV、IR、CPT和Adr中暴露时间为6小时，
在MNNG、H2O2中处理30分钟。NT，未经处理；Glc，葡萄糖。（B）野生型（WT）MEFs 和ampkα--/--MEFs在受到特定应激情况时所表现的生存性。左框：葡萄糖脱除胁迫；右框：紫外线照射处理。（C）野生型、AMPKα缺失或p53 RNAi表达的MEFs在葡萄糖脱除胁迫后，相对于未处理细胞，p21，cpt1c和gapdh mRNA的表达情况（qPCR）。（D）在lkb1 --/--MEFs 经葡萄糖脱除胁迫后，WT或负显性（MUT）myc-AMPK与WT或无催化活力的(MUT)FLAG-LKB1共转染到处理的MEFs内进行ChIP观察到，都会被免疫共沉淀【见（A），补充部分S7】。Data represent means±SEM for n = 3。（E to G）在未处理（—），2-DG(15min)，或UV（6h）MEFs中内源性AMPKα2的ChIP结果（E）；野生型或ampkα--/--MEFs（F）；野生型或p53--/--MEFs（G）。Data represent means ±SEM for n = 3. #P < 0.06, *P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.03。
这些结果还有前期的结果都说明AMPK参与基因的激活，尽管其中的机制仍不是很明确。我们采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）和定量聚合酶链式反应（qPCR）来探究在MEFs中AMPK是否直接作用于p53调控的基因。我们发现响应于紫外线照射时，LKB1与AMPK会共免疫沉淀，这一相互作用会依赖于AMPK 激酶的活化（补充部分S7）。ChIP结果显示在响应于葡萄糖脱除胁迫和紫外线处理胁迫时，异位表达的myc-AMPK会作用于cpt1c和p21基因的启动子(图1D和补充部分S8)。异位表达的激酶缺失型myc-AMPKα或FLAG-LKB1终止了AMPK 与染色质的结合（图1D和补充部分S8）。FLAG-LKB1也类似的相关联于p21启动子（补充部分S9）。在无胁迫情况下，细胞内与启动子结合的AMPK或LBK1相对较少（图1D和补充部分S8、S9）。紫外线处理后，在人类HCT116细胞内也可以观察到AMPK与p21启动子结合（补充部分S10）。这一AMPK的活化看来好像是特定于响应胁迫压力来求生存，因为并没有观察到AMPK与PUMA（一种依赖于p53的促凋亡基因）启动子的结合（补充部分S11）。免疫沉淀及染色质免疫沉淀结果表明这是一个功能上激酶依赖型的反应，LKB1和AMPK会关联于启动子。
我们对内源性AMPK【使用AMPKα2的抗体免疫沉淀获得的蛋白(补充部分S12)】进行了染色质免疫共沉淀，发现当细胞被2-DG或紫外线处理后，会有更多的AMPKα2结合在cpt1c上游p53位点（图1E；绑定于p21启动子的结果见补充部分S13）。而在ampkα--/--细胞（图1F）和p53--/--细胞（图1G）中，这种特异性的结合相对减少。因此，当响应于细胞胁迫情形时，LKB1和AMPK会以相互依赖且依赖于p53的形式结合在染色体上来调控基因转录过程。
核心组蛋白的翻译后修饰包括磷酸化，主要起到转录调控功能。为了验证组蛋白是AMPK的底物，我们通过抗原表位标记了占优势的核心同工型AMPKα2和免疫沉淀的野生型AMPKα2或者一种催化突变体（Asp157 Ala）（来自于转染的ampkα--/--MEFs，通过低浓度葡萄糖诱导处理后激活了AMPK）。通过对催化突变体和模拟免疫沉淀的对比观察排除了四种组蛋白的非特异性背景干扰，我们发现野生型的AMPKα2复合体能够特异性的磷酸化组蛋白H2B（图2A）。来自未处理细胞的AMPKα2表现出的H2B活力比胁迫处理过的AMPKα2相对较低（图2B和补充部分S15）。H2A在这些分析过程也会磷酸化，然而，在模拟免疫沉淀中也会观察到磷酸化H2A且不会对胁迫响应，说明这一活力并非特异性的。这些数据表明活化的AMPKα2会特异性的磷酸化H2B。
对组蛋白H2B的分析结果显示AMPK的潜在靶点模体在N端的36位丝氨酸，这类似于AMPK的其他底物内皮型--氧化氮合成酶（eNOS）和磷酸果糖激酶2（PFK2），（H2B,Arg-Ser-Arg-Lys-Glu-Ser;eNOS,Arg-Ile-Arg-Thr-Gln-Ser;PFK2,Arg-Met-Arg-Arg-Asn-Ser）具有
保守性的P-5 Arg 残基和P-3相关联的磷酸基团接受子Ser36（补充部分S14）。因此，我们比对了H2B 1到20或21到42号残基构成的肽段，只有H2B 21到42号残基构成的肽段会被免疫沉淀的AMPKα2磷酸化。然而，S36A突变体H2B 21到42号残基构成的肽段没有发生磷酸化，S32A和S38A突变体H2B肽段发生了磷酸化（图2C）。而且，myc- AMPKα2对H2B 21到42号残基肽段的磷酸化作用比对腺苷甲硫氨酸合成酶肽段（His-Met-Arg-Ser-Ala-Met-Ser-Gly-Leu-His-Leu-Val-Lys-Arg-Arg，典型的AMPK靶向序列）的磷酸化效果更明显（图2D）。因此，在体外H2B Ser36是AMPK的一种稳定底物。
下一步，我们检验了在体内AMPK是否参与H2B Ser36的磷酸化作用。我们生成了H2B pS36 肽段的抗体而且在体内外大规模的表征化亲和纯化的抗体（补充部分S16）。H2B pS36 会出现在用2-DG处理过的细胞内，因为2-DG会诱导新陈代谢应激，表现在AMPKα和ACCα磷酸化的增加（图2E），然而其他组蛋白标记包括H3，K9me3 H3和pS10 H3并没有明显的变化（补充部分S17）。在ampk α--/--MEFs中，H2B pS36并不会由于2-DG的处理而增加（图2E）。通过两种典型的AMPK激活剂氨基咪唑氨甲酰核苷酸（AICAR）和苯乙基二胍处理细胞后，我们同样观察到类似的H2B pS36诱导（图2F）。另外，在lkb1 --/-- MEFs中并无H2B pS36，但是当加入LKB1再次诱导之后会发现H2B pS36增加，而且只有在LKB1存在的情况下2-DG才会刺激H2B pS36。这些结果表示H2B pS36磷酸化过程是体内LKB1-AMPK信号通路响应于广泛的新陈代谢应激的一个下游反应，而且在这一通路中AMPK似乎是最直接的激酶。这一广泛提升的H2B pS36或不仅仅局限于p53靶基因（图1G），因为在p53--/--细胞内H2B pS36的水平并没有减低（补充部分S19）。
图2. H2B是AMPK的靶点。（A to D）在ampkα--/--MEFs内通过myc-AMPK免疫共沉淀出的人类组蛋白复合体在体外的磷酸化结果。分别用玻璃粉、WT myc-AMPK或催化突变体（D157A）myc-AMPK处理。（右侧为myc Western blot）（A）；在含有葡萄糖及不含葡萄
糖处理的细胞内用myc-AMPK得到的人类组蛋白复合体（B）；H2B肽段（C）；H2B 21-42肽段和SAMS肽段（D）。（E）用2-DG(25mM处理10min)处理野生型或ampkα--/--MEFs和未处理MEFs的Western blot结果。（F）用AICAR(AIC,2mM)或苯乙基二胍（Ph,3mM）处理1h 后MEFs的Western blot结果。
我们发现在293T细胞内，转染的myc-AMPK和FLAG-H2B会相互交联应答于AMPK激活剂AICAR（图3A）。而在H2B S36A突变体内这一相互交联却没发生（图3A），说明36位的丝氨酸对AMPK与H2B间的相互作用是至关重要的。然后我们对野生型和ampkα--/--MEFs进行了染色质免疫共沉淀实验来检测H2B pS36是不是与AMPK依赖型基因相关联，尤其是在cpt1c启动子上的p53结合位点。应答于2-DG处理和紫外线处理时，H2B pS36染色质免疫共沉淀信号会增加，而且在AMPKα缺失细胞内ChIP信号又降回了背景水平（图3B）。
图3. 应答于胁迫刺激AMPK和H2B pS36会定位在染色体。（A）WT H2B或H2B S36A表达细胞在AICAR（1mM，24h）处理后myc-AMPK免疫共沉淀物的Western blot。WCL,全细胞裂解液。（B）野生型或ampkα--/--MEFs的ChIP结果。Data represent means±SEM for n = 3。（C和D）沿cpt1c基因的ChIP(C)和p21基因（D）。Data represent means±SEM for n = 3。*P < 0.01, **P < 0.05。
我们分别在标准条件和葡萄糖缺失条件下，对cpt1c进行了ChIP，使用的引物都是沿着启动子，转录区和上游或下游非转录区，来对比内源性AMPK和H2B pS36的定位（图3C，引物顺序1--7）。面对胁迫，在p53结合位点的H2B pS36会
增多（p53bs，2号引物），在转录起始位点会有更大的增加量（TSS，4号引物），在基因上游区（1号引物），或者这些位点之间的区域（3号引物），及下游都仅仅只有背景水平（7号引物）（图3C）。很明显，H2B pS36的关联性贯穿cpt1c 的转录区（5、6号引物）（图3C）。然后，我们使用AMPKα2抗体进行了ChIP，发现内源性AMPK和H2B pS36之间的细胞定位存在正相关性，也同样贯穿了转录区（图3C）。关于内源性AMPK和H2B pS36之间的细胞定位，其在p21基因p53结合位点和转录区域也显示出相似的正相关性，但是并没有遍及整个基因而且只应答于低浓度葡萄糖胁迫（图3D）。我们对gapdh基因进行了一个对照实验，结果显示在有应激和没有应激条件的细胞内ChIP并没有信号差异（补充部分S20）。在紫外线胁迫处理后，我们对cpt1c基因进行观察，也得到了相似的结果（补充部分S21）。当应答于低浓度葡萄糖胁迫时，异位表达的myc-AMPK也会沿着p21转录区定位而且需要AMPK催化活力（补充部分S22）。AMPK和H2B pS36细胞内定位的一致性暗含着AMPK在转录调控过程中的作用，AMPK与其靶基因转录区结合的H2B的磷酸化作用相关联。
图4. 面对新陈代谢胁迫，H2B Ser36对细胞转录和生存是必需的。数据分别是通过野生型H2B 和H2B S36A突变体细胞系获得。（A）单个MEF纯系（H2B，纯系5、6；H2B S36A，纯系4、6）在葡萄糖脱除胁迫后，特定基因的相对表达量（qPCR）。（B）葡萄糖脱除、2-DG(10mM)和苯乙基二胍（3mM）处理后，H2B或H2B S36A MEFs的生存性。（C）RNA聚合酶Ⅱ在cpt1c 基因上的ChIP结果。Data represent means±SEM for n = 3。*P < 0.05, **P < 0.01, #P < 0.03, ##P < 0.08。
我们生成了纯系的MEF细胞系可以稳定的异位表达FLAG-H2B或者突变体FLAG-H2B S36A，结果也如上所述，只有FLAG-H2B可以检测到与H2B pS36抗体有结合（补充部分S16）。通过Western blot检测，FLAG标签的野生型或突变体组蛋白H2B的表达水平都比内源性的H2B要低（补充部分S23）。但是，我们应用ChIP和qPCR检测cpt1c基因的启动子和转录区，发现异位表达的野生型或突变体S36A H2B都能相似的与染色质结合（补充部分S24），而且采用FLAG-H2B 免疫共沉淀了内源性的H3和H2B，结果看Western blot（补充部分S25）。我们分离出许多等量表达FLAG-H2B和FLAG-H2B S36A的表达纯系（补充部分S26）。这些细胞系受2-DG处理之后，显示出类似的AMPK水平、AMPK Thr172和pACC αSer79磷酸化诱导作用（补充部分S27），表明通向AMPK的信号并不受S36A 突变的影响。当受到脱葡萄糖处理后，野生型FLAG-H2B表达细胞内AMPK靶基因p21，cpt1c，reprimo和cyclinG的转录水平会提升；而在FLAG-H2B S36A表达细胞内这些基因表现出明显的诱导转录降低（图4A）。空白对照基因gapdh和hadh 的表达量并没有受到S36A突变的影响（补充部分S28）。因此，尽管FLAG-H2B 的表达量相对低于内源性H2B（补充部分S23、S25），但我们仍然在异位表达S36A 突变体H2B细胞内观察到了重要且特异性的转录缺陷。
下一步我们检测了这些细胞在受到各种新陈代谢应激如脱葡萄糖、2-DG和苯乙基二胍处理后所表现的生存力。我们发现异位表达S36A突变体H2B的细胞在受到这些胁迫时比异位表达野生型H2B的细胞具有更高的细胞死亡率（图4B）。
最后我们检测了RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）在基因上的占位性是不是被异位表达的H2B S36A所改变。ChIP分析显示PolⅡ会存在于整个cpt1c基因，而且当受到葡萄糖脱除胁迫时PolⅡ会增加（图4C）。在FLAG-H2B S36A细胞内，PolⅡ的ChIP信号在cpt1c基因转录区会有所降低，尤其是在受到葡萄糖脱除情况下（图4C）。这些数据意味着AMPK介导的H2B Ser36磷酸化在细胞面对胁迫改善细胞适应性，优化细胞生存能力方面起到关键的转录调控作用。
我们的结果表明：AMPK直接与染色质相关联来调节转录过程，这是细胞面临各种新陈代谢应激及环境胁迫时能够生存下来所必需的。哺乳动物AMPK是一种组蛋白激酶，可以优先对组蛋白H2B Ser36磷酸化。在体内，这一位点的磷酸化是高度依赖于LKB1-AMPK能量检测信号通路，而且贯穿于与其靶基因的直接相互作用。
AMPK和H2B pS36调控转录作用好像是通过激酶与H2B底物间的直接相互作用来完成。AMPK好像是被如p53这样的转录因子募集到特定的启动子区。AMPK可能会类似地影响其它胁迫诱导的转录活化剂，如Foxo3a，过氧化物酶体增生激活的受体 辅激活蛋白1α（PGC-1α）和调节CREB活力的转换器2（TORC2）。AMPK磷酸化H2B并与其共同结合在p53结合位点、沿着转录的cpt1c 和p21基因。这一模式可能是由于特定的酶募集激活子，然后再由酶沿着转录区运载完成，就如SAGA-Gcn5-Ubp8复合体和H3乙酰化伴随H2B去泛素化所观察到的模式。再就是在转录区，组蛋白甲基化酶类会与RNA聚合酶Ⅱ相关联来修饰H3。我们的发现为转录区的组蛋白磷酸化提供了证据，表明AMPK通过H2B Ser36磷酸化可能在转录延伸过程中起到作用。
异位表达的H2B S36A突变体，甚至在高水平的内源性野生型H2B存在的情况下，都会明显的降低AMPK靶基因的转录水平和应激生存力。因此，这一修饰作用可能在转录延伸过程中持续性的发挥作用。当然，H2B Ser36磷酸化会促进RNA聚合酶Ⅱ与转录区的结合。异位表达的组蛋白突变体基因可能对哺乳动物
细胞内其它已经受修饰的组蛋白具有长久的解决功效。
当细胞内新陈代谢紊乱时，作为真核生物内部分核心能量检测通路的AMPK 会维持细胞的能量平衡。我们的数据表明，AMPK修饰H2B磷酸化可能是一个通用的应激--响应通路，来调节特定的转录反应，调节细胞内的新陈代谢过程，提高细胞的生存能力。
(一)筛选结果鉴定: （1)基因组ＤＮＡ提取→PＣR鉴定外源基因 （２)SHG－44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-４4-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定Ｐ16蛋白表达(Westeｒn-blot)。 (3)测定外源性基因对ＳHＧ-４４细胞增殖的影响 ①流式细胞仪分析：SHG-４4、ＳHＧ－44-vect、SＨG-44-重组ｐｃDＮA3→单细胞悬液→７0%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、Ｓ期比例。 ②细胞生长曲线测定：SHG-4４、SHＧ-4４-vect、SＨG-44-重组ｐcＤ NA3→5×104/孔接种２4孔培养板→２４hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。 ③软琼脂克隆形成率分析:SHG－44、SＨＧ-44－vect、ＳHG-44－重组pｃDNA3→1０4细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→１－２周后计数不可少于５0个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。 三、注意事项 1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和ＤNA 混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体／DNA混合物无需滤过除菌。 ２、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体／ＤＮＡ与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。 3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。 ４、脂质体／DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。 常见问题和解答： Q：我觉得套环法操作不如９6孔办法效率高。 A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用９6孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆．即使是增加到每
自噬研究鼻祖的最终选择 细胞自噬是细胞应对恶劣环境的一种主动反应，就是将自身一部分动员出来，采用自吃的方式，作为能量物质来应对各种不利因素，细胞凋亡则是细胞整体的主动死亡方式，最近有研究发现细胞坏死也存在一种主动的方式被称为程序性坏死，细胞自噬也是一种程序性坏死的类型。细胞自噬（autophagy）是继细胞凋亡（apoptosis）后，近年来生命科学领域的又一热门研究方向。 比利时科学家克里斯汀·德迪夫主要的研究领与在生物化学与细胞生物学，上世纪50年代，他利用刚刚出现的细胞分级分离技术（通过超速离心来分离细胞成分），发现了溶酶体（lysosome）和过氧化物酶体（peroxisome），让人们对细胞内部结构有了更清楚的认识，极大推动了细胞生物学研究。1974年因“细胞的结构和功能组织方面的发现（for their discoveries concerning the structural and functional organization of the cell）”而与阿尔伯特·克劳德、乔治·埃米尔·帕拉德分享了诺贝尔生理学或医学奖。后来，随着研究的深入，德迪夫的兴趣逐渐转向细胞起源，例如内共生学说。 克里斯汀·德迪夫Christian de Duve在上世纪50年代通过电镜观察到自噬体（autophagosome）结构，并且在 1963 年溶酶体国际会议（CIBA Foundation Symposium on Lysosomes）上首先提出了“自噬”这种说法。因此克里斯汀·德迪夫被公认为自噬研究的鼻祖。目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和
Q：G418怎么配制？ A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES 溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。 Good answer: 推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES 的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度 15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml 就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？ A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul 加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。 Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？
细胞自噬的研究进展 孙雅婧，郭青龙* 中国药科大学生理教研室，南京210009 细胞自噬（autophagy ）是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解，以胞质内自噬体的出现为标志的细胞自我消化过程，以双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为判断指标。早在1962年，自噬现象的奠基人Ashford 和Porten 在人的肝细胞中用电子显微镜观察到了自噬现象。随着分子生物技术的发展，人们对自噬的形态特点和分子机制了解逐步深入。近年来对自噬的研究十分广泛，自噬是在体内普遍存在的过程，其在清除代谢废物进而回收能量为细胞正常运转提供能量的过程中发挥重要作用，因而对自噬的研究尤为重要。 1 细胞自噬的研究现状 1.1 自噬的过程 自噬的过程分为四个阶段（见图1）。 第一阶段：自噬诱导信号被细胞接受后，类“脂 质体”碗状结构即在胞浆某处形成小的膜结构，在电镜下观察到其不断扩张、呈非球形、扁平状双层膜的碗状结构，称为自噬前体（phagophore ），这种结构的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。 第二阶段：不断延伸的自噬前体，将胞浆中的若干成分（包括细胞器）收口包入，成为密闭的球状自噬体（autophagosome ）。自噬体的电镜观察结果是指示自噬发生的金标准之一。自噬体的特征有两个：双层膜，内含诸如线粒体、内质网碎片等胞浆成分。 第三阶段：自噬体形成后，可能与细胞内吞的吞噬泡（phagocytic vacuole ）、吞饮泡（pinosome ）和内 体（endosome ）融合（此阶段为非必需步骤）。 第四阶段：自噬体与溶酶体（lysosome ）发生融合，形成自噬溶酶体（autolysosome ）。期间溶酶体酶降解自噬体的内膜，使两者的内容物合为一体，自噬体中的包含物被降解，将产物诸如氨基酸、脂肪酸之类输送到胞浆中，重新利用供能，残渣则被排出细胞外或滞留于胞浆[1]。 1.2自噬的分类 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同， 哺乳动物细胞自噬分为3种主要方式：巨自噬（macroautophagy ）、微自噬（microautophagy ）和分子伴侣介导自噬（chaperone-mediated autophagy ，简称 CMA ）。巨自噬是最主要的自噬形式，在巨自噬中由 内质网来源的膜包绕待降解物，形成自噬体后与溶酶体融合并降解其内容物；然而在微自噬中，溶酶体膜直接内陷包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解，没有形成自噬小体的过程；分子伴侣介导自噬则为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到溶酶体腔中，被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶蛋白分子，因此CMA 降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性[3]。 2自噬与凋亡 在多细胞生物体内，维持自身的稳态和内环境 的平衡，是保持复杂生物体系正常运转的重要条件。正常的细胞体系当中，有细胞的生长增殖必然 摘要本文综述了细胞自噬概念的研究现状、自噬与凋亡、自噬与肿瘤的关系，展望了自噬在抗癌药物介导的细胞死亡中发挥的重要作用以及自噬现象的临床意义。 关键词自噬；凋亡；肿瘤 中图分类号 Q25；R979.1文献标志码A 文章编号1673-7806（2012）03-236-04 作者简介 孙雅婧，女，硕士生E-mail:yj7782@https://www.doczj.com/doc/006250243.html, 通讯作者郭青龙，男，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤药理学 E-mail:anticancer_drug@https://www.doczj.com/doc/006250243.html, 收稿日期 2012-03-14 修回日期2012-03-26* 图1自噬的基本过程[2] Jun;20(3) 236
G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。6个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到一个具体试验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的。1/2． . 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，
自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册
目录 1概念 2自噬的过程 3自噬的特性 4自噬过程的调控 5自噬与肿瘤的关系 6自噬的研究方法概述7汉恒自噬研究特色服务
自噬研究相关产品及服务 1.病毒工具（独家推出） mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发Th过程（具体内容后面有介绍）； 2.自噬相关服务 汉恒Th物可提供自噬研究整体科研服务，若您的时间紧张或是对实验有所顾忌，我们可以为您代劳部分实验内容； 3.自噬研究相关试剂 汉恒Th物可以根据您的实验需求为您提供最实用的试剂产品，让你用的放心，省心！
产品厂商规格A14292,Premo自噬TB/GFP TR-FRET invitrogen6000Tests LC3B抗体试剂盒 pllabs0.1mg Anti-MAP1A/LC3A/B自噬微管相关蛋白 轻链3抗体 pllabs0.1mg Anti-MAP1LC3A(microtubule- associated protein1light chain 3)自噬微管相关蛋白轻链3抗体 Invitrogen1mg/1ml 兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关 抗体\Anti-APG4B/AUTL1 BD1mg/1ml 自噬微管相关蛋白轻链3抗体\ Anti-MAP1LC3A Anti-SQSTM1/p62antibody abcam Sigma1g 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine （羟氯喹） mTOR抑制剂rapamycin Sigma20mM 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）Sigma100mg
G筛选稳定表达细胞系 经验总结 Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】
G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。 加药时间和维持浓度
自噬（Autophagy）及其研究方法概述 一、背景 概念: 目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy. 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。自噬的步骤可以大概总结为下面四步: 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部
揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显着区别
Protocal 1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时； b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可
发表时间：2011-6-2 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇[导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.
自噬现象及其分子机制的研究进展 发表时间：2011-06-02T10:04:12.903Z 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：刘杉珊李薇 [导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。 刘杉珊李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心吉林长春 130021） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04 【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与 p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。 【关键词】自噬分子机制 p53 近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。 1 自噬的概念 自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 2 自噬的诱导 当细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等应激时, 可引起细胞自噬的发生。雷帕霉素靶点TOR蛋白激酶(target of rapamycin)作为细胞中氨基酸、ATP和激素的感受器, 是调控细胞生长的关键因子之一,其是细胞氮水平的负调节剂，参与自噬反应的调节[3]。研究表明, TOR对自噬反应的调节与细胞的营养条件有关,当营养充足时, 细胞中TOR被激活而抑制自噬，而当细胞处于饥饿状态时, TOR被抑制而促进自噬。在哺乳动物细胞中又有Tor蛋白，同时Tor蛋白也随着周围环境的改变来调节自噬但是调节机制要较酵母细胞复杂。在哺乳动物细胞中mTor的上游负调节有I型PI3K激酶，PDK1和AKt/PKB,而PTEN能拮抗PI3K而促进自噬。同时伴随着自噬的发生。TOR 的失活引起Atg结构的改变, 如Atg13p部分去磷酸化, 在营养充足时Atg13可高度磷酸化而不易于Atg1激酶结合从而抑制自噬发生。相反，在细胞处饥饿状态时Atg13可很快与Atg1结合，从而增加自噬。同时mTor可增强与Atg17p和Atg1p之间的相互作用,从而调节其激酶活性。 3 自噬过程 自噬其发生过程大致分为3个阶段：(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物（如蛋白质降解产物，细胞器和核糖体等）周围[3,4] ；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。因此自噬可被视为细胞的“回收工厂”，其不仅促进能量的利用同时转运无功能的蛋白和细胞器。而调节这个复杂的过程的分子水平有五个关键阶段[5]:（1）形成吞噬泡（2）Atg5-12复合物与Atg16L并且多聚化（3）LC3形成并且插入吞噬泡膜（4）包绕预被降解物（5）自噬体与溶酶体融合。 3.1吞噬泡的形成 酵母细胞的吞噬泡膜形成于PAS，而哺乳动物细胞吞噬泡膜来其于内质网[6,7]，高尔基体[3,8,9]等，甚至可能在严密调控下来源于细胞核[10]。酵母细胞形成吞噬泡膜需要Atg1激酶与Atg13和Atg17复合物，该复合物可能通过跨膜蛋白Atg9补充脂质而促进吞噬泡膜的扩增[4,11]。这个过程可通过Tor激酶调节，其磷酸化Atg13从而阻止其与Atg1激酶作用[13]哺乳动物细胞吞噬泡的形成过程仍需要进一步研究。III型PI3K激酶，Vps34和Atg6/Beclin-1在哺乳动物细胞的吞噬泡形成和自噬的作用已经很好的认识。Vps34参与细胞膜的形成，但其需要与Beclin-1和其他调控蛋白来选择性的参与自噬过程[14]。PI3P在吞噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用，Vps34与PI3K以PI为底物获得PI3P过程中，Vps34是十分重要的[15]。Vps34与Beclin-1作用可增加PI3P的水平。其他与Vps34与Beclin-1复合物结合促进自噬调节蛋白为UCRAG，BIF-1，Atg14L和AMBRA[16,17] ,或抑制自噬蛋白Rubicon, Bcl-2[18,19]. Beclin-1与Bcl-2结合可破坏Beclin-1与Vps34的作用，所以Beclin-1与Bcl-2，Bcl-XL作用与内质网可抑制自噬[21]。 3.2 Atg5-Atg12复合物形成 由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atgl2和LC3(Microtubule—associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程,在Atg 12结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用。有的两个泛素样蛋白系统参与形成Atg5-Atg12复合物和LC3, Atgl2首先由El样酶Atg 7活化，之后转运至E2样酶Atgl0，最后与Atg5结合，形成自噬体前体。Atg5-12复合物与Atg16L结合形成Atg5、Atgl2和Atgl6L 以复合物形式存在，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3-向自噬泡的募集。Atg5-12复合物不依赖于自噬的作用，一旦自噬体形成，Atg5-Atgl2-Atgl6L复合物就脱离胞膜，使之Atg5-12复合物不是自噬的标志物。 3.3 LC3形成 第二条泛素样蛋白加工修饰过程参与LC3B 的形成，LC3B由哺乳动物细胞Atg8同源染色体编码。LC3B 被Atg4分解，生成LC3B-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样LC3B-I也被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3B-II。LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。 临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些 无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
ERGIC3的稳定表达细胞株的建立与鉴定 郑翔，刘兴宇，李学英，吴明松* （遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义563000） [摘要] 目的构建ERGIC3基因的真核表达载体，通过将载体转染支气管上皮细胞株BEAS-2B，筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株，为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础。方法采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF 框的DNA序列；构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3，用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞；通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的细胞；单克隆化成为稳定转染ERGIC3细胞株；然后用定量RT-PCR和Western blot进行鉴定后，用划痕实验研究稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化。结果获得了4个ERGIC3稳定表达细胞株，这些细胞株的ERGIC3表达量远高于对照组细胞。稳定转染细胞株的迁移能力显著增强（P<0.05）。结论成功的构建了ERGIC3基因的真核表达载体pLXSN-ERGIC3；筛选出ERGIC3基因稳定转染支气管上皮细胞株且其迁移能力明显增加。 [关键词] ERGIC3；稳定转染；真核表达；肺癌 [中图分类号] Q782[文献标志码] A Construction and identification of cell lines with ERGIC3 gene stable transfection ZHENG Xiang, LIU Xing-yu, LI Xue-ying, WU Ming-song (Department of Cell Biology and Genetics, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563000, China) [Abstract]Objective To construct a eukaryotic expression vector carrying human gene ERGIC3 and to obtain human bronchial epithelial cell line stably transfected with ERGIC3, which provides the foundation of ERGIC3 in lung cancer. Methods The pLXSN retroviral vector was inserted the DNA fragment of open reading frame sequence (ORF) of gene ERGIC3 which obtained by PCR method. After the constructed pLXSN vector was transfected into the packaging cell, PT67 cell line for 48 hours, the replication-incompetent retroviral particles were harvested and infected the BEAS-2B cells. Screened with G418，the single cell clones were sought out and cultured which were stable transfection cell lines. Then the migration of the cell lines was tested by wound healing scratch assay. Results The vector carrying ERGIC3 was successfully constructed and 4 stable transfection cell lines were obtained, as well as the ERGIC3 expressions were higher than the control by real-time PCR and Western blot. The ability of the stable transfected cell line with ERGIC3 was significantly faster than the control cell (P<0.05). Conclusion The stable cell lines with expression [基金项目] 贵州省科学技术基金（黔科合J字[2013]2319号）；遵义医学院博士启动基金（F-655）。 [通讯作者] 吴明松，男，博士，研究方向：肿瘤细胞分子生物学，E-mail： hanyue4187@https://www.doczj.com/doc/006250243.html,。
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD 细胞自噬 细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一 种过程。这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持。很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。 自噬主要有三种信号通路： ●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用。这个过程研究得不是很清楚，膜内陷相关的GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。 ● 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接将细胞质蛋白 带到溶酶体。带KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp-2A聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜。 ● Macroautophagy大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。大自噬起始于吞噬泡装配点（PAS）的形成和 Unc51-likekinase (Ulk)复合体的组装，这启动了自噬小体的形成（图1）。接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin-1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3（酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物。最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。