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温度控制在蛋白质结晶中的应用?
鹿芹芹，解思晓，马晓亮，陈瑞卿，刘永明，王燕，尹大川
西北工业大学生命学院，空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，西安（710072)
Email: yindc@https://www.doczj.com/doc/0c367362.html,
摘 要: 蛋白质分子的三维结构信息主要通过 X 射线单晶衍射技术获得，生长蛋白质晶体是 X 射线衍射技术解析蛋白质分子结构的主要瓶颈问题之一。 因此， 获得高质量的蛋白质晶体 对于结构解析十分重要。 影响蛋白质结晶的因素很多， 这些因素可以归结为两个方面的影响： （1） 对可否结晶的影响， （2） 对晶体质量的影响。 温度控制是蛋白质结晶的重要影响因素， 但在实践中并未受到广泛重视。 本文总结了温度对可否结晶和晶体质量的影响， 分析认为温 度因素是提高结晶筛选成功率和晶体质量工作中应当考虑的重要方面。 关键词: 蛋白质结晶；X 射线衍射；温度
0 前言
X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质结构检测方法。PDB 数据库中已有超过 6 万个蛋白质结构，而其中 85%以上的结构是通过这个方法解析得到的。虽然如此，蛋白质 结构解析的速度仍然远低于新功能性蛋白质的研究需求速度。近几年，世界范围内有超过 1800 个基因组测序工程，其中 1500 个正在进行，335 个已经完成测序工作[1]，已经产生了 超过 320 万非冗余蛋白质序列[2]。因此，必须加快蛋白质结构的解析速度以适应蛋白质序列 测序工作的快速发展。 目前，生长大的衍射质量的蛋白质晶体仍旧是结构检测的最大障碍[3-5]。成功获得适合 衍射的蛋白质晶体分为两个步骤[6]：第一步是筛选结晶条件获得晶体。当前，稀疏矩阵法[7] 是应用最广泛的结晶筛选方法， 该方法利用大量不同的结晶溶液进行蛋白质结晶来寻找合适 的结晶条件。第二步是优化结晶条件获得衍射质量的晶体。 蛋白质结晶过程受多种因素影响，如沉淀剂类型、浓度、pH 值、温度等。由于溶液的 化学条件复杂，大多数研究着重在 pH 值、盐的类型、浓度和添加剂如聚合体或多羟基化合 物等条件上。虽然温度一直以来被认为很重要[8]，但是没有受到足够的重视。传统的蛋白质 结晶实验是在恒温条件下进行的， 应用最广泛的是 277K 和 293K[9]。 事实上很多蛋白质只有 在其适合的温度条件下才能结出晶体[10]。 温度对蛋白质结晶的影响，从本质上说是由于温度的改变引起蛋白质的溶解度的改变， 从而改变过饱和度，继而影响蛋白质的形核和晶体生长过程[11]。Christopher 等人[12]任意选 择 30 种蛋白质，发现其中 86%的蛋白质其溶解度受到温度的明显影响。通常温度变化 1K， 溶解度变化约 10% [13]。另外，在高沉淀剂浓度下，温度对蛋白质溶解度的影响显著减小[14]。 控制温度是重复结晶实验的先决条件[15]。 温度的研究主要集中在提高晶体质量[16]，提高结晶筛选成功率[17,18]，溶解性[19-21]，和形 核速率测量上[22]。温度诱导方法既可以提高蛋白质结晶筛选的成功率，同时也可以用来获 得高质量的蛋白质晶体。利用温度控制蛋白质结晶的方法有很多，我们将对恒温（筛选最佳 结晶温度）及变温下的蛋白质结晶研究进行综述。
国家自然科学基金（10772150）；国家博士点基金（200806990011）；新世纪优秀人才支持计划 （NCET-06-0885）；西北工业大学基础科研重点项目
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1 恒温应用于蛋白质结晶
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不同蛋白质的最佳结晶温度不同。 同一种蛋白质不同溶液体系下， 由于溶解度与温度的 关系不同[23]，最佳结晶温度也不同。同一种蛋白质，温度影响溶解度的趋势可以通过改变 沉淀剂的类型来逆转。如 Histamine and V8 protease (P6306)[23]在 100mM Na Acetate, 100mM NH4SCN, 20%(w/v)PEG4000， pH 5 的溶液中，其溶解度随温度增加而增大；而在 100mM MOPS, 100mM NH4Br, 80%(w/v)PEG400，pH 7 的溶液中，其溶解度随温度增加而减小。大 多数情况下，每种蛋白质在特定溶液条件下，均有自己的最佳结晶温度，因此需要考虑结晶 温度的优化。
1.1 溶液局部区域控制温度
蛋白质结晶可以通过两种方法实现：一种方法是异相形核，另一种方法是均匀形核。第 一种方法需要有诱导形核的表面， 而选择合适的表面是这种方法的关键因素。 第二种方法中 需要形核的过饱和度比晶体生长所需过饱和度高很多， 因此， 形核的数量和晶核生长的速度 都很难控制。温度可以用来控制晶核的形成数量和晶体的生长速度[24]。DeMattei 等人[25]发 展了一种控制形核和生长的方法， 该方法选择接近过饱和的均匀溶液条件， 在部分区域改变 温度使其到达过饱和， 从而控制形核的位置和数量。 通过这种方法控制溶液小区域的温度实 现更少晶核的形成，成功生长了高质量的溶菌酶晶体。
1.2 寻找最佳温度用于蛋白质结晶
每种蛋白质的最佳结晶温度是不同的。 在生长蛋白质晶体过程中， 需要寻找最佳结晶温 度。 由于重组云杉卷叶蛾抗冻蛋白[26]的微观不均一性导致这个蛋白很难结晶， Leinala 等[26] 通过在不同温度下筛选结晶条件，结果在 318K 下获得了衍射质量的晶体。研究发现，在最 佳结晶温度下生长蛋白质晶体减少了蛋白质分子本身动态构象的微观不均一性。GrpE 蛋白 是 DnaK 蛋白的辅酶， 是一种促进蛋白质分子正确折叠的分子伴侣[10]。 它是从一种最佳生长 温度为 338-345K 的嗜热菌中分离得到的，这种蛋白质必须在 313K 进行热处理才能生长出 晶体， 如果不进行热处理就没有晶体出现。 这是一个典型的温度诱导方法在蛋白质结晶中应 用的例子。 Bartling 等人[27]研究了温度对去铁铁蛋白结晶的影响。研究发现，在三种镉浓度下，随 着温度的增加最终导致了的晶体尺寸线性增加。在 312.5K 下生长的去铁铁蛋白晶体最大。 在低的镉浓度下，温度的影响更显著。随着镉浓度的增加，去铁铁蛋白的溶解性对温度变得 不敏感，这和溶菌酶一样。在高沉淀剂浓度下，蛋白质溶解度不依赖温度，而在较低沉淀剂 浓度下，溶解度强烈依赖温度[21]。 即使晶体形成后，温度也会引起蛋白质构象的改变[28]。为了抵挡 X 射线衍射源的辐射， 晶体一般需要保持在低温状态下， 低温可以增加晶体的分辨率， 但也有可能引起蛋白质构象 的改变。Dunlop 等人[28]对此进行了系统的研究：将同一种蛋白质晶体在三个室温和三个低 温数据进行了比较。结果显示，虽然低温下可获得高分辨率的结构和更精确更细节的信息， 但是它们系统地背离了室温结构， 甚至在结构核心部分观察到显著的区别。 这种变化在蛋白 质表面更常见。 这些区别会影响生物学的解释， 因为很多重要的生物过程发生在蛋白质表面。 因此，虽然在蛋白质结晶中可以获得高质量的低温数据，但是，室温数据仍是需要的，特别 是当研究的蛋白质特性对温度的改变很敏感时。
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1.3 最佳温度筛选装置用于蛋白质结晶
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温度的细微改变可以显著影响蛋白质的溶解度。例如，温度变化 0.5K 时，溶菌酶的溶 解性就会变化很大，由于这个原因，一些蛋白质的结晶温度需要精确控制。Landsberg 等人 发明了一种最佳温度筛选系统（Thermo-screen）[29]，该系统在一块 192 孔坐滴板上设置温 度梯度，温度范围 277-372K，最大温度梯度 20K，间隔精度 0.3K。系统可以同时检测 12 个恒温点下，16 个不同的结晶条件。 应用该系统进行了蛋白质结晶实验。 实验结果显示温度显著影响溶菌酶晶体的数量和尺 寸。在低温（~279K），每孔有数百个小晶体。从恒温 279K 增加到恒温 292K，292K 下产 生的晶体更少， 晶体尺寸更大， 质量更好。 这和增加温度而致溶菌酶溶解度增加的结果一致。 在优化温度 293K 和 294.5K 之间， 观察到每个孔有一些大的六角形晶体。 再增加温度到 303K 导致晶体尺寸的减小，这可能是由于溶解度增加过大或蛋白质已经变性。 人类肾上腺素合成酶苯乙醇胺 N -甲基蛋白(PNMT)的结晶实验结果相反。在较低温度 （~279K）下，观察到较少的晶体。随着温度的增加晶体数量减少，这和温度与溶解度的关 系相一致。在 282.5-285.2K 之间，晶体数量更少，晶体尺寸更大（大至 0.15mm）。然而， 随着温度的再次增加，晶体尺寸减小，数量增加，直至 293K，只能观察到大量的小晶体。 这些结果显示，优化温度在 283K 左右，PNMT 晶体形貌最好。而这个温度和大家先前用于 PNMT 结晶的温度（293K）不同。运用该系统得到过氧化氢酶的优化温度为~293 K。
1.4 筛选最佳温度方法用于蛋白质结晶筛选
Lin 等人[18,30]研究了不同温度下蛋白质的相图，比较了它们的形核区，发现温度改变了 形核区的大小， 增加了蛋白质的可结晶性。 例如， 当温度从 295K 变为 277K 时， Ribonuclease S 和 Trypsin 的形核区面积分别增加 2.4 和 1.6 倍，同时结晶成功率分别从 20.8%增加到 42.9%，从 12.5%增加到 25%。Chymotrypsinogen A 和 Concanavalin A 的形核区增加到 1.6 和 1.7 倍（温度从 277K 变为 295K），结晶成功率分别从 37.5%增加到 54.2%，从 43.3%增 加到 73.4%。因此，筛选最佳温度进行结晶，可以显著提高蛋白质的结晶成功率。一种新的 Epididymal-speci?c Lipocalin 蛋白质，通过筛选最佳温度，很快获得了第一个晶体，且晶体 分辨率达 1.97?。因此，用不同的温度，可以筛选到一些新的结晶条件。
2 变温应用于蛋白质结晶的研究
变温方法主要用于生长高质量的蛋白质晶体， 同时也应用于提高蛋白质结晶筛选的成功 率。 在提高蛋白质晶体质量方面， 通过改变温度控制溶解度的改变， 从而优化晶体生长速度， 生长高质量的蛋白质晶体。在蛋白质结晶筛选时，通常事先无法确定最佳结晶温度，通过温 度扫描方法可以覆盖更多可能结晶的温度点，从而获得更多的蛋白质结晶条件。
2.1 变温提高蛋白质晶体质量
2.1.1 温度扫描生长高质量蛋白质晶体 温度对蛋白质的溶解度有显著的影响。 有些蛋白质的溶解度随温度增加而增大， 如溶菌 酶；而有些蛋白质的溶解度随温度增加而减小，如糜蛋白酶原 A[31]。溶解度作为温度的函 数可用 Van't Hoff 公式进行表示[32]：
ln C* =
ΔH xtal +B RT
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式中：ΔHxtal 是形成蛋白质晶体时的焓变，kJ/mol；B 是熵变的参数；R 是摩尔气体常 数；C*是蛋白的溶解度，mg/ml；T 是相平衡时的绝对温度。由上式可知，当 ΔHxtal 为正值 时，蛋白质的溶解度随温度增加而增大；当 ΔHxtal 为负值时，蛋白质的溶解度随温度增加而 减小。一般认为，结晶时较大的焓值对应着晶体较大的表面能[33]。我们从一些文章中总结 比较了 ΔHxtal 的值，发现溶菌酶的 ΔHxtal 是负值，这意味着溶菌酶结晶过程是放热过程，因 此溶菌酶的溶解度随温度增加而增大。 而糜蛋白酶原 A 的 ΔHxtal 是正值， 意味着糜蛋白酶原 A 结晶过程是一个吸热过程，因此糜蛋白酶原 A 的溶解度随温度增加而减小。 Lu 等人[31]比较了溶菌酶在恒温（277K，305K）和逐渐增加温度程序（277K-305K，3K/ 天）对蛋白质结晶的影响，糜蛋白酶原 A 在恒温（277K，305K）和逐渐减少温度程序 （305K-277K，3K/天）对蛋白质结晶的影响。研究发现温度扫描（扫温）对溶菌酶的晶型 影响很大， 而对糜蛋白酶原 A 的晶型影响很小。 溶菌酶晶体在恒温 305K 时， 形貌为拉长状； 在恒温 277K 时，形貌变的更短、更厚。在扫温实验中，两种形貌都有。另外，恒温 277K 时与其他程序相比，晶体形貌缺陷更多（裂纹，应力碎片和深的裂口）。这是由于低温时， 高的过饱和度驱动晶体生长速度过高而导致晶体缺陷和杂质的合并。 温度扫描保持一个稳定 的晶体生长速度，生长出了更高质量的晶体[31]。
图 1 温度和蛋白质浓度关系的相图 Figure 1. Phase diagram illustrating the relationship with temperature and the protein concentration.
Budayova 等人设计了一个变温装置[34]，利用相图的知识，加入籽晶后，控制温度保持 晶体在结晶溶液的亚稳区， 以较低的晶体生长速度缓慢生长高质量蛋白质晶体。 了解相图中 蛋白质溶解度和温度的关系有利于控制温度生长高质量蛋白质晶体。 如图 1 所示为温度随蛋 白质浓度变化的相图示意图。在亚稳区形核不再产生，籽晶以较缓慢的速度生长。该方法利 用亚稳区的特点缓慢改变温度，保持晶体在亚稳区缓慢生长。此变温装置生长了高质量的 human γ-crystallin E, PA-IIL lectin, yeast inorganic pyropHospHatase, urate oxidase 和 human carbonic anhydrase II 晶体。 2.1.2 优化冷却速度方法生长高质量晶体 溶液过饱和度的控制对生长高质量蛋白质晶体很重要。 实验中可以通过温度来控制溶液 的过饱和度，冷却方法是生长大的高质量晶体的重要策略。然而，很少有人研究冷却速度对
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结晶过程的影响， 主要是因为没有便利的工具优化蛋白质结晶的冷却速度。 为了寻找理想的 条件， 研究者必须准备一些不同的温度控制工具， 利用不同的冷却速度进行结晶实验的对比。 Adachi 等人[35]发明了一种新的温度控制工具——即时控制温度（TAON）法，它可以在一个 结晶板上通过产生温度梯度来设定多个温度点。 后来他们对此装置又进行了改进， TAON 在 上增加电脑控制多个冷却速度[36]。改进的 TAON 能够同时在一块结晶板上控制多个冷却速 度来生长蛋白质晶体，从而更有效优化了蛋白质晶体生长。 该实验首先将溶菌酶结晶溶液在恒温 293K 让其自然形核，没有晶体出现。然后改变结 晶溶液温度，冷却速度为 1.5–4.0K/天，自动设定最终结晶温度为 283K。同时用控温箱快速 冷却样品从 293K 到 283K 作为对照。比较 HEWL 的结晶结果发现，在较慢的冷却速度下， 晶体数量明显减少。 这主要是由于较慢的冷却条件下， 形核发生在较高温度 （较低过饱和度） 。 相较而言，在快速冷却条件下，晶体在较低温度（高过饱和度）下形核，晶体数量更多。这 些结果显示在较慢的冷却速度下，蛋白质结晶过程变慢，生长了高质量的溶菌酶晶体。 2.1.3 变温保持恒定过饱和度方法生长高质量晶体 如果想优化生长大的适合 X 射线衍射的蛋白质晶体，有必要在结晶过程中控制恒定过 饱和度水平从而保持晶体的生长速率不变，这种方法叫做恒量过饱和度方法 [37] （CSC： constant supersaturation control）。该方法可通过控制温度而使蛋白质溶液在亚稳区保持恒定 的过饱和度来优化晶体的继续生长但不再形成核子。 恒量过饱和度方法的目的是在亚稳区保持恒定的过饱和度（ΔC）。过饱和度 ΔC= （C-C*），C 是溶液的浓度，C*是 T 时的蛋白质溶解度。假设只有一个晶体存在，总体蛋 白质量平衡：
M = ρk v L0 + Vso ln C0 = ρkv L(t )3 + Vso ln C (t )
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（2）
式中：ρ 是晶体里的蛋白质密度（晶体中每体积的蛋白质含量）；kv 是晶体体积形貌系 数；L0 是特征晶体尺寸的初始值；Vsoln 是溶液体积（不包含晶体）；C0 是溶液初始蛋白浓 度；L(t)是给定时间 t 时的特征长度；C(t)是给定时间 t 下的蛋白质浓度；t 是时间。因为没 有籽晶，因此 L0=0。 假定可以通过一个晶体尺寸方向的生长速度或线性生长速度（G）来表述体积的生长。 任意选择一个晶体方向的尺寸，L 来表征它的生长，建立一个 power law growth 模型：
G = dL dt = k (C ? C *)
n
（3）
Van’t Ho? 公式（1）给出了温度和溶解度的关系，结合公式 1，2，3 可以计算如何变 化温度保持恒定的过饱和度（ΔC）和恒定的生长速度（G） Schall 等人在 CSC 运算中， 用文献[38]中测得的 ΔHxtal 及生长速度参数 （k， ， n） 文献[39-41] 中溶解度数据（C*），计算出温度的变化。CSC 程序中温度变化范围为 293K 到 277K。该 程序可以从一个较低的过饱和度开始，控制晶体生长速度为一个恒值。应用 CSC 程序控制， 在 NaCl 溶液中溶菌酶晶体的生长速度恒为 7?/s。在较低的蛋白质过饱和度下，生长速度为 1-3 ? /s。Schall 等人用该方法生长了高质量的四角形溶菌酶晶体。 这项技术需要蛋白质的溶解度对温度很敏感，然而并非所有的蛋白质都如此。这时，可 以通过改变结晶溶液的成分来增加温度对蛋白质的敏感性。 选择电解液类型和浓度是增加蛋 白质溶解度对温度敏感的关键因素。 一般来说， 蛋白质的溶解性在低盐浓度下对温度的变化 更敏感。一种简单的测量蛋白质是否对温度敏感的方法是通过直接测量结晶的焓变（ΔHxtal）
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。ΔHxtal 值大则意味着溶解度对温度敏感。增加温度敏感性的优势是通过温度的微小改变
使过饱和度从相图中的形核区迅速移向亚稳区。在 NaCl 溶液中，当 NaCl 浓度从 1.25M 减 少到 0.75M 时，溶菌酶的 ΔHxtal 增加 3.8 kcal/mol（从 10.7±0.9 到 14.5±1.7 kcal/mol）。在 NaNO3 溶液中， NaNO3 浓度从 0.4M 变化到 0.2M 时， xtal 增加了 5.7 kcal/mol 当 ΔH （从 9.7±0.6 到 15.4±1.4 kcal/mol）。在 NaSCN 溶液中，当 NaSCN 浓度从 0.12M 减小到 0.1M 时，ΔHxtal 增加了 0.9 kcal/mol（17.5±0.8–18.4±1.0 kcal/mol）。这说明可以改变结晶溶液的成分来增加 温度对蛋白质的敏感性， 从而通过调节温度改变蛋白质溶解度。 此外， NaCl 中加入 NaSCN 在 和 NaNO3 低离子强度的盐，增加了蛋白质结晶对温度的敏感性。 将 NaCl 替换为 NaNO3 和 NaSCN，这些盐溶液条件在恒温下生长的晶体衍射质量差， 当调用 CSC 温度程序控制后晶体更大，X 射线衍射数据显示几乎没有缺陷[42]，分辨率为 1.62?。此外，在 CSC 温度程序下生长的晶体抗辐射损伤能力增强，在连续曝光下，可衍射 长达 45 个小时。但是，这种方法的局限性是需要大多数蛋白质的物理化学数据。
2.2 变温提高结晶筛选成功率
与恒温相比，在一个合理范围内变化温度可以增加结晶筛选的成功率。Zhang 等人[17] 采用温度循环策略（CTS: Cycling Temperature Strategy）研究了蛋白质结晶筛选成功率。变 温程序如图 2（a）所示[17]。首先温度用 t1 时间从 T1 线性增加到 T2，然后用 t2-t1 时间从 T2 线性减小到 T1。 在这项研究中， 温度增加和降低的速度相等，2=2t1。 t 其中 T1=277K， 2=303K， T t2=48h。对照实验中恒温为 277 K。 图 2（b）[17]显示了多种蛋白质在 CTS 程序下结晶条件筛选成功率得到提高的结果。当 蛋白质适合的结晶温度未知时，CTS 程序可用于提高结晶筛选的成功率。
图 2(a) CTS 程序的一个周期的示意图。在这个周期内，温度首先用 t1 时间从 T1 升到 T2，再用 t2-t1 时间减 小到 T1。温度增加和减小的速度是相等的，即 t2=2t1。(b) 比较变温策略（CTS）和恒温的蛋白质结晶筛选 结果[17]。 Figure 2. (a) Schematic illustration of a cycling period of a CTS program. In this period, the temperature is increased from T1 to T2 in time t1, and decreased to T1 in time t2 -t1. In the current study, the temperature increase and decrease rates are equal, that is, t2=2t1. (b) Comparisons of screening hits obtained by the CTS and the control[17].
3 结束语
生长高质量蛋白质晶体一直是结构生物学领域的瓶颈问题之一。 在众多影响蛋白质结晶 的因素中，温度控制是至关重要的，但一直以来没有受到广泛重视。本文总结了恒温（最佳 结晶温度）和变温对蛋白质结晶的影响。由于蛋白质的特异性，每种蛋白质的最佳结晶温度 有很大差异，有必要对温度进行筛选，这既有利于寻找到结晶条件，也有利于生长高质量蛋 白质晶体。而变温既可以用于生长高质量蛋白质晶体，当蛋白质的结晶温度未知时，在蛋白
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质结晶筛选过程中，变温也可以用来寻找结晶条件。因此，通过适当的温度控制，可以显著 提高蛋白质结晶筛选成功率及蛋白质晶体质量。可见，在蛋白质结晶过程中，对温度的控制 是不容忽视的。
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room-temperature data set?[J]. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 2005,61:80 29. Landsberg MJ, Bond J, Gee CL, Martin JL, Hankamer B. A method for screening the temperature dependence of three-dimensional crystal formation[J]. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 2006,62:559 30. Zhu DW, Garneau A, Mazumdar M, Zhou M, Xu GJ, Lin SX. Attempts to rationalize protein crystallization using relative crystallizability[J]. Journal of Structural Biology. 2006,154(3):297 31. Lu J, Wang X-J, Ching C-B. Batch crystallization of soluble proteins: effect of precipitant, temperature and additive[J]. Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials. 2002,45(3):201 32. Broide ML, Tominc TM, Saxowsky MD. Using phase transitions to investigate the effect of salts on protein interactions[J]. Physical Review E. 1996,53(6):6325 33. Ninomiya K, Yamamoto T, Oheda T, Sato K, Sazaki G, Matsuura Y. Morphology and solubility of multiple crystal forms of Taka-amylase A[J]. Journal of Crystal Growth. 2001,222(1-2):311 34. Budayova-Spano M, Dauvergne F, Audiffren M, Bactivelane T, Cusack S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth[J]. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 2007,63:339 35. Adachi H, Niino A, Takano K, et al. Temperature-screening system for determining protein crystallization conditions[J]. Japanese Journal of Applied Physics Part 1-Regular Papers Short Notes & Review Papers. 2005,44(6A):4080 36. Murai R, Nakata S, Kashii M, et al. Cooling-rate screening system for determining protein crystal growth conditions[J]. Journal of Crystal Growth. 2006,292(2):433 37. Schall CA, Riley JS, Li E, Arnold E, Wiencek JM. Application of temperature control strategies to the growth of hen egg-white lysozyme crystals[J]. Journal of Crystal Growth. 1996,165(3):299 38. Darcy PA, Wiencek JM. Estimating Lysozyme Crystallization Growth Rates and Solubility from Isothermal Microcalorimetry[J]. Acta Crystallographica Section D. 1998,54(6 Part 2):1387 39. Riès-Kautt MM, Ducruix AF. Crystallization of basic proteins by ion pairing[J]. Journal of Crystal Growth. 1991,110(1-2):20 40. Guilloteau JP, Ries-Kautt MM, Ducruix AF. Variation of lysozyme solubility as a function of temperature in the presence of organic and inorganic salts [J]. Journal of Crystal Growth. 1992,122(1-4):223 41. Ries-Kautt MM, Ducruix AF. Relative effectiveness of various ions on the solubility and crystal growth of lysozyme[J]. J Biol Chem. 1989,264(2):745 42. Jones WF, Wiencek JM, Darcy PA. Improvements in lysozyme crystal quality via temperature-controlled growth at low ionic strength[J]. Journal of Crystal Growth. 2001,232(1-4):221
The Effect of Temperature on Protein Crystallization
Lu Qinqin, Xie Sixiao, Ma Xiaoliang, Chen Ruiqing, Wang Yan, Yin Dachuan
Key Laboratory for Space Bioscience & Biotechnology, Faculty of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi’an (710072) Abstract Obtaining high quality protein crystal is one of the bottlenecks of structural determination by X-ray crystallography. Factors affecting the crystallization process of protein can be categorized into two groups: (1) those that affect the crystallizability, and (2) those that affect the crystal quality. Temperature is an important factor for protein crystallization, but it does not attract much attention in practical crystallization. This paper reviewed the past investigations and recent progresses on the effect of temperature on protein crystallization, and the applications of utilizing temperature control were also summarized and discussed. The temperature control was then proposed as an essential factor to be considered in terms of enhancing crystallizability and crystal quality. Keywords:protein crystallization;X-ray crystallography;temperature 作者简介： 鹿 芹 芹 ： 女 ， 1982 年 生 ， 博 士 研 究 生 ， 从 事 蛋 白 质 晶 体 生 长 机 理 的 研 究 E-mail: luqq@https://www.doczj.com/doc/0c367362.html,
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蛋白质芯片的综述 摘要蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，已在多个领域得到应用,如蛋白质组学研究、新药的开发、酶与底物的相互作用和疾病检测等。论文详细介绍了蛋白质芯片技术的原理、芯片介质及蛋白质的固定技术,论述了蛋白质芯片在肿瘤研究，食品检验的应用以及传染病检测中的研究概况。分析了蛋白质芯片的问题以及应用前景。 关键词蛋白质芯片，肿瘤，食品检验，传染病检测，应用 蛋白质芯片的研究工作起始于20世纪80年代,到90年代技术日趋成熟。蛋白质芯片(protein chip)技术因具有高通量平行分析、信噪比较高、所需样品量少,以及可直接关联DNA序列和蛋白质信息等优点,自问世以来,已广泛应用于蛋白质组学、医学诊断学等领域研究,具有广阔的发展。 1.蛋白质芯片介绍 1.1 技术原理 蛋白质芯片是由固定于不同介质上的蛋白微阵列组成,这些蛋白包括抗原、抗体及标志蛋白,然后用标记的或未经标记的另外一个蛋白,如抗原、抗体或配体进行反应,有的需要经洗涤后再加入标记的二抗进行反应,从而达到放大抗原抗体反应的目的。所用的标记物有荧光物质,如Cy3(青色素,一种荧光染料)和Cy5等;酶,如辣根过氧化物酶,化学发光物质等;其他分子,如免疫金标记,然后再进行银染对反应结果显色。反应结果用扫描装置进行检测或用肉眼直接进行观察。 1.2 蛋白质芯片的介质 目前作为蛋白芯片的介质有滤膜类、凝胶类和玻璃片类,前2种介质的优点是能够保持所固定的蛋白的三维结构,但缺点是由于其质地较软,所以不能满足机械点样的强度,同时凝胶类的蛋白质芯片所点样品容易发生扩散。玻璃片的优点是成本低和性能稳定,可满足高强度的机械点样。此外,20世纪90年代中期发展的液相芯片技术使蛋白芯片技术得到进一步提高。其被喻为后基因组时代的芯片技术,也可称为灵活的多种被分析物质的检测 ( flexible multi-analyte profiling,xMAP)技术,xMAP技术是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术,这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起,使生物芯片反应体系由固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系,因此也被称为液相芯片技术[1]。 光学蛋白芯片也是新发展起来的一项技术,是将高分辨的椭偏生物传感器技术和集成化多元蛋白质芯片技术相结合发展形成的生物分子识别和检测技术。该技术的优点是无需标记待检样品,无需预处理直接检测非纯化分析物,样品用量少,检测时间短并且可以进行多元检测。 1.3 蛋白质的固定 将蛋白质固定于芯片上的方法很多,各方法的最终目的是在单位面积/体积上固定最大量的蛋白质并保持其天然构象,该环节成为蛋白质芯片技术的关键步骤之一。 蛋白质的固定可以分为两类:非专一性固定和专一性固定,非专一性固定即通过被动吸附的方式使蛋白质结合到相应的介质上,如硝酸纤维素膜和多聚赖氨酸包被的玻片通过被动吸附蛋白质的氨基或羧基来固定蛋白质,此方法产生的芯片背景值往往较高。 1. 4 蛋白质芯片的检测
蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载体（expression vector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～50mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。
综述摘要 创新中药及其在我国的发展 邓文龙(四川省中药研究所,成都610041)本文就创新中药的定义、标准及创新中药在我国的发展进行了讨论。作者认为一流的临床疗效或独特的作用机理是创新中药的首要条件,按药物有效成分的有效剂量进行质量控制是创新中药的基础。 蛋白质组学及其在疾病研究中的应用 段春燕综述,何涛审校 (泸州医学院生物化学教研室,四川泸州646000) 目前人类基因组计划已进入后基因组时代,1994年Mac Wilkins与Keith Williams首先提出了蛋白质组学(prot eomics)的概念。依赖于二向电泳、质谱技术及生物信息学等多种手段的蛋白质组学分析在肿瘤、心血管系统、内分泌系统、神经系统及感染性疾病等的研究中得到了充分的应用,从整体的蛋白质水平上,在一个更深入、更贴切生命本质的层次上来探讨和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质。 蜂毒的现代药理研究及临床应用概况 夏隆江 (成都中医药大学药理教研室2004级博士生,成都610075)蜂毒是蜜蜂科昆虫中华蜜蜂Apis cerana F abricus等之工蜂尾部蛰刺毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的淡黄色透明毒液,是具有多种药理学和生物学活性的复杂混合物,主要由多种肽和酶类活性物质组成。它具有较广泛的药理作用:1、对心血管的作用:蜂毒有明显的降血压作用,其作用类似于组胺,是通过扩血管实现的;同时,蜂毒对心肌具有正性频率和负性肌力作用。2、对神经系统的作用:蜂毒有明显的镇痛作用和调节神经系统紧张度的作用。3、对血液的作用:蜂毒具有溶血、抗凝血和降低血栓素的作用。4、对呼吸系统的作用:蜂毒可使呼吸加快,大量的蜂毒可导致呼吸肌麻痹。5、对消化系统的作用:蜂毒有抗肝纤维化和吸收肝纤维化作用。6、对内分泌系统的作用:蜂毒对垂体、肾上腺皮质系统有明显的兴奋作用。7、对免疫系统的作用:蜂毒具有免疫抑制作用。8、抗炎镇痛作用:蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚美辛的70倍,具有极强的抗炎镇痛效果。另外,蜂毒还具有抗肿瘤、抗辐射、抗菌等作用。在临床运用方面,临床上蜂毒被广泛地用于治疗风湿性、类风湿性疾病、多发性硬化病、艾滋病、高血压、哮喘、白塞病、寻常型银屑病等,具有较大的研究前景和临床运用价值。 瘦素的研究现状 龙中奇(四川省达州中医学校,达州635000)本文对瘦素的生物学性质及生理生化功能作一综述。 帕金森病的研究进展 唐宗琼(四川省达州中医学校,达州635000)多种因素导致帕金森病(PD)发病,归纳起来有以下几种学说:1遗传因素学说;环境因素学说;氧化应激学说;免疫学说;细胞凋亡学说;o对PD治疗的探索:细胞替代疗法(CRT)治疗PD是目前研究PD的热点,CRT治疗PD的目的是重建纹状体受损的多巴胺(D A)能神经支配,重建脑功能。根据供体的不同,PD的CRT治疗可分为:自体肾上腺髓质移植、同种异体胎脑移植、异种胎脑移植和干细胞移植。其中,自体肾上腺髓质移植经临床研究证实嗜铬细胞植入脑内后存活率极低,无肯定的治疗作用而已被淘汰。 胃肠肽类激素对摄食活动的调节 孙玉锦(雅安职业技术学院,雅安625000)摄食是复杂的行为,是一种精神活动,它包括觅食、食物的摄取、消化、吸收和利用,摄食是人类以及所有动物维持生命活动的最基本最重要的功能之一,摄入的食物经过消化和吸收过程为机体提供必须的能量和营养物质。虽然摄食作用作为一种本能生来即有,但实际上摄食活动是受体内复杂的神经和体液因素调节的,涉及到神经中枢、传入传出神经以及许多神经递质和激素。本文仅讨论胃肠肽类激素对摄食活动的调节。 将饱食大鼠的血液注入饿鼠血管内,可抑制饿鼠的摄食活动,这个事实提示血液中含有控制摄食的信息。这种信息是什么?推想饥饿使人或动物在短时间内大量进食,在食物未完全消化吸收之前,就因产生饱感而停止继续进食,究其原因很可能是食物与胃肠粘膜接触后,引起胃肠肽类激素释放,胃肠肽类激素通过血液循环,作用于下丘脑,兴奋饱中枢)下丘脑腹内侧核(VMH),抑制摄食中枢)下丘脑的外侧区(LHA),从而停止摄食。影响摄食活动的胃肠肽类激素较多,但其中只有少数胃肠肽类激素对摄食调节有生理意义,大多数胃肠肽类激素需要给予药理剂量才对摄食活动发生影响。本文介绍了体内多种胃肠肽类激素:胆囊收缩素、阿片肽、铃蟾肽、胰高糖素、胰岛素、酪神经肽、胃动素、甘丙素、生长抑素、雨蛙肽等对摄食有促进或抑制作用,目前对它们作用的许多环节还不完全清楚,但随着研究的不断深入,其与摄食有关的许多问题将会逐渐得到阐明。 实验研究摘要 松龄血脉康胶囊对自发性高血压 大鼠的降压作用及机制初探(摘要) 万莉红,熊文碧,朱玲,刘蓉,谢芬,刘嘉琴,周黎明*,李崇前1,张顺华1 (四川大学华西基础与法医学院药理教研室,四川成都610041;1成都康弘集团#博士后工作站,四川成都610036)目的:探讨中药松龄血脉康胶囊胶囊对自发性高血压大鼠是否具有降压作用,并初步探讨起作用的机制。方法:雄性自发性高血压大鼠(SHR)60只,随机分为高血压模型组、卡托普利组、Vc 组、松龄血脉康胶囊组四组,并设立正常血压大鼠(WKY)15只作为对照组,用BP26动物无创血压测试仪试验前测定各组动物的基础血压。(1)各组分别给予生理盐水、卡托普利12.5mg#kg-1、Vc50mg#kg-1、松龄血脉康胶囊胶囊750mg#kg-1灌胃,每日一 133 四川生理科学杂志2005;27(3)
现代商贸工业 ２０１９年第１６期 ７９ 一间不了解,往往会错过报名时间而与心仪的证书擦肩 而过.２．４一学生缺乏清晰的职业规划 据调查,大多数的学生对自己的所学专业并不是很了解.并认为自己在大学期间对本专业的学习比较浅显,缺乏实践.对自身未来就业感到十分迷茫,对自己专业的就业前景知之甚少.这种没有结合自身实际的职业规划,就会对学生考取证书的选择有较大的影响.２．５一学生的考证成本较大 大学生目前的考证方式主要有两种:自学和报班.报班的话,费用和时间成本会较高.且社会上的考证机构参差不齐,学生较难判断.自学的话,难度较大.时间成本会更高.学生考取证书所付出的精力会更多.这可能会影响学校的正常学习.可能会出现本末倒置的情况.且社会上考取证书的参考资料品质不一.学生难以判断选择最适合的考证资料. ３一考证问题相应的对策 ３．１一学生角度对策 (１)理性考证,切忌盲目跟风,证书并不是越多越好,分析自己所在的专业,了解与自己专业相关的证书,合理的安排考证和学校课程的时间,千万不要忽略学校授予的专业知识.证书或许能为你找工作提供一定的帮助,但真正让你立足于社会的是自身的能力,保持理智,不可本末倒置. (２ )做好自己的职业生涯规划,让自己对未来有一个明确的目标,然后根据这个目标,去选择能帮助到自己的证书,同时观察市场行情和国家形势,选择恰当的目标和时机去考取证书. (３)在考取证书的时候,一定要去了解该证书的详细信息,如考证费用二难易程度等,考取好的二知名度高的证书往往代表着你要投入大量的时间二金钱和精力,结合自身的实际情况来选择证书,适合自己的才是最好的.在选择培训机构的适合,一定要选择权威的二正式的机构,切勿贪小便宜而因小失大.３．２一学校角度对策 (１ )应帮助同学们建立起正确的三观二就业观,如东南大学成贤学院就应设立相应的讲座和课堂,为同学们讲解关于以后踏入社会的相关知识,培养大家独立二理性解决问题的能力. (２ )在校内设立与考证相关的导师机构,为同学们考证排忧解难,给出建议,避免学生盲目跟风,为考证不顾学业.同时要适当的疏导同学,避免对学习和就业产生过多的压力. (３ )学校需要做好一个合理引导的角色,应当不断完善学生的就业指导与服务体系,帮助学生树立正确的就业观念与明确的职业规划,端正考证动机,摒弃不良的考证心态,妥善处理好在校学习与考证学习的关系,让学生明白只有扎实提高自身能力与素质才会使自己终生获益.３．３一社会角度对策 (１ )用人单位应该完善用人的标准和要求,不以证书的数量来衡量学生的能力,用人标准和要求应多注重大学生的综合素质和实践能力. (２ )国家对于各种证书的认证要严格,对于各种培训机构要进行认真清理,不合法的要坚决取缔,考证不能成为不良居心的人利用应试考试赚取钱财的手段.同时加强考场管理,坚决反对作弊等现象的发生,为考证提供一个可信的平台,树立证书的权威性. (３)政府要做好用人单位和学校之间的沟通与交流,建立合作平台,保证人尽其用.优秀的大学生是社会紧缺的人力资源,为了避免这一人力资源的浪费,搭建企业与学校直接对接的桥梁是必不可少的,可以在为企业寻找需求的人才的同时,给予大学生实践和学习的机会. 参考文献 [１ ]关化少．我国本科应用型创新人才培养之特点二价值与理论期待[J ]．北京教育,２０１５,(０５)．[２]舒程． 考证热 背景下大学生创业与就业能力培养分析[J ]． 赤峰学院学报,２０１７,(０２)． [３]费芳．大学生 考证热 亟需正确引导[J ]．湘声报,２０１５,(０１)． [４]李晓娜．大学生 考证热 现象的经济学分析[J ]． 经济研究导刊,２０１４,(２４)． 蛋白质组学及其应用研究 魏东阳 (宝鸡中学,陕西宝鸡７２１０００ )摘一要:蛋白质组学的概念最早是由澳大利亚学者W i l k i n s 和W i l l i a m s 于１９９４年提出, 细胞二组织或者机体的基因组所表达的全部蛋白就称为蛋白质组学.蛋白质组学是一个研究蛋白质组及大范围蛋白质的分离二分析二应用的学科.它不同于传统的利用生物化学的方法研究单个蛋白质或某一类蛋白,而是在大规模水平上研究体系内全部蛋白质及其动态变化规律.随着学科的发展,蛋白质组学的研究范围也在不断完善和补充,通过查阅大量文献,总结蛋白质组学技术,并研究蛋白组学在生物医学二转基因技术二生物制药技术等领域的. 关键词:蛋白质组;蛋白质组学;蛋白质组学应用 中图分类号:F ２４一一一一一文献标识码:A一一一一一一d o i :１０．１９３１１/j ．c n k i ．１６７２Ｇ３１９８．２０１９．１６．０３４一一蛋白质组(P r o t e o m e )是由蛋白质(P r o t e i n )和基因组(g e n o m i c )两个词的组合而来,是指生命体(包括细胞二组织等)的一个基因组所表达的所有蛋白质.其主 要研究内容就是能在大规模水平上研究蛋白质的表 达二翻译后的修饰以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用,从而来了解蛋白质参与细胞二人体代谢及其他生命
说起蛋白结晶，中国可有着很悠久的历史呢。1965年中国首次人工合成了结晶牛胰岛素。这是第一个与天然蛋白有着相同性质并具有生物活性的人工合成蛋白，也是蛋白结晶的首个成功例子。2004年，中国科学院生物物理研究所常文瑞研究员发现的菠菜主要捕光复合物(LHC-II)的晶体结构，以封面形式在《Nature 》杂志上发表（图1）。 最近，饶子和院士等在《Nature 》杂志上发表文章，展示了禽流感病毒H5N1聚合酶内部的晶体结构。此外，饶教授已经解析出 了50多个重要蛋白质的晶体结构，包括艾滋病毒基质蛋白SIV-MA 、IgA Fc 受体（CD89，JBC 的封面，图2）、第一个SARS 病毒蛋白 -3CL PRO 。看着饶教授的丰硕成果，大家可能都很感兴趣蛋白结晶是怎么样做的，简单说吧，就是将表达目的蛋白的DNA 片段PCR 之后克隆到表达载体上，然后在大肠杆菌中诱导表达，得到大量的蛋白并纯化，摸索结晶条件，等它结晶（时间长短不定），拿到晶体之后进行X 射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。看上去似乎很简单，其实不然。在1971年蛋白数据库PDB （https://www.doczj.com/doc/0c367362.html, ）刚刚成立时，只有可怜的7个蛋白结构；不过蛋白结晶的方法也在不断改进，因此PDB 的结构数也呈指数增长，目前已达到了52684个。生物通就结合绕教授的文章，给大家解析一下蛋白结晶的过程。 图1 LHC-II 的晶体结构 图2 IgA Fc 受体的结构 1．蛋白表达和纯化 这个大家都比较熟悉了，简单说一说。用PCR 扩增目的蛋白的结构域。PCR 产物纯化后克隆到大肠杆菌表达载体上。饶教授在两篇文章中分别用了pGEX 6p-1（GE Healthcare ）1和pET-28a （Novagen ）2的载体，然后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行表达，再利用相应的层析柱纯化，如果需要的话，还要用蛋白酶将较大的标签切除。这一步的关键是得到大量纯化的蛋白质（>10mg ），其浓度通常在10mg/ml 以上，才能进行结晶条件的筛选。不过蛋白表达量高了，经常就会形成包涵体，所以还要优 化变复性的条件，使蛋白正确折叠。 2．蛋白结晶 蛋白质晶体的培养，通常 是利用气相扩散（Vapor Diffusion ）的原理来完成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～ 50mg/ml ）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋 白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态 2008年9月10日四十期第 4 页，共 21 页下一页 返 回
蛋白质的性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸和醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至 100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 5．操作 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀及变性 1．目的 （1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 （3）了解蛋白质变性和沉淀的关系。 2．原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀和凝固，蛋白质和重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
生物与环境工程学院课程论文 蛋白质芯片技术的研究与发展 学生姓名： 学号： 课程名称： 指导教师： 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
蛋白质芯片技术的研究与发展 XXX （浙江树人大学生物与环境工程学院081班浙江杭州310015） 摘要：蛋白质芯片是一种研究蛋白质组学的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，目前这一技术已经被广泛应用到生命科学研究的多个领域，如蛋白质组学研究，新药的开发以及疾病的临床诊断等，具体为用于构建蛋白质表达谱，进行受体一配体检测，靶目标和靶向药物筛选，蛋白质相互作用研究，肿瘤诊断等。本文从蛋白质芯片的概念、基本原理、制备及检测方法、蛋白质芯片的应用及展望方面对其进行综述。 关键词：蛋白质芯片；制备；应用；发展前景 生物芯片技术是20世纪80年代末才发展起来的，是一项融电子学、生命科学、物理学于一体的崭新技术，可分为DNA芯片、蛋白质芯片以及芯片实验室三类。伴随着人类基因组计划(HGP)的顺利实施，业已产生的大量DNA序列数据刺激人们去发掘湮没于其间的“珍宝”——功能基因组数据。因此，以生命活动的执行者和体现者——蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要。 蛋白质芯片的发展将会为蛋白质组学研究提供强有力的工具，从而推动疾病诊断、药物筛选、个性化药物的的生产和应用等发生重大革新。因此，利用蛋白质芯片分析蛋白质功能就必然是一种趋势。蛋白质芯片具有传统蛋白质检测技术所欠缺的优势，为蛋白质检测及蛋白质组学研究等方面开创了新的方式，对蛋白质检测及蛋白质组学研究等的发展期了推动作用。虽然蛋白质芯片技术为人们的研究提供可很大的便利，但其本身还有一些不足的地方，所以对其本身的研究还有很大的发展空间，是继基因芯片后的又一种用于生命科学研究的技术平台。 1 蛋白质芯片的概况 1.1 蛋白质芯片的概念 现在的蛋白质芯片[1]是指在固相支持物(载体)表面固定大量蛋白探针(可以
蛋白质芯片技术及其应用 发表时间：2016-05-24T14:14:25.390Z 来源：《医师在线》2016年1月第2期作者：布威海丽且姆·阿巴拜科日奥布力喀斯木·图尔荪[导读] 新疆维吾尔医学专科学校蛋白质芯片技术是研究蛋白质组的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。 (新疆维吾尔医学专科学校新疆维吾尔 848000) 摘要：蛋白质芯片技术是研究蛋白质组的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。该技术在对基因表达、抗原抗体检测、药物开发、疾病诊断等研究方面显示出快速、高效、高通量处理信息的能力。它不仅是蛋白质组学研究中强有力的工具，也是临床应用中疾病早期诊断、预后和治疗效果评测的新手段，其研究成果拓展了与人类健康更加贴近的应用领域。本文主要讲述了蛋白质芯片技术的原理和分类、制作、蛋白质芯片检测、及其在研究中的应用及前景进行了阐述。 关键词：蛋白质芯片、疾病诊断、应用。 1 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，它是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针作为配基以预先设计的方式固定在玻片、硅片或纤维膜等固定载体上组成密集的阵列，能够高通量地测定蛋白质的生物活性、蛋白质与大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量检测蛋白质。 2 蛋白质芯片的分类及检测方法 蛋白质芯片是一种高通量、微型化、自动化的蛋白质分析技术，根据其结合被测蛋白的介质不同，可以大致分为两大类:化学型蛋白质芯片和生物化学型蛋白质芯片[1]。 2.1 化学型蛋白质芯片该类芯片的构想来源于经典色谱的介质，芯片上所铺的介质可通过疏水力、静电力、共价键等结合被测样品中的蛋白质，然后用特定的洗脱液去除杂质蛋白而保留感兴趣者。其缺点是特异性较差，但目前仍占已商品化并得到广泛应用的蛋白质芯片中的大部分。这一方法具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点。 2.2 生物化学型蛋白质芯片该类芯片的基本原理是将已知的生物活性分子(如抗体、受体、配体、核酸等) 结合到芯片表面，来俘获样品中的靶蛋白。由于生物活性分子的多样性和高度特异性，所以其应用范围和前景都明显优于化学型蛋白质芯片。但由于蛋白质比DNA 难合成，更难于在固相支持物表面合成，且定位于固相载体表面的蛋白质容易因空间构象的改变而失活，造成了该类芯片的开发应用与商品化落后于化学型芯片。 2.3 蛋白质芯片的检测方法 目前在蛋白质芯片检测中应用最广的是荧光染料标记，原理较为简单、使用安全、敏感性高，且有很好的分辨率[2]。用荧光染料Cy3或Cy5直接标记待检测的蛋白质，或用荧光染料标记该蛋白质的二抗，和芯片上的蛋白质结合后，用激光扫描和CCD照相技术对激发的荧光信号检测，用计算机和相应的软件系统进行分析。对于低丰度的蛋白质样品来说，荧光和化学发光的检测方法的灵敏度低，近年来出现的滚环扩增方法对捕获的蛋白质的检测达到了飞摩尔的量级，有望改善荧光检测的灵敏度。蛋白质芯片联合表面加强激光解吸/电离-飞行质谱检测法。表面加强激光解吸/电离-飞行质谱仪具有分析速度快、简便易行、样品用量少和高通量等特点，可直接检测各种体液如尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液和各种分泌物等。 3.蛋白质芯片的应用 近来在蛋白质的固定、反应和检测等方面的研究进展为蛋白质芯片的走向成熟铺平了道路，许多研究者已经采用蛋白质芯片作为他们研究的工具。目前，蛋白质芯片被研究人员应用到生命研究的各个领域，如利用蛋白芯片发现新的蛋白并且阐明其功能；寻找与疾病有关或直接引发疾病的新蛋白；发现新的药物靶标和肿瘤标记物。 3.1 蛋白质芯片与疾病的诊断 微阵列的ELISAs在疾病的诊断中有广泛的应用前景，可以同时检测生物样本中的多个指标，敏感度高且需要的样本量少，试剂的消耗量少。在聚苯乙烯的96孔板上固定细胞因子抗体，在5～50ul样本中可一次检测9种细胞因子，检测的灵敏度达到1～10pg/ml，目前已有类似的细胞因子抗体芯片出现，一次可以检测50种细胞因子的表达，可以用于观测用药后病人对治疗药物的反应。抗原和抗体的相互作用可以用来发现食物中的变应原，将已知的多种变应原制成芯片，然后用病人的血清和芯片反应，可以及时找到变应原。通过和正常人血清反应芯片的比较，还可以更进一步研究过敏反应的机理，以及为什么不同个体对同种变应原有不同的反应。 3.2 肿瘤标志物的筛选与检测 近几年来，肿瘤的诊断与治疗虽然已经取得了巨大的进步，但是与人们的期望仍有距离，利用蛋白质芯片的高通量优点，可以使肿瘤标记物的发现和确认速度大大加快。Roboz等采用SELDI-TOSMS技术，分析了大肠癌患者与正常对照之间的血清蛋白图谱之间的差异，其中大肠癌患者高表达8.9kD蛋白，而9.3kD的蛋白呈低表达，正常对照组上述两个蛋白的表达情况与患者组正好相反。实验过程中用胰岛素作为内标参照。根据质谱检测结果患者组8.9kD表达量为正常对照组的3倍。实验结果表明8.9kD和9.3kD蛋白可作为检测大肠癌的肿瘤标记物。Rosty等通过对胰腺分泌液的分析发现，67%(10/15)的胰腺癌患者和17%(1/7)的其它胰腺病患者出现16.57kD蛋白的高表达，免疫分析证实为肝癌-肠-胰腺/胰腺炎联合蛋白。该蛋白≥20mg/ml时，患者患胰腺癌的可能性增大。 4 存在的问题和发展前景 蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强有力的工具，相对于DNA芯片研究的进展速度，蛋白质芯片的研究进展显得相对滞后，主要有以下问题待解决:(1)寻找材料表面的修饰方法；(2)简化样品制备和标记操作；(3)增加信号检测的灵敏度，如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白质的检测；(4)高度集成化样品的制备及检测仪器的研制和开发。这些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度，同时也是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所在。 随着研究的不断深人和技术的更加完善，如表面化学修饰技术的进步，可以做到在载体上固定多种活性蛋白质；蛋白质工程可获得大量重组高特异性蛋白质用于芯片制作；纳米技术标记的引人可提高芯片检测的灵敏度。蛋白质芯片技术可以对成千上万的蛋白质的活性、功能、相互作用进行分析，并且使检测系统小型化，大大节约了样本和试剂的用量，缩短了检测时间，提高了敏感性，使成本效益比大大降低。蛋白质芯片技术作为一项有着广泛前途的新型技术，一旦投入实际应用，将在21世纪医学中的临床诊断、药物研究、环境检测、食
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简
《蛋白质工程》 （课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用 所在学院：生命科学与技术学院 专业（班级）：生技131班 学生姓名：梁健 授课教师：韩晓菲
蛋白质组学技术的研究进展及应用 生技131班梁健13772025 摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用 蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以 细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速 发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。 1 蛋白质组学的概念及研究内容 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚 的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理 或病理状态中，发生的相应的变化。 1.2 研究内容 根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质 组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学 研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白
液相蛋白芯片技术 液相蛋白芯片技术由美国纳斯达克上市公司Luminex研制开发并于2O 世纪9O年代中期发展起来，是在流式细胞技术、酶联免疫吸附试验(enzy me linked immunosorbent assay，ELISA)技术和传统芯片技术基础上开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台。液相蛋白芯片技术推动了功能基因组时代的蛋白质研究，相关的仪器、分析软件以及试剂盒研发备受瞩目并已形成一定的市场规模。现拟对该技术的基本原理、技术特点及其在免疫诊断和分析领域的研究和应用情况进行综合介绍。 一、液相蛋白芯片技术的基本原理 传统的蛋白芯片技术是将蛋白质分子有序地固定在滤膜、滴定板和载玻片等固相载体上，用标记了特定荧光抗体的蛋白质等生物分子与芯片作用，再利用荧光或激光扫描技术测定其荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质的相互作用，从而达到研究蛋白质功能或免疫诊断的目的。但固相载体难于维持蛋白质的天然构象，不利于蛋白质功能研究。 液相芯片技术在国际上被称之为xMAP(flexible MultilyteProfili ng)技术，其核心技术是乳胶微球包被、荧光编码以及液相分子杂交。液相芯片体系以聚苯乙烯微球 ( beads ) 为基质，微球悬浮于液相体系，每种微球可根据不同研究目的标定上特定抗体或受体探针，可对同一样品中多个不同的分子同时进行检测。微球表面可进行一系列修饰以适合固定各
种蛋白、多肽或核酸等生物分子。xMAP技术可应用于蛋白或核酸的功能及其相互作用研究，分别称之为液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术。 液相蛋白芯片体系主要包括微球、蛋白探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有独特的色彩编码，其原理是在微球中掺入不同比例的红色分类荧光及发色剂，可产生100种颜色差别的微球，可标记上100种探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。结合反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。 二、液相蛋白芯片技术的特点 液相蛋白芯片技术有机地整合了微球、激光检测技术、流体动力学、高速的数字信号处理系统和计算机运算功能，不仅检测速度极快，而且在免疫诊断以及蛋白质分子相互作用分析方面，其特异性和敏感性往往也超越常规技术。其技术特点可归纳如下。 1、反应快速，灵敏度高。反应环境为液相、微球上固定的探针与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ElISA等反应模式，可增加10倍以上，因此可提高反应速度及灵敏度。抗原---抗体